Name: Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Leer een weefselzuiveringstechniek voor dikke huidsecties om zenuwvezels in 3D te visualiseren met confocale microscopie. Deze methode onthult CGRP-positieve vezels en hun relatie met bloed- en lymfevaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) en het Nationaal Interdisciplinair Innovatiefonds Traditionele Chinese Geneeskunde (Projectcode nr. ZYYCXTD-D-202202).

De huidige studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Instituut voor Acupunctuur en Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-04-13-1). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Drie volwassen mannelijke ratten (Sprague-Dawley, gewicht 230 ± 15 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren werden gehuisvest in een 12 uur licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en vrije toegang tot voedsel en water.
1. Perfusie en monstervoorbereiding
<ol><li>Injecteer 250 mg/kg tribroomethanoloplossing (zie materiaaltabel) intraperitoneaal in de rat om euthanasie te induceren.</li>
	<li>Zodra de ademhaling stopt, gebruikt u een roestvrijstalen chirurgische schaar om de thoracale holte van de rat te openen. Gebruik naalden van 20 G om te perfuseren via de linker hartkamer13 met een snelheid van 3 ml /min met 100 ml van 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250-300 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4) (figuur 1A, B).</li>
	<li>Gebruik na perfusie een scalpel om de huid van de dorsum en zool van de achterpoot te verwijderen.<ol>
<li>Voor de monsters die een bevroren sectie nodig hebben, moet u de weefsels na 2 uur fixeren in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB; vervolgens cryoprotectie de weefsels in 25% sucrose in 0,1 M PB gedurende meer dan 24 uur bij 4 °C</li>
		<li>Voor de monsters met het dikke gedeelte dat weefselreiniging vereist, fixeren de weefsels na 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 2 uur; cryoprotecteer vervolgens de weefsels in 1x PBS bij 4 °C (figuur 1C-E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling
OPMERKING: Drievoudig fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 werd aangebracht om de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de harige en glazige huid te onthullen op weefselsecties met een dikte van 300 μm na weefselzuiveringsbehandeling.
<ol><li>Bereid 2% agarose in 1x PBS door 2 min in een micro-oven te verhitten tot de agarose oplost (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 °C en plaats ze in de koelbox voor koeling (figuur 1F, G).</li>
	<li>Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoom met het ijswater en snijd ze op een dikte van 500 μm in de transversale richting. Gebruik de volgende parameters om de trilsnijmachine in te stellen en het snijden af te ronden: snelheid, 0,50 mm/s en amplitude, 1,5 mm (figuur 1H-K).</li>
	<li>Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zesputtenplaat met 1x PBS (pH 7,4) (figuur 1L).</li>
	<li>Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) 's nachts bij 4 °C. Zie figuur 2 voor de volgende procedure.</li>
	<li>Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rpm op de shaker een nacht bij 4 °C. OPMERKING: De blokkerende buffersamenstelling is 10% normaal ezelserum, 1% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP bij muizen (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis (zie Materiaaltabel) en draai gedurende 2 dagen op de shaker bij 4 °C. OPMERKING: De verdunningsbuffersamenstelling is 1% normaal ezelserum, 0,2% Triton-X 100 en 0,2% natriumazide in 1x PBS.</li>
	<li>Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij 4 °C in de wasbuffer. OPMERKING: De wasbuffersamenstelling is 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4).</li>
	<li>Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen van ezel-antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1:500) en ezel-anti-schapen IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (zie Materiaaltafel) in een microcentrifugebuis en draai met 72 tpm op de shaker gedurende 5 uur bij 4 ° C.</li>
