Name: Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer osteoclasten isoleren uit muizenbeenmerg voor botbiologieonderzoek. Deze methode gebruikt dichtheidsgradiëntscheiding en TRAP-kleuring om grote hoeveelheden cellen betrouwbaar te verkrijgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de steun van NIH subsidies R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation en The Hagey Laboratorium voor Pediatrische Regenerative Medicine.

OPMERKING: ethische verklaring: Al het onderzoek waarbij gewervelde dieren werd uitgevoerd conform de protocollen door de Stanford administratieve Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) goedgekeurd. 1. Voorbereiding <ol><li> Laat 10 ml commercieel verkrijgbaar dichtheidsgradiënt celscheiding media (die polysucrose diatrizoaat en natrium bevat, aangepast aan een dichtheid van 1.077 g / ml) tot KT te komen in een 50 ml conische buis. </li><li> Bereid stroomcytometrie (FACS) buffer met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2% foetaal kalfsserum (FCS). Neem een ​​50 ml aliquot en deze hoeveelheid bij KT gebruik behouden tijdens de dichtheidsgradiënt celscheiding media stap. </li><li> Neem een ​​emmer ijs klaar om geïsoleerde weefsels en cellen in tijdens de isolatie procedure te handhaven. </li></ol> 2. Bereid Cultuur Media <ol><li> Bereid basale media: MEM (minimaal essentieel medium), zonder fenolrood (500 ml), glutamaat (1x), FCS (10x), 10.000 eenheden / ml penicillin (1x). </li><li> Filter basale media met een 0,22 urn filter. </li><li> Bereid beenmerg macrofagen inductie media: <ol><li> Breng 50 ml van de basale media bereid in stap 2.1. </li><li> Voeg prostaglandine E2 (PGE2, heer 352,465 g / mol) bij 10 -7 M uiteindelijke concentratie. </li><li> Add macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en 10 ng / ml. </li><li> Laat de uiteindelijke oplossing van het beenmerg macrofaag stimulerende media niet filteren. </li></ol></li><li> Bereiden van osteoclasten inductie media: <ol><li> Breng 50 ml van de basale media bereid in stap 2.1. </li><li> Voeg prostaglandine E2 (PGE2, heer 352,465 g / mol) bij 10 -7 M uiteindelijke concentratie </li><li> Add macrofaag-kolonie stimulerende factor (M-CSF) en 10 ng / ml. </li><li> RANKL voeg bij 10 ng / ml. </li><li> Laat de uiteindelijke oplossing van osteoclasten inductie media niet filteren. </li></ol></li></ol> 3. Bone Marrow Isolatie <ol><li> Euthanaseren een C57BL / 6 muiswaarbij kooldioxide inhalatie methode, gevolgd door cervicale dislocatie. OPMERKING: Knaagdieren moeten worden gedood door gekwalificeerd personeel met de juiste techniek, apparatuur en middelen. </li><li> Positie en zet de muis op een dissectie bord en spuit met 70% alcohol. </li><li> Ontleden scheen-, tibiae, opperarmbeenderen en wervelkolom. <ol><li> Begin met de muis in rugligging. Een insnijding verticaal langs de onderste ledematen en beginnen ontleden langs de lengte van het dijbeen en scheenbeen van delen zacht weefsel bijlagen. Tenslotte ontwrichten botten van de knie en het heupgewricht aan botten volledig te bevrijden van het skelet. </li><li> Overgaan tot een incisie langs de lengte van de bovenste ledematen aan de humerus te isoleren. Ontwrichten het opperarmbeen op de schouder en elleboog gewrichten door het ontleden van zacht weefsel capsulaire attachment. </li><li> Tot slot zet de muis over, zodat de muis ligt gevoelig. Voeg een incisie langs de lengte van de wervelkolom, in de middellijn. Let op de paravertebrale softweefsel aan elke zijde van de wervelkolom en incisielaken langs de benige rand van de wervelkolom, ontleden door de paravertebrale zachte weefselmassa. Met behulp van een schaar, maken een horizontale snede over de rug aan de basis van de hals, en aan het einde van de ruggengraat, net proximaal van de staart inbrengen bevrijdt de ruggengraat van zacht weefsel beslag. </li></ol></li><li> Zodra de botten worden geoogst, bewaar ze in FACS buffer op ijs. </li><li> Gebruik tissue om spieren en zacht weefsel te verwijderen van de botten. </li><li> Leg de schoongemaakte botten in een vijzel met 3 ml FACS buffer. </li><li> Plet de botten voorzichtig in de vijzel. </li><li> Zuig uit de met bloed bevlekte vloeistof en de overdracht in een 50 ml conische buis door het passeren van de oplossing door een 70 micrometer cel zeef. </li><li> Voeg 5 ml FACS buffer op de gemalen bot en verpletteren verder. Nogmaals, verwijder de vloeistof met behulp van een pipet en overgebracht in de 50 ml conische buis door middel van een 70 micrometer zeef. </li><li> Typisch plet de botten twice drie maal in vers FACS buffer, met een vijzel en stamper, telkens toevoegen van een verdere 5 ml vers FACS buffer, totdat de vloeistof