CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

Het algemene doel van deze procedure is om celproliferatie en eiwitexpressiepatronen op single-cell niveau in drie dimensies te visualiseren en om de anatomie en pathologie van de huid nauwkeurig te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe cellulaire en moleculaire mechanismen de epidermale ontwikkeling en regeneratie beheersen en hoe deze mechanismen worden verstoord tijdens huidziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een technisch eenvoudig protocol is voor het visualiseren van individuele cellen in volledige dikte huidbiopten in drie dimensies met een ongekende nauwkeurigheid.

De methode vergemakkelijkt daarnaast het onderzoek naar de interacties tussen de epidermis en de dermis in volledige huidmonsters. Over het algemeen kunnen onderzoekers die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben met het prepareren van de kleine, platte huidbiopten zonder de haarfollikels te beschadigen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Betty Maclarios, promovendus bij de Developmental and Regenerative Dermatology Unit aan de UNSW Australia.

Begin met het gebruik van trimmers om het haar van de nek van een geëuthanaseerde muis af te scheren, waarbij u er goed op moet letten dat de huid niet gewond raakt. Decontamineer vervolgens de huid met 70% ethanol en PBS. Til daarna de dorsale nekhuid op met een pincet en gebruik een schaar om een gebied van ongeveer 1,5 bij 4 cm van de dorsale muishuid te verwijderen.

Leg vervolgens de huid met de dermiszijde naar beneden plat op een stuk filterpapier, waarbij de anterieur-posterieure oriëntatie van het monster wordt genoteerd, en trim het papier rondom de gedisseceerde huid. Voor een optimale beeldvorming moeten de huidmonsters plat blijven liggen met een consistente oriëntatie van de haarfollikels. Om de monsters in de juiste anterieur-posterieure positie te houden, fixeren we de stukken huid op het filterpapier in rechthoekige biopten.

Breng de monsters over naar een 15 mL buis gevuld met vers bereide 4% PFA en PBS. Zodra ze stevig aan het filterpapier zijn gefixeerd, worden de specimens overgebracht naar een nieuwe 15 mL buis met PBS voor twee wasbeurten van vijf minuten. Om de huidbiopten te klaren, worden de weefsels na de tweede wasbeurt met een scherp scheermesje in stukjes van ongeveer 0,2 bij 0,5 cm gesneden, waarbij erop wordt gelet dat de langere zijden van de monsters in de anterieur-posterieure richting worden gesneden.

Het snijden langs de zijkant van het biopt, parallel aan de oriëntatie van de haarfollikels, helpt daarnaast om uitgebreide beschadiging van de haarfollikels te voorkomen. Dompel de biopten vervolgens onder in 5 mL vers bereide cubic one-klaarmakingsoplossing in een nieuwe 15 mL buis en plaats de buis op een roterend platform in een hybridisatieoven bij 37 °C. Zodra de weefselstukken transparant zijn, worden de biopten gewassen in 4 mL PBS via vier wasbeurten van zes uur bij 37 °C, gevolgd door een wasbeurt van vier uur bij 37 °C in 20% w/v sucrose en PBS.

Vries aan het einde van de incubatie elk monster in een optimal cutting temperature compound in individuele buisjes van 15 mL gedurende een nacht in bij 80 graden Celsius om de permeabiliteit van de weefsels voor antilichaampenetratie te verhogen. Kleur de huidmonsters de volgende ochtend met de gewenste geschikte antilichamen en vitale kleurstoffen. Incubeer de specimens vervolgens in 1 mL vers bereide cubic two clearing solution in buisjes van 2 mL op een schudmachine gedurende 24 uur in een oven van 37 graden Celsius om de brekingsindex van de weefsels gelijk te trekken.

Wanneer de weefsels transparant zijn, worden de biopten langs de langere zijde van individuele glazen dekglasplaatjes geplaatst, zodanig dat de groeirichting van de haarfollikel parallel loopt aan het oppervlak van het dekglasplaatje. Breng één druppel cubic two-oplossing aan over het weefsel. Plaats twee stroken blue tack van 1 mL bij 2 cm op een dekglasplaatje en dek het biopt vervolgens af met een tweede dekglasplaatje.

Plaats vervolgens de beeldkamer op de tafel van een confocale microscoop en beweeg het weefsel in het lichtpad. Scan het monster met behulp van de juiste lichtbron en standaard epifluorescentiefilters om fluorescent gekleurde regio's van belang te identificeren en leg vervolgens confocale fluorescentiebeelden van deze regio's vast. Met deze methode kunnen dikke dorsale huidbiopten van volwassen wild-type muizen worden geklaard en gekleurd met een antilichaam tegen de basale keratinocytenmarker keratin 14.

DAPI-positieve kernen zijn zichtbaar in het gehele monster en maken het mogelijk om enkele anatomische kenmerken, zoals de dermale papillae, waar te nemen. De K14-kleuring is duidelijk aanwezig in de eencellige basale laag van de interfolliculaire epidermis. Deze omlijnt de talgklieren en de buitenste wortelscheden van de haarfollikels, evenals de secundaire haarkiemen, waarbij slechts lage niveaus van K14-expressie zijn gedetecteerd in het bulge-gebied van de haarfollikels.

Om de prolifererende cellen te visualiseren, kunnen full-thickness dorsale huidbiopten tijdens de telogenfase van volwassen wildtype muizen worden geklaard en gekleurd zoals gedemonstreerd, wat de aanwezigheid van prolifererende keratinocyten in de basale interfolliculaire epidermis en in de isthmus onthult, maar niet in het bulge-gebied van de haarfollikels. Om de talgklieren te visualiseren, kunnen full-thickness dorsale huidbiopten tijdens de antigenfase van volwassen wildtype muizen worden geklaard en gekleurd, wat de detectie van de talgklieren in het isthmus-gebied van de haarfollikels faciliteert. Om morfologische veranderingen in de epidermis van transgene dieren te visualiseren, kunnen full-thickness dorsale huidbiopten worden geklaard en gekleurd, waarbij hyperplasie van de interfolliculaire epidermis en abnormale haarfollikels zichtbaar worden met K14-gelabelde celmassa's die proximaal uitstrekken in de dermis, wat de vergrote transgene stamcelpopulaties vertegenwoordigt.

Na het bekijken van deze video zouden we een goed begrip moeten hebben van hoe huidmonsters worden geprepareerd en gezuiverd en hoe eiwitexpressiepatronen op resolutie van individuele cellen in drie dimensies kunnen worden gevisualiseerd. Deze methode is eenvoudig uit te voeren en maakt gebruik van relatief veilige en goedkope reagentia. In de toekomst zullen meer antilichamen worden getest op hun compatibiliteit met deze methode, waardoor deze analyse kan worden uitgebreid om meer eiwitten en specifieke types van belang te visualiseren.

Andere beeldvormingsmethoden, zoals light-sheet microscopie, kunnen worden uitgevoerd voor de visualisatie van de huidanatomie en eiwitexpressiepatronen van grotere huidmonsters in drie dimensies. Na de ontwikkeling zal deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de dermatologie om de cellulaire en moleculaire interacties tussen de dermis en epidermis in de homeostase van de huid te onderzoeken, in genetisch gemodificeerde muismodellen en in een van onze modellen voor huidziekten.