Name: Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer een eenvoudig pittestprotocol voor osteoclastische resorptie met calciumfosfaat gecoate platen. Deze methode maakt gelijktijdige visualisatie van resorptieputten en cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394]. W.C. werd gefinancierd door CSC.

Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (goedkeuringsnummer 287/2020B02).
1. Bereiding van met calciumfosfaat beklede celkweekplaten
<ol><li>Bereiding van calciumvoorraadoplossing (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O in Tris-buffer)<ol>
<li>Bereid 1,0 M Tris buffer en stel de pH in op 7,4 met behulp van 1 M HCl.</li>
		<li>Plaats een glazen bekerglas op een magneetroerder en voeg 100 ml 1,0 M Tris-buffer toe.</li>
		<li>Weeg 0,368 g CaCl2·2H 2O, 8,0 g NaCl en 0,305 g MgCl2·6H2O af en los één voor één op in Tris-buffer.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van fosfaatvoorraadoplossing (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 in Tris buffer)<ol>
<li>Plaats een glazen bekerglas op een magneetroerder en voeg 100 ml 1,0 M Tris-buffer toe.</li>
		<li>Weeg 0,158 g Na2HPO4· H2O en 0,353 g NaHCO3 en los één voor één op in Tris-buffer.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Bewaren bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-calcificatie van 96-well celkweekplaten<ol>
<li>Bereid 30 ml werkoplossing door 15 ml 1,0 m Tris-buffer, 7,5 ml calciumvoorraad (stap 1.1.4) en 7,5 ml fosfaatvoorraadoplossing (stap 1.2.3) te mengen. Filter de oplossing met een filter van 0,2 μm.</li>
		<li>Bereid een 96-well celkweekplaat met platte bodem. Pipetteer 300 μL calciumfosfaatoplossing (stap 1.3.1.) naar elke put. Dek de plaat af met een deksel en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van calciumfosfaatoplossing (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris basis in ddH2O)<ol>
<li>Voeg 2 ml van 1 M HCl toe aan 40 ml gedeïoniseerd water in een bekerglas met een magnetische roerkraal en los 0,016 g Na2HPO4· H2O, 0,0295 g CaCl2·2H2O, 0,409 g NaCl en 0,303 g Tris-basis één voor één.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,4 met 1 M HCl. Voeg gedeïoniseerd water toe om het volume te vullen tot 50 ml. Filter de oplossing met een filter van 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkalking van 96-well celkweekplaten<ol>
<li>Zuig prekalkoplossing uit de voorverkalkte 96-well celkweekplaten en voeg 300 μL calciumfosfaatoplossing (stap 1.4.2) toe aan elke put. Dek de platen af met een deksel en incubeer bij 37 °C gedurende 1 dag.</li>
		<li>Draai de plaat om om de oplossing uit te gieten en was de plaat drie keer grondig met gedeïoniseerd water. Droog de plaat onmiddellijk met een föhn of gecomprimeerd CO2 - of N2-gas om een uniform oppervlak te behouden.</li>
		<li>Steriliseer de gecoate plaat door UV-straling in een schone bank gedurende 1 uur. Gebruik de gecoate plaat onmiddellijk of sluit de plaat af met parafilm en bewaar deze bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolatie van PBMC's van menselijk perifeer bloed
<ol><li>Trek 15 ml bloed uit de ader na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de bloeddonor (ethische stemming: 287/2020B02).</li>
	<li>Verdun 15 ml vers bloed met een gelijk volume PBS en meng door de buis meerdere keren om te keren of door het mengsel in en uit een pipet te trekken.</li>
	<li>Bereid een conische buis van 50 ml met 15 ml dichtheidsgradiëntoplossing (bijv. Ficoll, materiaaltabel) per buis. Kantel de buis en leg voorzichtig 30 ml verdund bloedmonster op de 15 ml dichtheidsgradiëntoplossing (verdund bloedmonster: dichtheidsgradiëntoplossing, verhouding 1:0,5-1). OPMERKING: Let er bij het overlayen van het monster op dat u de dichtheidsgradiëntoplossing niet mengt met het verdunde bloedmonster.</li>