vlekken rood. </li><li> Centrifugeer het beenmerg oplossing bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om een ​​celpellet verkregen. </li></ol> 4. Gradient Scheiding van beenmergcellen <ol><li> Zuig het supernatant en resuspendeer in 10 ml FACS buffer (gehandhaafd op RT). </li><li> Neem de 50 ml conische buis met 10 ml van commercieel verkrijgbaar dichtheidsgradiënt cel scheidingsmedium (RT). </li><li> Laag het beenmerg oplossing op de dichtheidsgradiënt celscheiding media. Doe dit langzaam met behulp van een elektrische pipet. Hoek de pipetpunt tegen het binnenoppervlak nabij de top van de conische buis en kantel de conische buis tot ongeveer 30 °. Een langzame snelheid op de pipet zachtjes verdrijven het beenmerg oplossing om niet de dichtheidsgradiënt celscheiding media verstoren. OPMERKING: Uiteindelijk zal erzijn een duidelijke afbakening tussen de twee oplossingen (mobiele oplossing en dichtheidsgradiënt- celscheiding media oplossing). </li><li> Met behulp van een centrifuge RT, centrifugeer de dichtheidsgradiënt celscheiding media en celoplossing evenwichtige centrifuge bij 200 xg gedurende 15 min. Bovendien, verwijdert versnelling en vertraging van de centrifuge om de adequate fasescheiding met de dichtheidsgradiënt celscheiding media gradiënt. </li><li> Na centrifugatie zuigen uit de troebele middelste laag die de beenmergcellen van belang bevat. </li><li> Transfer deze cellen in een nieuwe conische buis. Voeg 20 ml van aanvullende FACS buffer (op ijs gehouden) om de cellen te wassen. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om een ​​celpellet verkregen. </li><li> Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 1 ml van macrofaag stimulerend media om voor celtelling met een hemocytometer. </li></ol> 5. Celtelling <ol><li> Neem 10 pi van de celoplossing en meng10 pi trypan blauw. Belasting 10 ul van de verkregen mengsel op een hemocytometer en het verkrijgen van de celtelling per ml oplossing. </li></ol> 6. celkweek <ol><li> Plaats 2 ml van macrofaag stimulerende media in elk putje van een 24-well plaat. </li><li> Voeg 200.000 cellen in elk putje. OPMERKING: In onze ervaring, cel-plating dichtheid is een van de meest cruciale vereisten voor een adequate in vitro kweken van osteoclasten. </li><li> Schud voorzichtig de plaat en plaats in een reguliere incubator bij 37 ° C. </li><li> Laat de media niet veranderen voor 3 dagen. </li><li> Na 3 dagen in macrofaag stimulerende media, veranderen de media om osteoclasten media. </li><li> Hierna verandert de media dagelijks gedurende 5-7 dagen, op welk moment, moeten grote, meerkernige osteoclasten zichtbaar op de cultuur plaat zijn. </li></ol> 7. kleuring met Tartraat Resistente Acid fosfatase (TRAP) <ol><li> Na 5-7 dagen in vitro cultuur, zuigen de media uit de cultuur ook. </li><li> Was de putjes voorzichtig met 1x PBS drie keer. </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 4% paraformaldehyde oplossing en laat gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Gedurende deze tijd, bereid de TRAP vlek (dat commercieel verkrijgbaar) door voorverwarmen tot 37 ° C. </li><li> Na 1 uur in paraformaldehyde, zuigen off paraformaldehyde en was voorzichtig 3 keer met 1x PBS. </li><li> Voeg 1 ml voorverwarmde TRAP vlek in elk putje van de plaat wordt gekleurd. </li><li> Plaats de plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur, afgeschermd van licht. </li><li> Na 1 uur, zuigen uit de TRAP vlek. </li><li> Was de putjes 3 keer met voorverwarmde gedemineraliseerd water. </li><li> Tegenkleuring het goed met Gill&#39;s Hematoxylin (LET) voor 1-2 min. </li><li> Afbeelding osteoclasten behulp helderveld microscopie. </li><li> Was putjes met gedeïoniseerd water totdat voldoende kleurintensiteit van de vlek wordt bereikt, gewoonlijk als kernen verschijnen blue. </li></ol> 8. Osteoclast Resorptie Assay <ol><li> Gebruik een los verkrijgbare 24-well polystyreen cultuur schotel die vooraf bekleed met bot substraat of een anorganische kristallijne calciumfosfaat coating. </li><li> Plaats 2 ml van macrofaag stimulerende media in elk putje. </li><li> Voeg 200.000 vers geïsoleerde beenmerg aan het eind van stap 2 aan elk putje cellen. </li><li> Schud voorzichtig de plaat voorafgaand aan het plaatsen in een incubator bij 37 ° C gedurende 3 dagen. </li><li> Op dag 3, veranderen de media om de differentiatie van osteoclasten media. </li><li> Voer dagelijks media verandert met de differentiatie van osteoclasten media gedurende 5-7 dagen. </li></ol> 9. Het kwantificeren van Osteoclast Resorptie Activity <ol><li> Na 5-7 dagen in vitro kweek in osteoclastdifferentiatie media op gemineraliseerde substraat, analyseren de gemineraliseerde oppervlak, zoals