Procesontwikkeling voor de productie en zuivering van Adeno-geassocieerd virus (AAV)2 Vector met behulp van Baculovirus-Insect Cell Culture System

Dit protocol zal nuttig zijn voor de onderzoekers die methoden willen ontwikkelen voor AAV-productie en -zuivering met behulp van het baculovirus-insectencelkweeksysteem. AAV-productie met behulp van baculovirus-insectencelkweeksysteem is een kosteneffectieve methode die gemakkelijk op te schalen is en compatibel is met de huidige goede productiepraktijken. Sommige delen van het protocol zullen worden gedemonstreerd door Alan Heizer, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium.

Begin met het ontdooien van een flacon Sf9-cellen en zaai ze onmiddellijk in 15 milliliter insectencelkweekmedium. Kweek Sf9-cellen in een orbitale schudderincubator bij 125 RPM en 28 graden Celsius in kolven met ronde bodem met een losjes bevestigde dop voor luchtuitwisseling. Vermeerder de cellen in een kolf van één liter met 200 milliliter medium om voldoende cellen te verkrijgen voor tips-celproductie.

Voeg 50 milliliter Sf9-cellen met 2 maal 10 toe aan de 6e powercellen per milliliter in twee kolven. Infecteer een kolf sf9-cellen met 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP en de andere kolf met cellen met 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Oogst drie dagen later een klein aantal baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen, ook bekend als TIPS-cellen.

Kleur 2 maal 10 tot de 5e macht van zowel niet-geïnfecteerde als baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen met 0,5 microgram muisantidulovirus gp64-antilichaam met een fluorescerende kleurstof in 100 microliter blokkerende buffer gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur in het donker. Na het wassen van de cellen met PBS om het antilichaam te verwijderen, suspensies de gekleurde cellen opnieuw in 300 microliter PBS met 0,5 runderserumalbumine. Analyseer de baculovirus gp64-expressie op cellen met behulp van flowcytometrie.

Wanneer de cellen 80 tot 90% levensvatbaar zijn, met een toename in diameter, oogst de cellen en cryopreserve 1 maal 10 tot de 7e krachtcellen in één milliliter insectenkweekmedium, verdrongen door 10% foetaal runderserum en 10% dimethylsulfoxide in een langzaam vriescontainer bij negatieve 80 graden Celsius. Breng de volgende dag de buis met TIPS-cellen over naar een vriezer met vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Kweek en kweek naïeve Sf9-cellen met 2 keer 10 tot de 6e power cell per milliliter bij 28 graden Celsius in verschillende kolven van twee liter met 400 milliliter insectencelkweekmedium in een shaker-incubator die nodig is voor adeno-geassocieerd virus of AAV-productie.

Na drie tot vier dagen wordt de celdichtheid verhoogd tot maximaal 5 tot 6 keer 10 tot de 6e krachtcellen per milliliter. Gebruik voor AAV-productie in kolven in een orbitale schudderincubator een pipet of een peristaltische pomp om 400 milliliter Sf9-cultuur 2 maal 10 tot de 6e krachtcellen per milliliter aseptisch in een kolf van twee liter te zaaien. Stel de orbitale shaker in op 125 RPM en 28 graden Celsius.

Ontdooi één injectieflacon van elke baculovirus-AAV-GFP en baculovirus-AAV-rep-cap TIPS-cellen. Verdun de cellen met 20 milliliter insectenkweekmedium en voer een levensvatbaarheidstelling van de cellen uit met trypan blue. Ent beide TIPS-cellen in een verhouding van 1 tot 10.000 ten opzichte van de naïeve Sf9-cellen die in een shakerkolf of bioreactor zijn gekweekt.

Oogst op dag twee aseptisch een milliliter Sf9-cultuur en kleur met de trypanblauwe kleurstof om het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie te analyseren. Herhaal op dag drie de stappen die op dag twee zijn uitgevoerd en controleer de status van de baculovirusinfectie na het kleuren van de Sf9-cellen. Herhaal op dag vijf de stappen die op de tweede dag zijn uitgevoerd en oogst vervolgens het kweekmedium en de cellen wanneer de levensvatbaarheid van Sf9 is afgenomen tot ongeveer 50%Verzamel het supernatant en de celkorrel na het draaien en bewaar ze bij negatieve 80 graden Celsius.