	<li>Was de weefselsecties in een zesputtenplaat met wasbuffer gedurende 1 uur, tweemaal, bij kamertemperatuur. Bewaar de weefseldelen in de wasbuffer op de shaker een nacht bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens (zie materiaaltabel, het volume was vijf keer meer dan het monstervolume) en draai met 60 tpm voorzichtig op de shaker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Na deze behandeling worden de weefselsecties duidelijk (figuur 2B).</li>
	<li>Monteer de opgeruimde weefsels op de dia, omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en coverslip.</li>
</ol>3. Drievoudige fluorescerende kleuring met CGRP, falloidine en LYVE1 volgens de conventionele aanpak
OPMERKING: Ter vergelijking: dezelfde kleuring werd uitgevoerd op weefselsecties met een dikte van 30 μm volgens conventionele technieken.
<ol><li>Snijd de weefselsecties op 30 μm op een microtoom in de transversale richting en monteer ze op de dia.</li>
	<li>Voeg de blokkerende oplossing toe met 3% normaal ezelserum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB en incubeer de secties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de secties met de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP (1:500) en schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam (1:500) bevat in verdunningsbuffer 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was de volgende dag de weefselsecties met 0,1 M PB (pH 7,4) drie keer, voeg de gemengde oplossing toe die de secundaire antilichamen van ezel antimuis IgG H &L Alexa-Flour488 (1: 500) en ezel anti-schaap IgG H &L Alexa-Flour405 (1:500), evenals Alexa-Flour594 falloidine (1:1000) op de secties en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was vóór microscopische observatie de secties drie keer in 0,1 M PB (pH 7,4) en bedek ze vervolgens met coverslips in 50% glycerine.</li>
</ol>4. Beeldvorming en analyses
<ol><li>Observeer de gekleurde monsters onder een fluorescerende microscoop en maak de beelden vervolgens met een confocale microscoop.</li>
	<li>Leg 30 beelden (Z-stacks) vast, elk in frames van 10 μm, van elke 300 μm dikke sectie en integreer een enkele in-focus afbeelding met behulp van een beeldprocessor van het confocale microscopiesysteem (zie Materiaaltabel).<ol>
<li>Voer de volgende stappen uit in de beeldverwerkingssoftware van de confocale opstelling voor driedimensionale (3D)-analyse: Start Focal Plane | | van het eindpuntsvlak instellen Stapgrootte instellen | Kies dieptepatroon | | voor het vastleggen van afbeeldingen Z-serie. OPMERKING: De excitatie- en emissiegolflengten van blauwe fluorescentiesignalen waren respectievelijk 401 nm en 421 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van groene fluorescentiesignalen waren respectievelijk 499 nm en 519 nm. Excitatie- en emissiegolflengten van rode fluorescentiesignalen waren respectievelijk 591 nm en 618 nm. 152 μm is de diameter van het confocale gaatje (10x objectieflens, NA: 0,4). De resolutie voor het vastleggen van afbeeldingen was 1024 × 1024 pixels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de conventionele monsters (stap 3), leg 30 beelden (Z-stacks) vast in 1 μm frames van elke 30 μm dikke sectie en behandel deze beelden verder zoals hierboven vermeld (stappen 4.1-4.2).</li>
	<li>Demonstreer de afbeeldingen in het patroon van 3D-reconstructie met het beeldverwerkingssysteem.</li>
	<li>Voer 3D-reconstructies uit door confocale Z-stack-afbeeldingen te importeren in Imaris 9.0 (celbeeldvormingssoftware, zie Materiaaltabel) en maak oppervlakteweergaven op basis van vlekintensiteiten: voeg nieuwe oppervlakken toe | Kies bronkanaal | Bepaal de parameters in de vloeiende optie van Surfaces Detail | Bepaal de parameters in de drempeloptie absolute intensiteit | Oppervlakken classificeren | Afmaken.</li>
	<li>Verkrijg gegevens in het oppervlak van positieve zenuwvezels met de celbeeldvormingssoftware. Selecteer de gerenderde afbeelding | Statistieken | Gedetailleerde | Specifieke waarden | Volume.</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie biedt een gedetailleerde demonstratie van de huidzenuwvezels in de behaarde en glabrous huid door immunofluorescentie te gebruiken op dikkere weefselsecties met clearingbehandeling en een 3D-weergave om de binnenkant van de huid beter te begrijpen. De antilichaamincubatietijd van maximaal 1-2 dagen en een nachtelijk reinigingsproces zijn belangrijk. Deze twee belangrijke stappen hebben direct invloed op het immunofluorescentiekleuringseffect van dikke delen. Een ander probleem werd opgeworpen door de ke...

