Analyse van celdifferentiatie, morfogenese en patronen tijdens kippenembrogenese met behulp van de soaked-bead assay

Deze test stelt de student in staat om specifieke moleculen te bekijken in veel ontwikkelingsproces, zoals celdifferentiatie en morfogenese door de kralen in verschillende embryogebieden te implanteren. Dit protocol kan worden toegepast op alle experimentele diermodellen, celkweek, organotypisch model, inclusief organoïden. Bovendien is het een nuttig educatief hulpmiddel voor het onderwijzen van elementaire ontwikkelingsbiologie aan studenten.

De procedure wordt gedemonstreerd door Alexandra Gonzales-Gonzales, een studente van het laboratorium. Incubeer om te beginnen de bevruchte witte Leghorn-kippeneieren verticaal met de puntige kant naar beneden in een bevochtigde incubator bij 38 graden Celsius en 70% relatieve vochtigheid. Zodra ze de 28e fase bereiken, volgens Hamburger en Hamilton, verwijder je de eieren uit de broedmachine, verwissel je ze met 70% ethanol en laat je ze aan de lucht drogen.

Desinfecteer vervolgens het werkgebied, microscopen en instrumenten met 70% ethanol. Vervolgens kaars de eieren om bloedvaten te identificeren en het embryo te lokaliseren. Gooi eieren weg die geen embryo hebben.

Gebruik het uiteinde van een niet-getande tang, open een raam door op het stompe uiteinde van een ei te tikken en verwijder een schaalgedeelte van één vierkante centimeter. Breng het ei vervolgens over in een doos of plastic houder en plaats het onder de stereomicroscoop. Verwijder met behulp van een fijne chirurgische tang elk klein stukje eierschaal dat in contact kan komen met het embryo en verwijder het luchtmembraan door het aan te prikken en eruit te trekken.

Scheur vervolgens met behulp van een fijne chirurgische tang de vruchtwaterzak enigszins, waarbij u voorzichtig bent om de vasculatuur van het Chorioallantoic-membraan niet te beschadigen. Voer de embryo's in-ovo in om te bepalen of ze zich in het gewenste stadium bevinden. Voor Affi-gel heparine kraalbereiding, snijd een vierkante parafilm sectie om in een 45 millimeter petrischaal te passen.

Nadat u de parafilm over de bodem van de petrischaal hebt geplaatst, met behulp van het uiteinde van een niet-getande tang, duwt u op elk hoekpunt en bevestigt u deze aan de onderkant van de schaal. Breng vervolgens met behulp van een pipet of spatel de kralen over in een microcentrifugebuis en was ze twee keer met PBS door ze te laten bezinken en pipetteren van het supernatant. Breng vervolgens met behulp van een micropipet 40 tot 50 kralen over naar het midden van de met parafilm bedekte petrischaal.

Selecteer onder een microscoop 30 Affi-gel- of heparinepareljes met een diameter van 100 micrometer. Dimensioneer de kralen met behulp van een derde interdigit van een embryo met 28 stadia als referentie. De kraal moet kleiner zijn dan de interdigit.

Na het zorgvuldig verwijderen van het overtollige PBS rond de geselecteerde kralen, weekt u ze in twee tot vijf microliter van de behandelingsoplossing. Incubeer de kralen in de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer tijdens de incubatie, om te voorkomen dat de kralen uitdrogen, een paar druppels PBS of water rond de kralen om de lokale atmosfeer te bevochtigen en de schaal te bedekken met parafilm om de verdamping te vertragen.

Giet AG1X2 kraalbereiding. Gebruik de spatel om de kralen over te brengen in een microcentrifugebuis en voeg 50 microliter van de behandelingsoplossing toe in de gewenste eindconcentratie. Nadat je de buizen met folie hebt ingepakt om ze tegen licht te beschermen, incubeer je de kralen gedurende 20 minuten bij langzaam schudden.

Verwijder na incubatie met behulp van een pipet zoveel mogelijk van de behandelingsoplossing in vlek met 0,2% fenolrood opgelost in water gedurende twee minuten met milde agitatie in een vortex. Verwijder na het vlekken de kleurstof en was de kralen vervolgens twee keer in PBS om eventuele resterende kleurstof te verwijderen. Breng vervolgens met behulp van een micropipetpunt 40 tot 50 AG1X2-kralen over naar het midden van de met paraform bedekte petrischaal en week de kralen in vijf microliter PBS.

Selecteer vervolgens onder een microscoop ongeveer 30 kralen van 100 micrometer diameter in grootte. Dompel de geselecteerde kralen onder in de experimentele oplossing met een paar druppels PBS of water rond de kralen om de lokale atmosfeer te bevochtigen. Bedek de schaal met parafilm om de verdamping te vertragen.

Voordat u de embryo's manipuleert, plaatst u twee stereomicroscopen naast elkaar op een bankje. Maak vervolgens met behulp van een niet-getande tang een venster in de resterende eieren. Scheur vervolgens onder de microscoop het vruchtwatermembraan in de buurt van de rechter achterpoot met een fijne chirurgische tang.

Houd met behulp van een fijne tang het embryo bij het vruchtwatermembraan om de rechter achterpoot bloot te leggen. Maak vervolgens met behulp van een fijne wolfraamnaald een gat gecentreerd in het distalmost van de derde interdigit van de achterpoot. Zonder het embryo en de blootgestelde achterpoot los te laten, neemt u een behandelde kraal uit de andere microscoop met behulp van een van de uiteinden van de tang.

De tang moet open zijn voor één kraal om zich aan de punt te hechten. Breng de kraal over in het kuikenembryo in de buurt van de achterpoot en plaats deze bovenop het interdigit-gat. oefen druk uit op de kraal door de tang te sluiten totdat deze in het gat komt.

Laat vervolgens het embryo los, sluit het eierschaalvenster af met tape en breng de eieren terug naar de broedmachine totdat ze het vereiste stadium hebben bereikt. Om de werkzaamheid van de test te garanderen, moet de kraal consistent en precies op de juiste plaats worden geplaatst. In deze studie werd de geweekte kraal in het distale deel van de derde interdigit onder de apicale ectodermale richel geplaatst.

De embryo's kunnen worden gekleurd met oceaanblauw en alizarinerood om de vorming van skeletelementen aan te tonen en de effecten op celdifferentiatie te evalueren. Deze test is ook zeer geschikt voor het evalueren van celdood met neutrale rode en genregulatie, waarbij C2-hybridisatie wordt gekocht. Het belangrijkste voordeel van deze experimentele tool is om de tijd en locatie van de geweekte kralen te regelen.

Het combineren van de kernpositionering met nauwkeurige ontwikkelingstiming biedt enorme mogelijkheden om celdifferentiatieprocessen te bestuderen.