Zodra de AAV-producent celkorrel is ontdooid, voegt u er cellysisbuffer aan toe en mengt u krachtig. Incubeer de opnieuw gesuspendeerde pellet gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur om de AAV-deeltjes vrij te geven. Breng na centrifugeren het cellysaat over naar een nieuwe container.

Meng het cellysaat en celkweek supernatant na het ontdooien. Voeg 20 eenheden per milliliter nuclease en 10-millimolair magnesiumchloride toe aan het cellysaat om het DNA en RNA te verteren en incubaleer gedurende twee tot vier uur bij 37 graden Celsius. Filter het lysaat door een 0,8 micrometer en 0,2 micrometer polyethersulfon dubbelfiltratiesysteem met behulp van een pomp.

Bewaar het geklaarde cellysaat 's nachts bij vier graden Celsius of zuiver de AAV onmiddellijk. Monteer een AVB Sepharose-kolom van 10 milliliter op de chromatografiemachine en plaats de pijplijn in het AAV-monster, de wasbuffer en de elutiebuffer. Steek buizen in de fractiecollectorsleuven van de chromatografiemachine om de fracties van de kolomdoorvoeroplossing, wasbuffer en elutiebuffer met de AAV-deeltjes te verzamelen.

Breng de AVB Sepharose-kolom in evenwicht met vijf kolomvolumes PBS met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut. Laad de gefilterde cellysaat met AAV-deeltjes op de AVB Sepharose-affiniteitskolom met behulp van de chromatografiemachine die is uitgerust met een monsterpomp. Voer het monster uit met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut.

Voer PBS door de kolom met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut totdat de ultraviolette absorptiecurve op 280 nanometer terugkeert naar de basislijn en stabiel wordt. Eluteer de AAV-deeltjes uit de AVB Sepharose-kolom met 50-millimolaire natriumcitraatbuffer pH 3 bij een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut. Verdun het AAV-supernatant onmiddellijk met een volume van een vijfde van 500 millimolaire Tris HCl pH 8,0 om de zure elutiebuffer met AAV te neutraliseren.

Dit voorkomt de pH-gemedieerde afbraak die zou kunnen optreden bij zure pH 3.0 elutiebuffer. Verdun vervolgens het AAV-supernatant tienvoudig met PBS, zodat AAV-deeltjes zich in een fysiologische buffer bevinden. Bewaar één milliliter van elke kolomdoorloopmonsters, wasbuffer en 100 microliter van het geëlueerde AAV-supernatant om de aanwezigheid van AAV door infectie van de doelcellen te evalueren.

Stel het tangentiële stromingsfiltratiesysteem in, uitgerust met een polyethersulfonmembraanpatroon met een afsnijding van 100 kilodalton om de AAV te concentreren. Laat 200 milliliter PBS gedurende 10 minuten draaien om de tangentiële stromingsfiltratiemodule in evenwicht te brengen. Belast het AAV-monster door het debiet van de pomp te regelen totdat het monster is teruggebracht tot het gewenste volume.

Diafiltreer het retentaat met 100 milliliter PBS. Nadat u het AAV-monster tot het gewenste volume hebt geconcentreerd, verzamelt u het AAV-monster, filtert u het door een polyethersulfonfilter van 0,2 micrometer en neemt u het aliquot. Bewaar het AAV-monster vervolgens bij negatieve 80 graden Celsius.

De meeste Sf9-cellen raakten binnen drie tot vier dagen geïnfecteerd met het baculovirus, als gevolg van de meerdere infectierondes, aangetoond door baculovirus glycoproteïne gp64-expressie. De meeste cellen vertonen ook een toename in diameter. De cellen vertonen een toename in diameter, cytopathisch effect en ongeveer de helft van de cellen sterft in vijf dagen na infectie, wat de tekenen zijn van voltooiing van de AAV-productie.

Een piek van eiwit werd gezien tijdens de elutie met een zure buffer die overeenkomt met de AAV-fractie. De gezuiverde AAV-monsters tonen drie verschillende capsid-eiwitten: VP1, VP2 en VP3, na SDS-PAGE en zilverkleuring. De meest kritieke stap is het oogsten van de TIPS-cellen vóór cryopreservatie, wanneer de meeste cellen geïnfecteerd raken met het baculovirus, met een minimum aantal celdood.

We hebben de productie en zuivering van AAV-vector van serotype 2 hier als model beschreven. Het protocol kan echter ook voor andere AAV-serotypen worden toegepast.