De huid, het grootste orgaan in het lichaam, dat dient als een belangrijke interface naar de omgeving, wordt dicht geïnnerveerd door vele zenuwvezels 1,2,3. Hoewel de innervatie van de huid eerder op grote schaal is bestudeerd met verschillende histologische methoden, zoals kleuring op de huid- en weefselsecties 4,5,6, is de gedetailleerde effectieve demonstratie van huidzenuwvezels nog steeds een uitdaging 7,8. Daarom ontwikkelde het huidige protocol een unieke techniek om cutane zenuwvezels duidelijker te vertonen in het dikke weefselgedeelte.
Vanwege de limiet door de dikte van secties, is de observatie van geïnnerveerde huidzenuwvezels niet nauwkeurig genoeg om de relatie tussen calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) zenuwvezels en lokale weefsels en organen nauwkeurig weer te geven uit de verkregen beeldinformatie. De opkomst van 3D-weefselopruimingstechnologie biedt een haalbare methode om dit probleem op te lossen 9,10. De snelle ontwikkeling van weefselzuiveringsbenaderingen heeft de afgelopen tijd veel hulpmiddelen geboden voor het bestuderen van weefselstructuren, hele organen, neuronale projecties en hele dieren11. Het transparante huidweefsel kan in een veel dikker gedeelte worden afgebeeld door confocale microscopie om de gegevens te verkrijgen om huidzenuwvezels te visualiseren.
In de huidige studie werd de plantaire en dorsale huid van een rat achtervoet geselecteerd als de twee doellocaties van de harige en glabreuze huid 3,4,7. Om de huidzenuwvezels op een langere afstand te traceren, werd het huidweefsel gesneden op de dikte van 300 μm voor immunohistochemische en histochemische kleuring, gevolgd door weefselzuiveringsbehandeling. CGRP werd gebruikt om de sensorische zenuwvezels12,13 te labelen. Om de huidzenuwvezels op de weefselachtergrond te benadrukken, werden falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 (LYVE1) verder gebruikt om de bloedvaten en lymfevaten te labelen, respectievelijk14,15.
Deze benaderingen leverden een eenvoudige methode op die kan worden toegepast om een hoge resolutiebeeld van de huidzenuwvezels te demonstreren en ook om de ruimtelijke correlatie tussen de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten in de huid te visualiseren, wat veel meer informatie kan opleveren om de homeostase van de normale huid en de cutane verandering onder de pathologische omstandigheden te begrijpen.

