CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen
August 4th, 2016
Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.
Het algemene doel van deze procedure is om celproliferatie en eiwitexpressiepatronen op het niveau van één cel in drie dimensies te visualiseren en om de anatomie en pathologie van de huid nauwkeurig te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe cellulaire en moleculaire mechanismen de ontwikkeling en regeneratie van de epidermis controleren en hoe deze mechanismen worden verstoord tijdens huidaandoeningen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een technisch eenvoudig protocol is voor het visualiseren van individuele cellen in volledige huidbiopsies in drie dimensies met een ongekende nauwkeurigheid.
De methode vergemakkelijkt ook het onderzoek naar de interacties tussen de epidermis en de dermis in volledige huidmonsters. Over het algemeen kunnen onderzoekers die nieuw zijn in deze methode wat moeite hebben met het voorbereiden van de kleine platte huidbiopsies zonder de haarzakjes te beschadigen. Het demonstreren van de procedure zal Betty Maclarios zijn, een Ph.D. student aan de Developmental and Regenerative Dermatology Unit bij UNSW Australia.
Begin met het gebruik van trimmers om het haar van de nek van een geëuthanaseerd muis te scheren, waarbij u ervoor zorgt dat de huid niet wordt gewond. Ontsmet vervolgens de huid met 70% ethanol en PBS. Til vervolgens de dorsale nekhuid op met een pincet en gebruik een schaar om een gebied van ongeveer 1,5 bij 4 cm van de dorsale muishuid te verwijderen.
Vlak vervolgens de huid met de dermis naar beneden op een stuk filterpapier en noteer de anterieure posterieure oriëntatie van het monster en trim het papier rond de gedissecteerde huid. Voor optimale beeldvorming moeten de huidmonsters vlak blijven met een consistente oriëntatie van de haarzakjes. Om de monsters in de juiste anterieure posterieure positie te houden, fixeren we de huidstukken op het filterpapier in rechthoekige biopsies.
Breng de monsters over naar een 15 mL buis gevuld met vers bereide 4% PFA en PBS. Nadat ze stevig op het filterpapier zijn bevestigd, brengt u de monsters over naar een nieuwe 15 mL buis PBS voor twee wasbeurten van vijf minuten. Om de huidbiopsies te klaren, gebruikt u na de tweede wasbeurt een scherp scheermes om de weefsels in stukken van ongeveer 0,2 bij 0,5 cm te snijden, waarbij u erop let dat de langere kanten van de monsters worden gesneden langs de anterieure posterieure richting van de monsters.
Snijden langs de zijkant van de biopsie parallel aan de oriëntatie van de haarzakjes helpt ook om uitgebreide schade aan de haarzakjes te voorkomen. Dompel vervolgens de biopsies onder in 5 mL vers bereide kubieke oplossing in een nieuwe 15 mL buis en plaats de buis op een roterend platform in een hybridisatieoven op 37 graden Celsius. Zodra de weefselstukken transparant zijn, spoelt u de biopsies in 4 mL PBS gedurende vier zes uur wasbeurten bij 37 graden Celsius, gevolgd door een vier uur durende 37 graden Celsius wasbeurt in 20% gewicht per volume sucrose en PBS.
Aan het einde van de incubatie bevriest u elk monster in een optimaal snijtemperatuursmiddel in afzonderlijke 15 mL buizen een nacht lang bij 80 graden Celsius om de permeabiliteit van de weefsels voor antilichaampenetratie te verhogen. De volgende ochtend kleurt u de huidmonsters met de geschikte antilichamen en vitale kleurstoffen van belang. Bewaar vervolgens de monsters in 1 mL vers bereide kubieke twee oplossing in 2 mL buisjes op een shaker gedurende 24 uur in de 37 graden Celsius oven om de brekingsindex van de weefsels gelijkmatig te maken.
Wanneer de weefsels helder zijn, plaatst u de biopsies langs de langere kant van individuele glazen deksels zodat de richting van de haarzakjesgroei parallel is aan het oppervlak van het deksel. Breng een druppel kubieke twee oplossing aan over het weefsel. Plaats twee 1 mL bij 2 cm stroken blauwe lijm op een deksel en bedek de biopsie met een tweede deksel.
Plaats vervolgens de beeldvormingskamer op een confocale microscooptafel en beweeg het weefsel naar de lichtbaan. Gebruik de juiste lichtbron en standaard epifluorescentiefilters, scant het monster om fluorescent gekleurde gebieden van belang te identificeren en verwerft vervolgens fluorescente confocale beelden van de gebieden van belang. Met behulp van deze methode kunnen zowel dikte dorsale huidbiopsies van volwassen wildtype muizen worden verduidelijkt en gekleurd met antilichaam tegen de basale keratinocytmarker keratine 14.
Dappy positieve kernen zijn zichtbaar in het hele monster en laten een aantal anatomische kenmerken zien, zoals de dermale papillae. De K14-kleuring is zichtbaar in de een cel dikke basale laag van de interfolliculaire epidermis. Het omlijnt de talgklieren en de buitenste wortelscheden van de haarzakjes en in de secundaire haarkiemen met alleen lage niveaus van K14-expressie gedetecteerd in het uitstulpingsgebied van de haarzakjes.