	<li>Centrifugeer bij 810 x g gedurende 20 minuten bij 20 °C in een zwenkbakrotor zonder rem.</li>
	<li>Zuig de bovenste laag op en laat de mononucleaire cellaag (lymfocyten, monocyten en trombocyten) ongestoord in de interfase.</li>
	<li>Breng de mononucleaire cellaag voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Vul de buis met PBS, meng en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C (rem kan vanaf deze fase worden gebruikt).</li>
	<li>Verwijder het bovennatuurlijke middel voorzichtig volledig. Resuspend de celkorrel in 50 ml PBS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig volledig.</li>
	<li>Voor het verwijderen van bloedplaatjes, resuspend de celkorrel in 50 ml PBS en centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig volledig.</li>
	<li>Breng geresuspendeerde cellen over naar celkweekkolven voor uitbreiding van OC-voorlopercellen.</li>
</ol>3. Uitbreiding van OC-voorlopers
<ol><li>Resuspend PBMC's in volledige α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amfotericine B) met 20 ng/ml M-CSF. Zaad PBMC's met een dichtheid van 2,5 x 105 cellen/cm2. Gewoonlijk kunnen cellen geïsoleerd uit 15-20 ml vers bloed worden gezaaid in één kolf van 75 cm2 (1,5-2 x 107 cellen).</li>
	<li>Voed de cellen elke derde dag met verse complete α-MEM met 20 ng / ml M-CSF totdat de aangesloten cellen een gewenste samenvloeiing bereiken. Typische opbrengsten zijn 1,5-2 x 106 cellen /kolf wanneer cellen 95% confluent zijn. Meestal duurt de expansieperiode 6 dagen. OPMERKING: Het osteoclastogene potentieel van de precursoren kan afnemen met een langere teelttijd.</li>
</ol>4. Inductie van osteoclastogenese in CaP-gecoate platen
<ol><li>Om de hechting van de cel te vergemakkelijken, incubeert u de cap-gecoate platen met 50 μL FBS gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C.</li>
	<li>Om de OC-voorlopers los te maken, wast u de kolf tweemaal met PBS om dode of niet-hechtende cellen te verwijderen. Voeg gedurende 30 minuten 4 ml trypsine (materiaaltabel) toe per 75 cm2 kolf.<ol>
<li>Voeg 4 ml complete α-MEM toe om de spijsvertering te stoppen, maak de cellen voorzichtig los met behulp van een celschraper en breng de cellen over in een buis van 50 ml.</li>
		<li>Bepaal het totale celgetal met behulp van een Neubauer-kamer of iets dergelijks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren gedurende 7 min bij 350 x g. Resuspend de pellet in voldoende volledige α-MEM met 20 ng /ml M-CSF en 20 ng / ml RANKL om een concentratie van 1 x 106 cellen / ml te krijgen.</li>
	<li>Aspiraat FBS oplossing uit de CaP gecoate 96-well plaat en pipetteer 200 μL celsuspensie per put (2 x 105 cellen/put).</li>
	<li>Incubeer de OC-voorlopers gedurende de gewenste periode of met de gewenste reagentia die relevant zijn voor het experimentele ontwerp. Meestal kunnen grote aantallen grote en meerkleurige OC's worden waargenomen na 6 dagen en wanneer resorptieputten zich vormen. Voer cellen met verse complete α-MEM medium met 20 ng/ml M-CSF en 20 ng/ml RANKL om de drie dag.</li>
	<li>Was de cellen aan het einde van de incubatie tweemaal met PBS, fixeer met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en was opnieuw met PBS.</li>
	<li>Gebruik de vaste OC's direct voor fluorescentiekleuring of bewaar bij 4 °C.</li>
</ol>5. Fluorescentiekleuring van OC's en CaP-coating
