Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Sterk gemultiplexte vibrationele beeldvorming biedt een one-shot optische benadering om meerdere eiwitmarkers in weefsels met subcellulaire resolutie te ondervragen. Dit platform geeft een uitgebreid beeld van eiwitinteracties van biologische systemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de cyclusvrije multiplexiteit.

Deze techniek is met name geschikt voor toepassingen waar fietsstrategieën niet goed functioneren, zoals in dikke weefselsecties. Deze methode maakt individuele celkarakterisering in situ mogelijk voor het begrijpen van structuren van het complexe systeem, zoals het bouwen van weefselatlas, fenotyperende tumormicro-omgevingen en het profileringshersencircuit. Bereid om te beginnen ongeveer 0,1 molair natriumbicarbonaat in PBS-buffer bij PHA 0.3 voor als conjugatiebuffer en bewaar het bij vier graden Celsius.

Bereid vervolgens drie millimolaire n-hydroxysuccinimide ester gefunctioneerde MARS-sondeoplossing in watervrij dimethylsulfoxide. Los de antilichaambestanddelen in de conjugatiebuffer op tot een concentratie van twee milligram per milliliter. Voor antilichamen opgelost in andere buffers, concentreer ze in een centrifugaalfilter en voeg ze vervolgens toe aan de conjugatiebuffer tot een concentratie van één tot twee milligram per milliliter.

Om de conjugatiereactie voor secundaire antilichamen uit te voeren, voegt u 15-voudig molair overschot aan kleurstofoplossing toe aan de antilichaamoplossing in een glazen injectieflacon langzaam met roeren en incubeert u het reactiemengsel bij kamertemperatuur met roeren gedurende één uur. Om de zuivering uit te voeren, bereidt u de slurry voor door 10 milliliter gelfiltratieharspoeder toe te voegen aan 40 milliliter PBS-buffer in een buis van 50 milliliter. Bewaar de oplossing een uur in een waterbad op 90 graden Celsius.

Decanteer vervolgens het supernatant, voeg de PBS toe tot 40 milliliter en bewaar de drijfmest bij vier graden Celsius. Verpak de maatuitsluitingskolom met de slurry-oplossing tot een hoogte van 10 tot 15 centimeter, spoel en was de kolom vervolgens met ongeveer 10 milliliter PBS om de hars verder te verpakken. Pipetteer vervolgens het conjugatiereactiemengsel naar de kolom.

Voeg na het laden van het reactiemengsel onmiddellijk één milliliter PBS toe als elutiebuffer. Verzamel daarna het eluent van de geconjugeerde oplossing door naar de kleur op de kolom te kijken of door de absorptie te meten bij 280 nanometer. Gebruik het centrifugaalfilter om de verzamelde oplossing te concentreren tot één tot twee milligram per milliliter.

Teken met behulp van een hydrofobe pen een grens rond de weefselsecties op de dia. Incubeer vervolgens de weefsels met 0,3 tot 0,5% PBST gedurende 10 minuten en een blokkerende buffer gedurende 30 minuten. Om de primaire kleuringsoplossing te bereiden, voegt u alle primaire antilichamen toe aan 200 tot 500 microliter kleuringsbuffer in de gewenste concentraties.

Centrifugeer de primaire kleuringsoplossing op 13.000 maal G gedurende vijf minuten en gebruik het supernatant als er neerslag verschijnt. Incubeer vervolgens het weefsel in de primaire antilichaamoplossing bij vier graden Celsius gedurende één tot twee dagen. Was de dia's driemaal met 0,3 tot 0,5% PBST gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een stapot en zorg ervoor dat de weefsels in de oplossing zijn ondergedompeld.

Incubeer later het weefsel in 200 tot 500 microliter blokkerende buffer gedurende 30 minuten. Om de secundaire kleuringsoplossing te bereiden, voegt u alle secundaire antilichamen toe aan 200 tot 500 milliliter kleuringsbuffer met de gewenste concentraties. Centrifugeer vervolgens de secundaire kleuringsoplossing op 13.000 keer G gedurende vijf minuten en gebruik het supernatant als neerslaand neerslag verschijnt.

Incubeer vervolgens de weefsels in 200 tot 500 microliter secundaire antilichaamoplossing bij vier graden Celsius gedurende één tot twee dagen. Was de glaasjes vervolgens tweemaal met 0,3 tot 0,5% PBST bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Incubateer verder met 200 tot 500 microliter DAPI-oplossing gedurende 30 minuten.

Nogmaals, was de dia's driemaal met PBS op kamertemperatuur gedurende vijf minuten elk en breng de zwevende weefselsecties over op de glazen dia's met de glazen druppelpipet. Verspreid het weefsel met een tissueborstel en reinig de omgeving indien nodig met doekjes. Monteer het weefsel vervolgens in een druppel anti-fade reagentia met een glazen dekplaat en zet het vast met nagellak.

Om meerkanaals-eprSRS-beeldvorming uit te voeren, stelt u het laservermogen van de pompstraal in op 10 tot 40 milliwatt en de stokesstraal op 40 tot 80 milliwatt op het laserbedieningspaneel. Stel vervolgens de pixelverblijftijd in op twee tot vier microseconden en gebruik meerdere frames met een gemiddelde van gemiddeld 10 tot 20 frames op de microscopiesoftware. Stel verder de tijdconstanten van de lock-in versterker in op de helft van de pixelverblijftijd.

Raman dye imaging van verschillende eiwitmarkers en HeLa-cellen paraformaldehyde-gefixeerde muis hersenschors en vochtig nier FFPE-weefsel werden uitgevoerd door middel van immuno-etikettering. De immuno-eprSRS beeldvorming van HeLa cellen met een alfa-tubuline onthulde fijne subcellulaire structuren zoals microtubuli. De eprSRS-beeldvorming van MARS 2145 gekleurde astrocyten en MARS 2228 gekleurde cerebellaire korrelneuronen in hersenweefsel van muizen toonde driedimensionale patronen met subcellulaire resolutie.

De zevenkleurige SRS-fluorescentietandembeeldvorming van hormonen en transcriptiefactoren op bevroren muiseilandweefsel werd uitgevoerd. De verkregen beelden toonden een goed contrast en correcte patronen. De achtkleurige SRS-fluorescentietandembeeldvorming van celtypemarkers op paraformaldehyde-gefixeerde cerebellumweefsels van muizen werd uitgevoerd.

Verschillende soorten cellen werden geïdentificeerd, zoals cerebellaire korrelneuronen, Purkinje-neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en GABAerge neuronen. Deze procedure kan verder worden gecombineerd met weefselverwijdering om zeer gemultiplexte eiwitbeeldvorming uit te voeren in dikke intacte weefsels. Onze groep heeft er een Raman-dye-tailored tissue clearing protocol voor ontwikkeld.