Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Ons protocol bood een haalbare methode om de synchronisatiesectie te observeren met behulp van een confocale microscoop, die precisie kon garanderen bij de observatie van de zenuwvezels. Eenvoudig en gemakkelijk weefselreinigingsprotocol is een belangrijk voordeel van deze techniek. Het weefselreinigingsproces is efficiënt en duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.

Voer perfusie uit op de geëuthanaseerde rat zoals vermeld in het tekstmanuscript. Gebruik een scalpel om de huid van de dorsum en de zool van de achterpoot te verwijderen. Voor monsters die een bevroren sectie vereisen, fixeert u de weefsels in 4% van aldehyde in 0,1 molaire PB gedurende twee uur.

Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 graden Celsius en plaats ze in de ijskast voor koeling. Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoon met ijswater en snijd ze op een dikte van 500 micrometer in de transversale richting. Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zes putplaat met 1x PBS.

Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% triton X-100 in 1x PBS 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rotaties per minuut op de shaker 's nachts bij vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP-anti-CGRP-antilichaam bij schapen en polyklonaal anti-LYVE-1-antilichaam bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis.

Draai vervolgens twee dagen op de shaker bij vier graden Celsius. Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij vier graden Celsius in de wasbuffer. Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen in een microcentrifugebuis en roteer met 72 rotaties per minuut op de shaker gedurende vijf uur bij vier graden Celsius.

Was de weefseldelen in een zes putjesplaat met wasbuffer twee keer gedurende een uur op kamertemperatuur. Bewaar de weefselsecties in wasbuffer op de shaker 's nachts op vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens en draai met 60 rotaties per minuut voorzichtig op de shaker gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Monteer de heldere weefsels op de dia en omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en afdekslip. Het 3D-patroon toonde aan dat de CGRP-positieve zenuwvezels door het onderhuidse weefsel en de dermis naar de opperhuid gingen. Deze zenuwvezels liepen in bundels in het onderhuidse weefsel vertakt in de dermis en eindigden in de opperhuid.

Daarentegen worden falloïdine in positieve bloedvaten en LYVE-1 positieve lymfevaten verdeeld in het onderhuidse weefsel en de dermis. Over het algemeen liepen de CGRP-positieve zenuwvezels parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten en vormden een 3D-netwerk in de harige en glazige huid. Met de conventionele aanpak, hoewel de zenuwvezels bloedvaten en lymfevaten duidelijk werden gelabeld met CGRP-falloïdine en LYVE-1 in de dunne secties, werd de observatie van deze structuren beperkt door de plakdikte en kan deze niet volledig worden waargenomen.

In het gedeelte met een dikte van 30 micrometer was er geen verschil tussen de behaarde huid en de glazige huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. In de 300 micrometer dikke weefselsecties, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid aanzienlijk toegenomen. Het is belangrijk om de reinigingsbuffer met hoge osmotische druk te gebruiken na incubatie van antilichamen.

Meerdere keren is de reinigingstijd die nodig is voor de immunofluorescentiekleuring noodzakelijk. Na deze procedure geloven we dat er een mogelijkheid is van kleuring en observatie van andere weefsels en organen in zes secties. Deze techniek kan neurowetenschappelijke onderzoekers helpen om het oppervlak en de toestand van neurovezels tegen te komen.

Het helpt ons ook om de innovatie van weefsels en organen te observeren.