<ol><li>Incubeer de vaste cellen met permeabilisatiebuffer (0,1% Triton in PBS) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Vlek actine filamenten met 100 μL AlexaFluor 546 gelabelde falloïde oplossing in PBS gedurende 30 minuten en zuig de kleuringsoplossing aan. Voeg gedurende 10 minuten 100 μL Hoechst 33342 kleuringsoplossing (10 μg/ml in PBS) toe aan de vlekkernen. DAPI kan ook worden gebruikt.</li>
	<li>Vlek CaP coating met 100 μL van 10 μM calceïne in PBS gedurende 10 min. Was drie keer met PBS en maak foto's.</li>
	<li>Na fluorescentiebeeldvorming kunnen dezelfde platen worden gebruikt om het resorptieputgebied te kwantificeren door Von Kossa-kleuring. Was hiervoor de borden twee keer met gedeïoniseerd water.</li>
</ol>6. Kwantificering van het totale resorptieputgebied
<ol><li>Om CaP-coating met Von Kossa-kleuring te beitsen, incubeer met 50 μL van 5% AgNO3 in gedeïoniseerd water per put onder UV-straling gedurende 1 uur, totdat de coating op de bodem van de putten bruin is geworden.</li>
	<li>Was de plaat drie keer met gedeïoniseerd water en maak brightfield-beelden. Een objectief met weinig vergroting, zoals een 1,25x objectief, kan worden gebruikt om de hele put in één beeld vast te leggen. Dit vergemakkelijkt de daaropvolgende beeldanalyse. Alternatieve methoden om het hele gebied van de put vast te leggen, kunnen worden toegepast.</li>
	<li>Een afbeeldingsbestand openen met ImageJ: Bestand | | openen Afbeelding | Soort | 8-bits. Controleer de schaaleenheid in de rechterbenedenhoek van de afbeelding met de rechte lijn | Analyseer | Schaal instellen. Voer de lengte in de deken 'bekende afstand' in, voer een nieuwe schaaleenheid in lengte-eenheid in en vink het selectievakje Globaal aan.</li>
	<li>Lijst meetparameters die moeten worden geanalyseerd: Analyseer | Stel metingen in. Schakel in het venster Metingen instellen de selectievakjes Gebied en Limiet tot drempel in.</li>
	<li>Meet het gebied van putten: Afbeelding | | aanpassen Drempel. Schakel in het venster Drempel het selectievakje Donkere achtergrond in en klik op Automatisch. Het gebied van putten wordt rood. Sluit het venster Drempel en selecteer | analyseren Meten. Het resultaatbestand opslaan: Bestand | Opslaan als.</li>
</ol>7. Kwantificering van het aantal en de grootte van de obs en het genormaliseerde resorptieputgebied
<ol><li>Open een fluorescentiebeeld van osteoclasten met ImageJ en controleer de schaaleenheid (zie stap 6.3).</li>
	<li>Lijst meetparameters die moeten worden geanalyseerd: Analyseer | Stel metingen in. Schakel in het venster Metingen instellen het selectievakje Gebied in .</li>
	<li>Schets de OC's met roi manager en polygoon selecties: analyseer | Gereedschap | ROI-manager. Klik op Polygoonselecties in toolset, schets één OC (cellen met actinering en ≥ drie kernen) en klik op Toevoegen [t] in het venster ROI-beheer. Herhaal het schetsen totdat alle OC's zijn opgenomen.</li>
	<li>Aantal en grootte van OC's meten: Selecteer alle items in ROI Manager en klik op Meten. Het resultaatbestand opslaan: Bestand | Opslaan als (figuur 3e).</li>
	<li>Meet het putgebied van fluorescentiebeelden. Open het fluorescerende beeld van de coating die is gecorreleerd met de afbeelding in stap 7.3 en controleer de schaaleenheid (zie stap 6.3).<ol>
<li>Maak een lijst van te analyseren meetparameters (zie stap 6.4). Selecteer Afbeelding | | aanpassen Drempel. Schakel in het venster Drempel alle selectievakjes uit en klik op Automatisch. Het gebied van de putten kleurt rood. Sluit het venster Drempel en selecteer | analyseren Meten. Sla het resultaatbestand op.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereken het genormaliseerde putoppervlak op OC-getal.</li>
</ol>

