Celtypespecifieke eiwitzuivering en identificatie van complexe weefsels met behulp van een mutante methionine-tRNA-synthetasemuislijn

Dit protocol maakt het mogelijk om eiwitten op een celtype specifieke manier te labelen. Dit is de eerste techniek die een dergelijke mogelijkheid biedt en het kan in vitro of in vivo worden gedaan. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de gelabelde celtypespecifieke eiwitten ongeïdentificeerd kunnen worden gezuiverd of in situ kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentie.

Om te beginnen met het voorbereiden van het weefsel lysaat door het toevoegen van lysis buffer op een volume van 12 tot 15 keer het natte gewicht van het weefsel en triturate het weefsel totdat het is gehomogeniseerd. Verwarm dit homogenaat gedurende 15 minuten tot 75 graden Celsius om het eiwit te denatureren, centrifugeer vervolgens het monster en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Dit monster kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius.

Verdun vervolgens voor alkylering het gehomogeniseerde monster twee tot drie keer in fosfaatzoutbuffer met een EDTA-vrije proteaseremmer. Voeg vervolgens vers bereid jodoacetamide toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 millimol. Laat het monster één tot twee uur bij 20 graden Celsius in het donker staan.

Herhaal de iodoacetamide-toevoegings- en incubatiestappen tweemaal. Bereid de kolom voor volgens de instructies van de fabrikant door eerst de kolommen te vortexen. Verwijder vervolgens het deksel dat het onderste deel snijdt en centrifugeert.

Voer vervolgens een bufferuitwisseling uit door eerst de bufferuitwisselingskolommen in evenwicht te brengen met behulp van de click chemistry exchange buffer en vervolgens alle gealkyleerde monsters uit te wisselen. Om de azidonorleucine-opname te evalueren, neemt u 40 microliter van het alluded monster en voegt u fosfaatzoutbuffer toe aan een eindvolume van 120 microliter. Stel vervolgens de klikchemiereactie in door de reactie gedurende 20 seconden te vortexen.

Nadat u elk reagens zo snel mogelijk in de aangegeven volgorde hebt toegevoegd, incubeert u de monsters in het donker bij vier graden Celsius 's nachts met continue rotatie. De volgende dag centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 17.000 keer G na centrifugatie zal een licht turquoise pellet zichtbaar zijn. Breng het supernatant over in een nieuwe buis en bewaar het monster bij min 80 graden Celsius.

Voor gelabelde eiwitzuivering. Onderwerp alle monsters aan een bufferuitwisselingsprocedure zoals aangetoond om restjes vrij alkyn te reinigen met behulp van neutravidinebindingsbuffer als evenwichtsbuffer. Was vervolgens de neutravidine kralen met hoge capaciteit drie keer door de kralen te mengen met de bindingsbuffer.

Centrifugeer het mengsel, gooi het supernatant weg en herhaal dit drie keer. Bereid vervolgens een één-op-één slurry voor door hetzelfde volume neutravidine droge kralen en neutravidinebindingsbuffer toe te voegen. Zet 20 tot 40 microliter van elk monster opzij als voorgezuiverd lysaat en bewaar het bij min 20 graden Celsius.

Meng na het meten van de eiwitconcentratie van het monster één milligram eiwit met 40 microliter van de kralen slurry. Incubeer het mengsel een nacht op vier graden Celsius met continue rotatie waardoor de gelabelde eiwitten zich aan de kralen kunnen binden. Verzamel de volgende dag het supernatant door centrifugatie.

Zet een aliquot van 20 tot 40 microliter van het supernatant opzij voor latere analyse en vries de rest in op min 80 graden Celsius. Was vervolgens de kralen drie keer door gekoelde neutravidinewasbuffer één toe te voegen. Sedimenteren van de kralen en weggooien van het supernatant.

Voeg vervolgens dezelfde buffer toe en incubeer de kralen gedurende 10 minuten onder continue rotatie bij vier graden Celsius voordat u het supernatant weggooit. Herhaal de was met neutravidinewasbuffers twee en drie en eluuteer de geklikte eiwitten door de kralen gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius te incuberen met een volume neutravidine-elutiebuffer, overeenkomend met één volume van de gebruikte droge kralen. Houd tijdens de elutie de kralen in suspensie op 1000 omwentelingen per minuut in een thermoblokschudder twee keer en combineer beide eluuten.

Klikreacties werden geanalyseerd door SDS-pagina en Western immuno blot. Representatieve beelden van de experimenten worden getoond voor toediening van azidonorleucine via intraperitoneale injectie en voor toediening van azidonorleucine via drinkwater. Een ander experiment biedt een voorbeeld voor de bepaling van de optimale disulfide biotine splijtbare alkynconcentratie.

In dit voorbeeld is de vouwverandering tussen het gelabelde monster en de controle het hoogst bij een alkynconcentratie van 14 micromolelars. Een voorbeeld van een massaspectrometrieresultaat met een duidelijke verrijking in het azidonorleucine-gelabelde monster in vergelijking met de controle wordt hier weergegeven. Dit verschil was al zichtbaar in de totale eiwitvlek.

Naast veranderingen in peptide-intensiteit zijn er ook unieke eiwitten gevonden in beide monsters. Dit is een technisch complex protocol en het is een stap die zorgvuldig moet worden gevolgd met behulp van de juiste negatieve controles alkylering, de juiste (onduidelijke) en adequate reiniging van het non-click archief. Onze belangrijkste stappen in dit protocol, gezuiverde eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door massaspectrometrie als de onderzoekers geïnteresseerd zijn in het bestuderen van eiwitten of het laden in een gel voor het bestuderen van eiwitten van belang door western blot.

Het vermogen van deze methode om eiwitten van een specifieke cellulaire oorsprong te labelen, heeft veel toepassingen, zoals de spanning van eiwitten of de studie van eiwitsynthese in vitro of in vivo.