<table><tbody><tr><td>1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>Confocale fluorescentiemicroscopie</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-muis IgG H&amp;L Alexa-Fluor488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-schapen IgG H&amp;L Alexa-Fluor405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>EP buis</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>615001</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Schuifsysteem voor microtomen met vriesfase</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>IRIS standaard schaar</td><td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>iSpacer</td><td>SunJin Lab co.</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>Microtang-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-CGRP-antilichaam</td><td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>Neutraal gebufferd Formaldehyde</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr><tr><td>Normaal ezelsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 oplossing</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Reguliere agarose</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 tandweefseltang-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>Schapen polyklonaal anti-LYVE1-antilichaam</td><td>R&amp;D Systems, Inc.</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>Zes-wellplaat</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Life Science</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Life Science</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Henkel AG &amp; Co.</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische handgrepen</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma Life Science</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>VANNAS veerscharen</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3d-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Huid innervatie is een belangrijk onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Hoewel de studie van de huidzenuwvezels snel is gevorderd, komt het grootste deel van het begrip van hun distributieve en chemische kenmerken van conventionele histochemische en immunohistochemische kleuring op dunne weefselsecties. Met de ontwikkeling van de weefselzuiveringstechniek is het mogelijk geworden om de huidzenuwvezels op dikkere weefselsecties te bekijken. Het huidige protocol beschrijft meerdere fluorescerende kleuringen op weefselsecties met een dikte van 300 μm van de plantaire en dorsale huid van de achtervoet van ratten, de twee typische harige en glabreuze huidplaatsen. Hier labelt het calcitonine-gen-gerelateerde peptide de sensorische zenuwvezels, terwijl falloïdine en lymfevat endotheliale hyaluronaatreceptor 1 respectievelijk de bloed- en lymfevaten labelen. Onder een confocale microscoop werden de gelabelde sensorische zenuwvezels volledig op langere afstand gevolgd, lopend in bundels in de diepe cutane laag en freestyle in de oppervlakkige laag. Deze zenuwvezels liepen parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten vormden een driedimensionaal (3D) netwerk in de harige en glazige huid. Het huidige protocol biedt een effectievere benadering voor het bestuderen van de innervatie van de huid dan de bestaande conventionele methoden vanuit het methodologische perspectief.

Na drievoudige fluorescerende kleuring werden de zenuwvezels, bloedvaten en lymfevaten duidelijk gelabeld met respectievelijk CGRP, falloidine en LYVE1 in de behaarde en glabrous huid (figuur 3,4). Met de clearingbehandeling kunnen de CGRP-positieve zenuwvezels, falloidine-positieve bloedvaten en LYVE1-positieve lymfevaten op grotere diepte worden afgebeeld om de volledige structurele informatie van de huid te verkrijgen (figuur 3). Toen deze we...

De dikte van weefselsecties beperkte de morfologische studie van de huidinternervatie. Het huidige protocol beschrijft een unieke weefselzuiveringstechniek om cutane zenuwvezels te visualiseren in dikke weefselsecties van 300 μm onder confocale microscopie.

