Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen
May 20th, 2022
De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.
Ons protocol bood een haalbare methode om de synchronisatiesectie te observeren met behulp van een confocale microscoop, die precisie kon garanderen bij de observatie van de zenuwvezels. Eenvoudig en gemakkelijk weefselreinigingsprotocol is een belangrijk voordeel van deze techniek. Het weefselreinigingsproces is efficiënt en duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.
Voer perfusie uit op de geëuthanaseerde rat zoals vermeld in het tekstmanuscript. Gebruik een scalpel om de huid van de dorsum en de zool van de achterpoot te verwijderen. Voor monsters die een bevroren sectie vereisen, fixeert u de weefsels in 4% van aldehyde in 0,1 molaire PB gedurende twee uur.
Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 graden Celsius en plaats ze in de ijskast voor koeling. Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoon met ijswater en snijd ze op een dikte van 500 micrometer in de transversale richting. Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zes putplaat met 1x PBS.
Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% triton X-100 in 1x PBS 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rotaties per minuut op de shaker 's nachts bij vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP-anti-CGRP-antilichaam bij schapen en polyklonaal anti-LYVE-1-antilichaam bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis.
Draai vervolgens twee dagen op de shaker bij vier graden Celsius. Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij vier graden Celsius in de wasbuffer. Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen in een microcentrifugebuis en roteer met 72 rotaties per minuut op de shaker gedurende vijf uur bij vier graden Celsius.
Was de weefseldelen in een zes putjesplaat met wasbuffer twee keer gedurende een uur op kamertemperatuur. Bewaar de weefselsecties in wasbuffer op de shaker 's nachts op vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens en draai met 60 rotaties per minuut voorzichtig op de shaker gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Monteer de heldere weefsels op de dia en omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en afdekslip. Het 3D-patroon toonde aan dat de CGRP-positieve zenuwvezels door het onderhuidse weefsel en de dermis naar de opperhuid gingen. Deze zenuwvezels liepen in bundels in het onderhuidse weefsel vertakt in de dermis en eindigden in de opperhuid.
Daarentegen worden falloïdine in positieve bloedvaten en LYVE-1 positieve lymfevaten verdeeld in het onderhuidse weefsel en de dermis. Over het algemeen liepen de CGRP-positieve zenuwvezels parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten en vormden een 3D-netwerk in de harige en glazige huid. Met de conventionele aanpak, hoewel de zenuwvezels bloedvaten en lymfevaten duidelijk werden gelabeld met CGRP-falloïdine en LYVE-1 in de dunne secties, werd de observatie van deze structuren beperkt door de plakdikte en kan deze niet volledig worden waargenomen.
In het gedeelte met een dikte van 30 micrometer was er geen verschil tussen de behaarde huid en de glazige huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. In de 300 micrometer dikke weefselsecties, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid aanzienlijk toegenomen. Het is belangrijk om de reinigingsbuffer met hoge osmotische druk te gebruiken na incubatie van antilichamen.
Meerdere keren is de reinigingstijd die nodig is voor de immunofluorescentiekleuring noodzakelijk. Na deze procedure geloven we dat er een mogelijkheid is van kleuring en observatie van andere weefsels en organen in zes secties. Deze techniek kan neurowetenschappelijke onderzoekers helpen om het oppervlak en de toestand van neurovezels tegen te komen.
Het helpt ons ook om de innovatie van weefsels en organen te observeren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe weefselhelderheidstechniek voor de visualisatie van cutane zenuwvezels in dikke 300 µm weefselsecties met behulp van confocale microscopie. De methode verbetert de morfologische studie van huidinnervatie en lost de beperkingen op van conventionele dunne secties.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Weefselafbeelding
- Confocale microscopie
Achtergrond
- Het bestuderen van huidinnervatie is cruciaal voor het begrijpen van sensorische paden.
- Traditionele methoden zijn beperkt door de dunheid van weefselsecties.
- Het visualiseren van zenuwvezels in dikkere secties kan diepere inzichten bieden.
- De methode heeft tot doel de beeldvormingsprecisie en -efficiëntie te verbeteren.
Doel van de studie
- Een weefselhelderheidstechniek ontwikkelen en valideren voor dikke huidsecties.
- Het waarnemen van zenuwvezels en hun relatie met bloed- en lymfevatjes vergemakkelijken.
- Een methode bieden die kan worden aangepast voor het bestuderen van andere weefsels en organen.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie werd gebruikt om zenuwvezels in opgeruimde weefselsecties te visualiseren.
- Het biologische model omvatte geëuthanaseerden ratten, specifiek het observeren van huid van de rug en achterpoot.
- Belangrijke stappen omvatten weefselperfusie, inbedding, antilichaamkleuring en weefselhelderheid.
- Het hele reinigings- en beeldvormingsprotocol duurt doorgaans 30 minuten tot een uur.
Belangrijkste resultaten
- De helderheidstechniek onthulde met succes CGRP-positieve zenuwvezels die een 3D-netwerk binnen de huid vormen.
- Resultaten gaven aan dat er significante verschillen zijn in de verdeling van zenuwvezels tussen behaarde en onbehaarde huid.
- De methode maakte een gedetailleerde observatie mogelijk van structurele relaties met bloed- en lymfevatjes.
- CGRP-positieve vezels bleken parallel te lopen of bloed- en lymfevatjes te omringen.
Conclusies
- Deze techniek verbetert het vermogen om huidinnervatie uitgebreid te visualiseren en te bestuderen.
- De verbeterde visualisatie kan waardevolle inzichten leveren in neurobiologische mechanismen.
- Mogelijke toepassingen breiden zich uit naar verschillende weefsels, wat breder neurowetenschappelijk onderzoek bevordert.
Veelgestelde vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