<ol><li>Jacome-Galarza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin%2C+functional+maintenance+and+genetic+rescue+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts.</a> Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).</li>
<li>Moller, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+menopause+reprogram+osteoclast+precursors+for+aggressive+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption.</a> Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).</li>
<li>Yokota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+function+of+tumor+necrosis+factor+and+interleukin-6-induced+osteoclasts+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).</li>
<li>Teng, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+T-cell+immunity+and+osteoprotegerin+ligand+control+alveolar+bone+destruction+in+periodontal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).</li>
<li>Terpos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+ligand-osteoprotegerin+ratio+predicts+survival+in+multiple+myeloma%3A+proposal+for+a+novel+prognostic+index%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index.</a> Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).</li>
<li>Morony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+inhibits+osteolysis+and+decreases+skeletal+tumor+burden+in+syngeneic+and+nude+mouse+models+of+experimental+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis.</a> Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).</li>
<li>Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopetrosis%3A+genetics%2C+treatment+and+new+insights+into+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).</li>
<li>Amarasekara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+differentiation+by+cytokine+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Network%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks.</a> Immune Network. 18 (1), 8(2018).</li>
<li>Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast-osteoclast+communication+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-mediated+extracellular+acidification+and+bone+resorption%3A+evidence+for+a+low+pH+in+resorbing+lacunae+and+localization+of+a+100-kD+lysosomal+membrane+protein+at+the+osteoclast+ruffled+border%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border.</a> Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).</li>
<li>Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclastic+bone+resorption+by+a+polarized+vacuolar+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump.</a> Science. 245 (4920), 855-857 (1989).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-mediated+bone+resorption+is+controlled+by+a+compensatory+network+of+secreted+and+membrane-tethered+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases.</a> Science Translational Medicine. 12 (529), 6143(2020).</li>
<li>Gowen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K+knockout+mice+develop+osteopetrosis+due+to+a+deficit+in+matrix+degradation+but+not+demineralization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).</li>
<li>Abu-Amer, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+abrogates+osteoclastogenesis+through+STAT6-dependent+inhibition+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).</li>
<li>Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+soluble+cobalt+and+cobalt+incorporated+into+calcium+phosphate+layers+on+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation.</a> Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).</li>
<li>Sorensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+osteoclasts+derived+from+CD14%2B+monocytes+isolated+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood.</a> The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+biphasic+calcium+phosphate+and+platelet-rich+fibrin+attenuate+markers+for+inflammation+and+osteoclast+differentiation+by+suppressing+NF-kappaB%2FMAPK+signaling+pathway+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis.</a> Molecules. 26 (21), 6578(2021).</li>
<li>Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+osteoclasts+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of human osteoclasts from peripheral blood.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).</li>
<li>Maria, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+osteoclastic+activity%3A+characterization+of+a+biomimetic+calcium+phosphate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).</li>
<li>Kong, L., Smith, W., Hao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+RAW264.7+for+osteoclastogensis+study%3A+Phenotype+and+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+tumor+necrosis+factor+alpha+mediates+an+increase+in+peripheral+CD11bhigh+osteoclast+precursors+in+tumor+necrosis+factor+alpha-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).</li>
<li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+p50+and+p52+expression+is+not+required+for+RANK-expressing+osteoclast+progenitor+formation+but+is+essential+for+RANK-+and+cytokine-mediated+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis.</a> The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcation+of+osteoclasts+and+dendritic+cells+from+common+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors.</a> Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest met behulp van OC's afgeleid en uitgebreid in vitro van PBMC's. De gebruikte CaP-gecoate celkweekplaten kunnen eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. Naast ongesorteerde PBMC's die in dit protocol zijn aangenomen, zijn OC's gegenereerd uit muizenmonocytencellen21 en beenmergmacrofaagcellen17 ook gekweekt ...

