Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Ons protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest. Het gebruik van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten kan eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. In tegenstelling tot ondoorzichtige bot- of dentineplakken, maakt de calciumfosfaatcoating visualisatie van resorptieputten en cellen tegelijkertijd mogelijk.

In dit protocol gebruiken we PBMC's voor osteoclastische differentiatie. Het kan echter ook worden toegepast op andere celtypen zoals beenmerg afgeleide monocyten of Raw 264.7-cellen. Neem eerst een celkweekplaat met een platte bodem van 96 putjes en pipetteer 300 microliter eerder bereide calciumfosfaatoplossing in elke put.

Bedek vervolgens de plaat met het deksel en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen. Zuig na drie dagen de pre-calcificatieoplossing op uit de voorverkalkte 96 putcelkweekplaten en voeg 300 microliter calciumfosfaatoplossing toe aan elke put. Bedek de borden met een deksel en incubeer een dag bij 37 graden Celsius.

Keer vervolgens de plaat om om de oplossing uit te gieten en was de plaat driemaal grondig met gedeïoniseerd water. Droog de plaat onmiddellijk met behulp van een haardroger of gecomprimeerd kooldioxide- of stikstofgas om een uniform oppervlak te behouden. Bestraal nu de gecoate plaat op een schone bank met ultraviolette stralen gedurende een uur.

Gebruik de gecoate plaat onmiddellijk of sluit de plaat af met Parafilm en bewaar deze bij kamertemperatuur. Verdun 15 milliliter vers bloed met een gelijk volume PBS en meng ze door meerdere keren om te keren of te pipetteren. Neem vervolgens 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing in een conische buis van 50 milliliter, kantel de buis en leg voorzichtig 30 milliliter verdund bloedmonster op de 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing.

Centrifugeer de buis later in een zwenkende emmerrotor zonder breuk op 810 keer G gedurende 20 minuten bij 20 graden Celsius. Zuig vervolgens de bovenste laag op en laat de mononucleaire cellaag ongestoord op het grensvlak. Breng de mononucleaire cellaag voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.

Vul de buis met PBS, meng en centrifugeer 300 maal G gedurende 10 minuten bij 20 graden Celsius. Suspensie PBMC's opnieuw in een complete alfa-MEM met 20 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor en zaai 2,5 keer 10 tot de vijfde cel per centimeter vierkante PBMC's in een kolf. Incubeer de met calciumfosfaat gecoate platen met 50 microliter foetaal runderserum bij 37 graden Celsius gedurende één uur.

Was vervolgens de kolf twee keer met PBS om de osteoclastenprecursoren los te maken van dode of niet-hechtende cellen en voeg vervolgens vier milliliter trypsine toe per kolf van 75 vierkante centimeter. Stop na 30 minuten de spijsvertering door vier milliliter volledige alfa-MEM toe te voegen en maak de cellen vervolgens voorzichtig los met behulp van een celschraper. Breng de cellen over in een buis van 50 milliliter en tel het totale aantal cellen met behulp van een telkamer.

Centrifugeer de buis gedurende zeven minuten op 350 maal G om de cellen te pelleteren en de pellet opnieuw uit te geven en voltooi alfa-MEM met M-CSF en RANKL om één keer 10 tot de zes cellen per milliliter te krijgen. Zuig het foetale runderserum op uit de met calciumfosfaat beklede plaat en pipetteer 200 microliter celsuspensie per putje. Was de cellen na de incubatie twee keer met PBS.

Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en was opnieuw met PBS. Voeg voor kleuring permeabilisatiebuffer toe aan de vaste cellen en incubeer ze gedurende vijf minuten. Om de actinefilamenten te kleuren, incubeer je de cellen met 100 microliter Alexa Fluor 546 gelabelde falloïdine-oplossing in PBS gedurende 30 minuten, zuig je vervolgens de kleuringsoplossing op en kleur je de kernen met 100 microliter Hoechst gedurende 10 minuten.

Kleur calciumfosfaatcoating met 100 microliter 10 micromolaire calceïne en PBS gedurende 10 minuten. Nadat u driemaal met PBS hebt gewassen, maakt u foto's. Voeg voor Von Kossa-kleuring van calciumfosfaatcoating 50 microliter 5% zilvernitraat en gedeïoniseerd water toe aan elke put en incubeer de plaat onder ultraviolette straling gedurende een uur totdat de coating op de bodem van de putten bruin is geworden.

De calciumfosfaatcoating aan de onderkant van de 96 putplaten bleek uniform en goed gehecht. Na negen dagen kweek in M-CSF en RANKL op de met calciumfosfaat gecoate platen, vormden osteoclastenvoorlopers resorptieputten en grote osteoclasten. De multi-nucleated osteoclasten in de putten drukten hoge TRAP-niveaus uit.

De volwassen osteoclasten vertoonden de aanwezigheid van drie of meer kernen en de duidelijke actinering. De groene calciumfosfaatcoating toonde de aanwezigheid van zwarte resorptieputten. De fluorescentiebeelden van het putgebied werden gemeten met behulp van de drempeltool van afbeelding J.Het aantal en de grootte van osteoclasten werden berekend met behulp van ROI-manager en de polygoonselectietool van afbeelding J.Osteoclasten'voorlopers gekweekt in afwezigheid van RANKL konden geen resorptieputten vormen, maar M-CSF en RANKL vergemakkelijkten de vorming van osteoclastogene putten.

En het putgebied werd gekwantificeerd met behulp van afbeelding J.Onmiddellijk drogen van de gecoate plaat met luchtstroom helpt om een uniforme calciumfosfaatcoating te maken. Anders is het gevoelig om een dikkere coating in het midden van de put te vormen.