Om de proliferende cellen te visualiseren, kunnen volledige dikte dorsale huidbiopsies in de telogene fase van volwassen wildtype muizen worden verduidelijkt en gekleurd, zoals gedemonstreerd, wat de aanwezigheid van proliferende keratinocyten in de basale interfolliculaire epidermis en in de isthmus, maar niet in het uitstulpingsgebied van de haarzakjes, onthult. Om de talgklieren te visualiseren, kunnen volledige dikte dorsale huidbiopsies in de antigeenfase van volwassen wildtype muizen worden verduidelijkt en gekleurd, wat de detectie van de talgklieren in de isthmusregio van de haarzakjes vergemakkelijkt. Om morfologische veranderingen in de epidermis en transgene dieren te visualiseren, kunnen volledige dikte dorsale huidbiopsies worden verduidelijkt en gekleurd, waardoor hyperplasie van de interfolliculaire epidermis en abnormale haarzakjes met K14-gelabelde celmassa's zich naar de dermis uitstrekken, wat de vergrote transgene stamcelpopulaties vertegenwoordigt.
Na het bekijken van deze video zouden we een goed begrip moeten hebben van hoe huidmonsters worden voorbereid en verduidelijkt en om eiwitexpressiepatronen op het niveau van één cel in drie dimensies te visualiseren. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en gebruikt relatief veilige en goedkope reagentia. In de toekomst zullen meer antilichamen worden getest op
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit rapport beschrijft een CUBIC-protocol om volledige dikte muizenhuidbiopsies te verduidelijken, waardoor visualisatie van eiwitexpressiepatronen en proliferende cellen met enkele celresolutie in 3D mogelijk wordt. Deze methode vergemakkelijkt nauwkeurige beoordeling van huidanatomie en pathologie, met name in genetisch gemodificeerde muislijnen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Dermatologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Begrip van cellulaire en moleculaire mechanismen in de ontwikkeling van de epidermis.
- Onderzoek naar huidaandoeningen en regeneratieprocessen.
- Belang van nauwkeurige huidbiopsieanalyse.
- Uitdagingen bij het voorbereiden van huidmonsters zonder haarfollikels te beschadigen.
Doel van de studie
- Om celproliferatie en eiwitexpressie in 3D te visualiseren.
- Om huidanatomie en pathologie nauwkeurig te beoordelen.
- Om interacties tussen de epidermis en dermis te verkennen.
Gebruikte methoden
- CUBIC-protocol voor weefselverduidelijking.
- 3D-visualisatietechnieken.
- Analyse met enkele celresolutie.
- Volledige dikte huidbiopsies van muismodellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van individuele cellen in huidbiopsies.
- Verbeterd begrip van eiwitexpressiepatronen.
- Inzichten in abnormale epidermale fenotipen.
- Vereenvoudiging van huidaandoeningsonderzoek.
Conclusies
- Het CUBIC-protocol is een eenvoudige maar effectieve methode voor huidanalyse.
- Het biedt ongekende nauwkeurigheid in het visualiseren van huidcelinteracties.
- Deze techniek kan onderzoek in dermatologie en regeneratieve geneeskunde bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The CUBIC protocol enables high-resolution 3D visualization of protein expression and cellular dynamics in full-thickness skin biopsies, supporting mechanistic de-risking in dermatology target validation. By providing single-cell resolution data on epidermal stem/progenitor populations and their interactions with the dermis, the method enhances predictive confidence in preclinical models of skin regeneration and disease. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing biological ambiguity in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell dynamics in intact tissue architecture.
- Scientific Value: Supports functional target validation through spatial mapping of proliferation (Ki67) and sebocyte differentiation (Nile Red) in genetically modified models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by quantifying abnormal epidermal phenotypes and stromal interactions in 3D without sectioning artifacts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by preserving epidermal-dermal architecture and appendage integrity.
- Operational Value: Enables reproducible quantitative outputs for protein expression and cell proliferation across conditions, supporting assay scalability.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by providing a clear, intact tissue platform for reliable compound or genetic perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by visualizing hyperplasia, abnormal follicle morphology, and stem cell mass expansion in transgenic models.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through correlative analysis of K14, Ki67, and sebocyte markers with phenotypic outcomes.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into epidermal-dermal crosstalk during homeostasis and perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, enabling iterative assessment of skin-specific biological responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving spatial expression patterns of keratinocytes, proliferating cells, and sebocytes in intact skin.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized clearing and staining of full-thickness biopsies with consistent follicle orientation.
- Analytics: Generates quantitative 3D readouts on protein expression and cell density that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving disease-relevant epidermal and dermal structures for longitudinal analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing platform applicable across wild-type, mutant, and treatment-induced skin models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epidermal regeneration pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a simple, solvent-based clearing protocol compatible with conventional confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of on-target and off-target epidermal effects in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on stem cell dynamics and sebaceous gland function in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunofluorescence staining to preserve epidermal appendages during biopsy preparation.
- Depends on access to a hybridization oven, rotating platform, and confocal microscope with standard epifluorescence filters for 3D imaging.
- Necessitates cross-team standardization of biopsy orientation and clearing duration to ensure consistent refractive index matching and imaging quality.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to thicker human skin explants or alternative mammalian models due to lipid and collagen content.
- Involves practical limitations related to the duration of clearing and washing steps, which may extend timelines for high-throughput screening applications.