<a href="https://app.jove.com/t/6601">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/64016">10.3791/64016</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro</a>. The Protocol section was&#160;updated.

Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Osteoclasten (OC's) zijn weefselspecifieke macrofagen afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC's), die een cruciale rol spelen bij botremodellering samen met osteoblasten1. Door geslachtshormonen geïnduceerde, immunologische en kwaadaardige botaandoeningen die bot systemisch of lokaal vernietigen, zijn te wijten aan overmatige osteoclastische activiteit, waaronder menopauze-gerelateerde osteoporose2, reumatoïde artritis3, parodontitis4, myeloom botziekte5 en osteolytische botmetastase6. Daarentegen kunnen defecten in OC-vorming en -functie ook osteopetrose veroorzaken7. HSC's ondergaan differentiatie in OC-voorlopercellen onder macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF, gensymbool ACP5) stimulatie. In aanwezigheid van zowel M-CSF als receptoractivator van NF-κB ligand (RANKL, gensymbool TNFSF11) differentiëren OC-voorlopers verder in mononucleaire OC's en fuseren vervolgens tot multinucleaire OC's 8,9,10. Zowel cytokines M-CSF als RANKL zijn onmisbaar en voldoende voor inductie van osteoclastische markers zoals calcitoninereceptor (CT), receptoractivator van nucleaire factor κ B (RANK), protonpomp V-ATPase, chloridekanaal 7 alfa-subeenheid (CIC-7), integrine β3, tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP, gensymbool ACP5), lysosomale cysteïneproteasekatheline K (CTSK) en matrixmetaalepteptidase 9 (MMP9). Geactiveerde OC's vormen een afdichtingszone op het botoppervlak door de vorming van een actinering met een gegolfde rand11,12. Binnen de afdichtingszone bemiddelen OC's resorptie door protonen af te scheiden via de protonpomp V-ATPase12,13, MMP914 en CTSK15, wat leidt tot de vorming van lacunes.
Voor in vitro experimenten kunnen OC-voorlopercellen worden verkregen door uitbreiding van beenmergmacrofagen uit het dijbeen en scheenbeen van muizen16,17, evenals door isolatie van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit bloedmonsters en buffy coats 18,19,20, of door differentiatie van de vereeuwigde muriene monocytische cellen RAW 264.7 21,22.
In het huidige protocol beschrijven we een osteoclastische resorptietest in CaP-gecoate celkweekplaten met behulp van OC's afgeleid van primaire PBMC's. De CaP-gecoate celkweekplatenmethode die hier wordt gebruikt, is overgenomen en verfijnd van de methode die eerder is beschreven door Patntirapong et al.17 en Maria et al.21. Om OC-precursoren te verkrijgen, worden PBMC's geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en uitgebreid zoals eerder beschreven20.

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>35110</td><td>Zilvernitraat</td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM alpha, GlutaMAX, geen nucleosides</td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>Biochrom</td><td>03-028-1B</td><td>Amphotericin B Oplossing</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>Calcium chloride Dihydraat</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calcein</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>foetaal bovien serum</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Fixatie buffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>Paraformaldehyde</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>Zoutzuur</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>Recombinant Human M-CSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>Magnesium chloride</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>di-Natriumwaterstoffosfaat watervrij</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>Natriumchloride</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk</td><td>K15322429</td><td>Soda Bicarbonaat</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS zonder Calcium en Magnesium</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Penicilline-Streptomycine Mixtuur</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>Recombinant Human sRANK Ligand (Afkomstig van E.coli)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Alkyl Fenyl Polyethyleen Glycol</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td>Recombinant cel-dissociatie enzymen</td></tr></tbody></table>

een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Volwassen osteoclasten zijn multinucleaire cellen die bot kunnen afbreken door de afscheiding van zuren en enzymen. Ze spelen een cruciale rol bij verschillende ziekten (bijv. Osteoporose en botkanker) en zijn daarom belangrijke onderzoeksobjecten. In vitro kan hun activiteit worden geanalyseerd door de vorming van resorptieputten. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige pit assay methode met behulp van calciumfosfaat (CaP) gecoate celkweekplaten, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Osteoclastenprecursoren afgeleid van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) werden gekweekt op de gecoate platen in aanwezigheid van osteoclastogene stimuli. Na 9 dagen incubatie werden osteoclasten gefixeerd en gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming, terwijl de CaP-coating werd tegengekleurd door calceïne. Om het geresorbeerde gebied te kwantificeren, werd de CaP-coating op platen gekleurd met 5% AgNO3 en gevisualiseerd door brightfield-beeldvorming. Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ.

