Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Deze methode zal een beter inzicht geven in de functie van parenchymaal arteriolar endotheel dat de intracerebrale bloedtoevoer direct koppelt aan het voeden van neuronale en gliale activiteit in de hersenen. Een duidelijk technisch voordeel ten opzichte van arteriole endotheel is de verbeterde resolutie van morfologische dimensies en calcium- en elektrische signalering tussen individuele intracerebrale endotheelcellen en hun respectieve organellen. In eerste instantie zal isolatie en onderzoek van intracerebraal endotheel zeer uitdagend zijn.

Het is echter mogelijk om deze techniek onder de knie te krijgen met veel oefening vergezeld van geduld en toewijding. Was de geïsoleerde hersenen met een koude dissectie-oplossing in een beker of petrischaal om het resterende bloed van het oppervlak van de hersenen te verwijderen. Plaats de ventrale hersenzijde naar boven gericht in een kamer met koude dissectie-oplossing om parenchymale arteriolen te isoleren.

Om parenchymale arteriolen te isoleren, beveiligt u de geïsoleerde hersenen met stalen pinnen in koude dissectie-oplossing in een petrischaal met meer dan 50 centimeter diepe met houtskool doordrenkte siliciumpolymeercoating. Knip een rechthoek van hersenweefsel van beide hemisferen met een scherpe en uitgelijnde dissectieschaar rond de MCA en zorg ervoor dat het bovenste deel van het weefselsegment voorbij het vertakkingspunt van de cirkel van Willis is. Zet het hersenweefsel vast in de schaal met de MCA naar boven gericht met stalen pinnen.

Maak voorzichtig een ondiepe incisie in de buurt van de pinnen en verwijder de pia met een kleine tang, waarbij je voorzichtig van het ene uiteinde naar het andere afbladdert. Zet de geïsoleerde pia met parenchymale arteriolen vertakt van MCA in de schaal met de spelden zorgvuldig vast en ontleed de parenchymale arteriolen zorgvuldig. Knip alle resterende distale takken af en zorg ervoor dat de arteriole schoon is zonder weefsel.

Gebruik deze schone intacte arteriole voor enzymatische spijsvertering. U kunt ook elke arteriole in twee stukken snijden voor enzymatische spijsvertering om endotheelbuizen te bereiden, indien gewenst. Voor gedeeltelijke vertering van arteriolar segmenten, plaats intacte arteriolar segmenten in een milliliter dissociatie-oplossing in een glazen buis van 10 milliliter die papaïne, dithioerythritol, collagenase en elastase bevat.

Incubeer arteriolar segmenten bij 34 graden Celsius gedurende 10 tot 12 minuten. Om de arteriolar endotheelbuis te isoleren, plaatst u de trituratiepipet die met de microspuitinjector is bevestigd in de dissociatieoplossing in de kamer en plaatst u deze dicht bij het ene uiteinde van het verteerde vatsegment. Stel een snelheid in binnen het bereik van één tot drie nanoliter per seconde op de pompregelaar voor zachte trituratie.

Met behoud van 100X tot 200X vergroting, trek het arteriolar segment in de pipet en injecteer vervolgens om de adventitia en gladde spiercellen te dissociëren. Triturateer het vaatsegment totdat alle gladde spiercellen zijn gedissocieerd en alleen endotheelcellen overblijven als een intacte buis. Bevestig met micromanipulatoren elk uiteinde van de endotheelbuis op de glazen afdekkingslip in de kamer met borosilicaatglas pinnen pipetten Om de endotheelmembraanpotentiaal te meten, terwijl u door het 4X-objectief kijkt, plaatst u de scherpe elektrodepunt zorgvuldig net over een cel van de arteriolar endotheelbuis in de stromende fysiologische zoutoplossing met een micromanipulator.

Verhoog de vergroting geleidelijk tot 400X en verplaats de elektrodepunt indien nodig. Breng met behulp van de micromanipulator voorzichtig de punt van een scherpe elektrode in een van de cellen van de endotheelbuis en begin met het opnemen van VM met behulp van een elektrometer. Zodra de endotheliale rustende VM stabiel is van min 30 tot minus 40 millivolt, past u de gewenste farmacologische middelen per experimenteel doel toe.

Laad de endotheelbuis met de fluorescentietracker voor het plasmamembraan of het gewenste organel bij 37 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten. Was de cellen met verse superfusie fysiologische zoutoplossing en beeld levende cellen onder de microscoop op de excitatiegolflengte van de respectieve kleurstoffen. De endotheelfunctie werd beoordeeld door intracellulair calcium- en membraanpotentiaal te meten als reactie op een farmacologisch middel MTA, een krachtige purinerge receptoragonist bij 37 graden Celsius.

Bij toepassing van één micromolaire MTA neemt de intracellulaire calciumconcentratie snel toe met een gelijktijdige hyperpolarisatie. Bovendien werd het intacte endotheel geïncubeerd bij 37 graden Celsius met fluorescerende trackers voor visualisatie om cellulaire morfologie te onderzoeken. Live endotheelcelbeeldvorming toonde co-kleuring voor plasmamembraan en kernen.

Het plasmamembraan werd samen met een endoplasmatisch reticulum fluorescerende vlek gekleurd waarbij gebieden met schijnbare overlap van ER binnen de nabijheid van het plasmamembraan oranje lijken. De experimentator moet voorzichtig zijn tijdens dissectie en isolatie om schade aan de arteriolen te voorkomen, omdat een beschadigde arteriole zeker geen intacte endotheelbuis zal opleveren. Na de procedure kunnen de cellen worden gebruikt voor vaste immunohistochemie met fluorescerende antilichamen of levende celkleuring van organellen en membraanlipiden.

Deze techniek zal nieuwe informatie genereren voor het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de cerebrale bloedstroom op het fundamentele niveau voor fysiologie en geselecteerde overgangen naar pathologie voor therapie.