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Ons protocol bood een haalbare methode om de synchronisatiesectie te observeren met behulp van een confocale microscoop, die precisie kon garanderen bij de observatie van de zenuwvezels. Eenvoudig en gemakkelijk weefselreinigingsprotocol is een belangrijk voordeel van deze techniek. Het weefselreinigingsproces is efficiënt en duurt ongeveer 30 minuten tot een uur.Voer perfusie uit op de geëuthanaseerde rat zoals vermeld in het tekstmanuscript. Gebruik een scalpel om de huid van de dorsum en de zool van de achterpoot te verwijderen. Voor monsters die een bevroren sectie vereisen, fixeert u de weefsels in 4% van aldehyde in 0,1 molaire PB gedurende twee uur.Na het wassen, integreer de huidweefsels in 2% agarose bij 37 graden Celsius en plaats ze in de ijskast voor koeling. Bevestig het gemonteerde weefsel op de trillende microtoon met ijswater en snijd ze op een dikte van 500 micrometer in de transversale richting. Verwijder na het snijden de agarose uit de secties en bewaar ze in een zes putplaat met 1x PBS.Incubeer de weefselsecties in een oplossing van 2% triton X-100 in 1x PBS 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats de weefselsecties in de blokkerende buffer en draai met 72 rotaties per minuut op de shaker 's nachts bij vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in de oplossing die de primaire antilichamen van monoklonale anti-CGRP-anti-CGRP-antilichaam bij schapen en polyklonaal anti-LYVE-1-antilichaam bevat in verdunningsbuffer in de microcentrifugebuis.Draai vervolgens twee dagen op de shaker bij vier graden Celsius. Was de weefselsecties twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht op de shaker bij vier graden Celsius in de wasbuffer. Breng de volgende dag de weefselsecties over in de gemengde oplossing met de secundaire antilichamen in een microcentrifugebuis en roteer met 72 rotaties per minuut op de shaker gedurende vijf uur bij vier graden Celsius.Was de weefseldelen in een zes putjesplaat met wasbuffer twee keer gedurende een uur op kamertemperatuur. Bewaar de weefselsecties in wasbuffer op de shaker 's nachts op vier graden Celsius. Breng de weefselsecties over in het weefselzuiveringsreagens en draai met 60 rotaties per minuut voorzichtig op de shaker gedurende één uur bij kamertemperatuur.Monteer de heldere weefsels op de dia en omcirkel de weefsels met een afstandhouder en plak de opening met vers weefselzuiveringsreagens en afdekslip. Het 3D-patroon toonde aan dat de CGRP-positieve zenuwvezels door het onderhuidse weefsel en de dermis naar de opperhuid gingen. Deze zenuwvezels liepen in bundels in het onderhuidse weefsel vertakt in de dermis en eindigden in de opperhuid.Daarentegen worden falloïdine in positieve bloedvaten en LYVE-1 positieve lymfevaten verdeeld in het onderhuidse weefsel en de dermis. Over het algemeen liepen de CGRP-positieve zenuwvezels parallel aan of omringden de bloedvaten en lymfevaten en vormden een 3D-netwerk in de harige en glazige huid. Met de conventionele aanpak, hoewel de zenuwvezels bloedvaten en lymfevaten duidelijk werden gelabeld met CGRP-falloïdine en LYVE-1 in de dunne secties, werd de observatie van deze structuren beperkt door de plakdikte en kan deze niet volledig worden waargenomen.In het gedeelte met een dikte van 30 micrometer was er geen verschil tussen de behaarde huid en de glazige huid in het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels. In de 300 micrometer dikke weefselsecties, vergeleken met de behaarde huid, was het oppervlak van CGRP-positieve zenuwvezels van glabrous huid aanzienlijk toegenomen. Het is belangrijk om de reinigingsbuffer met hoge osmotische druk te gebruiken na incubatie van antilichamen.Meerdere keren is de reinigingstijd die nodig is voor de immunofluorescentiekleuring noodzakelijk. Na deze procedure geloven we dat er een mogelijkheid is van kleuring en observatie van andere weefsels en organen in zes secties. Deze techniek kan neurowetenschappelijke onderzoekers helpen om het oppervlak en de toestand van neurovezels tegen te komen.Het helpt ons ook om de innovatie van weefsels en organen te observeren.

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. "Sequential foto-bleken" laat de afbakening van een enkele terminal SC's, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging...

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.

Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Hier beschrijven we een nieuwe voorbereiding voor het beeldvormen van levende lancetvormige sensorische terminalen van palissade-uiteinden die tijdens kleuring en ontkleur met styryl pyridinium kleurstoffen de haarzakjes van de muizenoorhuid innerveren.

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.

CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.

Horizontale gehele berging: Een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel dwarsdoorsneden van de huid

Hier presenteren we goedkope en eenvoudige procedures om verschillende 3D-huidmodellen te introduceren voor routineonderzoek in een celkweeklaboratorium. Onderzoekers kunnen modellen maken die zijn afgestemd op hun behoeften zonder afhankelijk te zijn van in de handel verkrijgbare modellen.

Opbouw van huidmodellen voor tal van toepassingen - van tweedimensionale (2D) monocultuur tot driedimensionale (3D) multicultuur

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

Leer een weefselzuiveringstechniek voor dikke huidsecties om zenuwvezels in 3D te visualiseren met confocale microscopie. Deze methode onthult CGRP-positieve vezels en hun relatie met bloed- en lymfevaten.

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen (Video) | JoVE Journal

Het demonstreren van harige en glabreuze huid innervatie in een 3D-patroon met behulp van meerdere fluorescerende kleuring en weefselzuiveringsbenaderingen

Meer video's verkennen