De calciumfosfaatcoating op de bodem van celkweekplaten werd uitgevoerd in twee coatingstappen bestaande uit een 3-daagse pre-calcificatie en een 1-daagse verkalkingsstap. Zoals te zien is in figuur 1, werd uniform verdeeld calciumfosfaat verkregen op de bodem van de 96-putplaten. De coating hechtte zeer goed aan de bodem na de uitgevoerde wasstappen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64016/64016f...

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Ons protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest. Het gebruik van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten kan eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. In tegenstelling tot ondoorzichtige bot- of dentineplakken, maakt de calciumfosfaatcoating visualisatie van resorptieputten en cellen tegelijkertijd mogelijk.In dit protocol gebruiken we PBMC's voor osteoclastische differentiatie. Het kan echter ook worden toegepast op andere celtypen zoals beenmerg afgeleide monocyten of Raw 264.7-cellen. Neem eerst een celkweekplaat met een platte bodem van 96 putjes en pipetteer 300 microliter eerder bereide calciumfosfaatoplossing in elke put.Bedek vervolgens de plaat met het deksel en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen. Zuig na drie dagen de pre-calcificatieoplossing op uit de voorverkalkte 96 putcelkweekplaten en voeg 300 microliter calciumfosfaatoplossing toe aan elke put. Bedek de borden met een deksel en incubeer een dag bij 37 graden Celsius.Keer vervolgens de plaat om om de oplossing uit te gieten en was de plaat driemaal grondig met gedeïoniseerd water. Droog de plaat onmiddellijk met behulp van een haardroger of gecomprimeerd kooldioxide- of stikstofgas om een uniform oppervlak te behouden. Bestraal nu de gecoate plaat op een schone bank met ultraviolette stralen gedurende een uur.Gebruik de gecoate plaat onmiddellijk of sluit de plaat af met Parafilm en bewaar deze bij kamertemperatuur. Verdun 15 milliliter vers bloed met een gelijk volume PBS en meng ze door meerdere keren om te keren of te pipetteren. Neem vervolgens 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing in een conische buis van 50 milliliter, kantel de buis en leg voorzichtig 30 milliliter verdund bloedmonster op de 15 milliliter dichtheidsgradiëntoplossing.Centrifugeer de buis later in een zwenkende emmerrotor zonder breuk op 810 keer G gedurende 20 minuten bij 20 graden Celsius. Zuig vervolgens de bovenste laag op en laat de mononucleaire cellaag ongestoord op het grensvlak. Breng de mononucleaire cellaag voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Vul de buis met PBS, meng en centrifugeer 300 maal G gedurende 10 minuten bij 20 graden Celsius. Suspensie PBMC's opnieuw in een complete alfa-MEM met 20 nanogram per milliliter macrofaagkoloniestimulerende factor en zaai 2,5 keer 10 tot de vijfde cel per centimeter vierkante PBMC's in een kolf. Incubeer de met calciumfosfaat gecoate platen met 50 microliter foetaal runderserum bij 37 graden Celsius gedurende één uur.Was vervolgens de kolf twee keer met PBS om de osteoclastenprecursoren los te maken van dode of niet-hechtende cellen en voeg vervolgens vier milliliter trypsine toe per kolf van 75 vierkante centimeter. Stop na 30 minuten de spijsvertering door vier milliliter volledige alfa-MEM toe te voegen en maak de cellen vervolgens voorzichtig los met behulp van een celschraper. Breng de cellen over in een buis van 50 milliliter en tel het totale aantal cellen met behulp van een telkamer.Centrifugeer de buis gedurende zeven minuten op 350 maal G om de cellen te pelleteren en de pellet opnieuw uit te geven en voltooi alfa-MEM met M-CSF en RANKL om één keer 10 tot de zes cellen per milliliter te krijgen. Zuig het foetale runderserum op uit de met calciumfosfaat beklede plaat en pipetteer 200 microliter celsuspensie per putje. Was de cellen na de incubatie twee keer met PBS.Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten en was opnieuw met PBS. Voeg voor kleuring permeabilisatiebuffer toe aan de vaste cellen en incubeer ze gedurende vijf minuten. Om de actinefilamenten te kleuren, incubeer je de cellen met 100 microliter Alexa Fluor 546 gelabelde falloïdine-oplossing in PBS gedurende 30 minuten, zuig je vervolgens de kleuringsoplossing op en kleur je de kernen met 100 microliter Hoechst gedurende 10 minuten.Kleur calciumfosfaatcoating met 100 microliter 10 micromolaire calceïne en PBS gedurende 10 minuten. Nadat u driemaal met PBS hebt gewassen, maakt u foto's. Voeg voor Von Kossa-kleuring van calciumfosfaatcoating 50 microliter 5% zilvernitraat en gedeïoniseerd water toe aan elke put en incubeer de plaat onder ultraviolette straling gedurende een uur totdat de coating op de bodem van de putten bruin is geworden.De calciumfosfaatcoating aan de onderkant van de 96 putplaten bleek uniform en goed gehecht. Na negen dagen kweek in M-CSF en RANKL op de met calciumfosfaat gecoate platen, vormden osteoclastenvoorlopers resorptieputten en grote osteoclasten. De multi-nucleated osteoclasten in de putten drukten hoge TRAP-niveaus uit.De volwassen osteoclasten vertoonden de aanwezigheid van drie of meer kernen en de duidelijke actinering. De groene calciumfosfaatcoating toonde de aanwezigheid van zwarte resorptieputten. De fluorescentiebeelden van het putgebied werden gemeten met behulp van de drempeltool van afbeelding J.Het aantal en de grootte van osteoclasten werden berekend met behulp van ROI-manager en de polygoonselectietool van afbeelding J.Osteoclasten'voorlopers gekweekt in afwezigheid van RANKL konden geen resorptieputten vormen, maar M-CSF en RANKL vergemakkelijkten de vorming van osteoclastogene putten.En het putgebied werd gekwantificeerd met behulp van afbeelding J.Onmiddellijk drogen van de gecoate plaat met luchtstroom helpt om een uniforme calciumfosfaatcoating te maken. Anders is het gevoelig om een dikkere coating in het midden van de put te vormen.

a-simple-pit-assay-protocol-to-visualize-quantify-osteoclastic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the tartrate-resistant acid phosphatase staining technique to detect the presence of TRAP-containing granules inside osteoclasts.  The technique forms magenta-colored dye granule deposits in the cytoplasm of osteoclasts, rendering them visible under an inverted microscope.

Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Staining: An In Vitro Technique to Detect TRAP Enzyme-Containing Cultured Osteoclasts

In this video, we describe an in vitro osteoclastic resorption assay on calcium phosphate-coated cell culture plates cultured with human peripheral blood mononuclear cell-derived osteoclasts. The osteoclasts form a characteristic actin ring on the calcium phosphate-coated matrix of the cell culture plate and degrade the matrix within the actin ring region to release calcium and phosphate ions, resulting in the formation of distinct resorption pits within the degraded matrix.

Resorption Pit Assay: An In Vitro Technique to Quantify Calcium Resorption Activity of Mature Osteoclasts using Calcium Phosphate-Coated Culture Plates

In this video, we describe a method for the detection of osteoblast-secreted calcium deposits using an anionic dye, Alizarin Red S. The cultured osteoblasts are first stained and then the dye is recovered for colorimetric quantification of calcium deposits or the degree of osteoblast mineralization.

In Vitro Mineralization Assay: A Colorimetric Method to Quantify Osteoblast Calcium Deposits on Bone Graft Substitute by Alizarin Red S Staining and Extraction

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Uranium is bekend dat het invloed op bot metabolisme. Hier presenteren we een protocol gericht op het onderzoeken van het effect van natuurlijk uranium blootstelling op de levensvatbaarheid, de differentiatie en de functie van osteoclasten, de cellen die verantwoordelijk is voor bot resorptie.

Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Leer een eenvoudig pittestprotocol voor osteoclastische resorptie met calciumfosfaat gecoate platen. Deze methode maakt gelijktijdige visualisatie van resorptieputten en cellen mogelijk.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Meer video's verkennen