hieronder beschreven, het vermogen van osteoclasten te vormen resorpti beoordelenop de installaties, een indicator van de osteoclastenactiviteit. </li><li> Zuig media uit de resorptie testplaat en voeg 100 ul van 10% bleekwater oplossing in elk putje. </li><li> Incubeer de cellen met 10% bleekmiddel oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de putjes 3 keer met gedestilleerd water. </li><li> Aspireren uit het resterende water en schud het overtollige water uit de plaat en laat aan de lucht drogen voor 3-5 uur. </li><li> Tegenkleuring de plaat met een in de handel verkrijgbaar Von Kossa kleuring kit zodat voor eenvoudiger visualisatie van de niet-geresorbeerd substraat. </li><li> Gebruik heldere veld microscopie om beelden van representatieve delen van het geresorbeerde oppervlak nemen. </li><li> Met beeldanalyse software berekent het percentage van het oppervlak geresorbeerd om voor kwantificering van osteoclastische resorptie activiteit. </li></ol>

<ol><li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption%3A+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+reports%22%5BJournal%5D)">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li>
<li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li>
<li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bench+to+bedside%3A+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li>
<li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li>
<li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+the+OPG%2FRANKL%2FRANK+system%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li>
<li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li>
<li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget%27s+Disease+of+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li>
<li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li>
<li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD%2FSCID+IL-2Rgamma%28null%29+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li>
<li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li>
<li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li>
<li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li>
<li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interleukin-6%2C+osteoclastogenesis%2C+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li>
<li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+among+cells+of+bone%2C+immune+system%2C+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica.%2C+%26+developmental+immunology%22%5BJournal%5D)">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).</li>
<li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+advances+in+hematolog.%2C+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).</li>
<li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft openbaarmaking of belangenverstrengeling te verklaren.

Een mogelijkheid om eenvoudig te isoleren en te kweken grote aantallen osteoclasten in vitro is verantwoordelijk voor het helpen om het begrip van botbiologie en osteoclasten gemedieerde ziekten vooruit geweest. Het was de identificatie van RANKL die leiden tot deze, wanneer het onlangs geïdentificeerd als de belangrijkste regulator van osteoclastvorming, differentiatie en overleving 16-18. Het is onze ervaring dat het in vitro kweken van osteoclasten uit beenmer...

Botremodellering is dynamisch en het gaat om de koppeling van botvorming met botresorptie 1. Dit strak gereguleerd proces is verantwoordelijk voor het skelet tijdens normale homeostase, en in reactie op letsel en ziekte. Osteoclasten zijn uniek, meerkernige cellen die in staat zijn resorbeerbare zowel de organische als anorganische matrices van bot. Osteoclasten zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg 2-5. Afwijkingen in de functie of vorming van osteoclasten kan resulteren in verschillende klinische aandoeningen, waaronder gemeenschappelijke aandoeningen zoals osteoporose. Het vermogen om osteoclasten in vitro genereren is toegestaan ​​aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van botbiologie 6. Daardoor worden nieuwe opkomende therapeutische middelen aan osteoclasten ziekten die verantwoordelijk zijn voor aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit behandelen 7 </sup&gt;. Homeostatische onderhoud van de botmassa en kracht vereist de gezamenlijke actie van botvormende osteoblasten en-botresorberende osteoclasten 8,9. Bothomeostase gewijzigd wordt een aantal ziekten, waaronder postmenopauzale osteoporose, waarbij verhoogde osteoclastische activiteit leidt tot pathogene verlies van botmassa en dichtheid 10. Met toenemende beschikbaarheid van transgene muismodellen voor humane ziekten, is er meer gelegenheid om de rol van de osteoclasten ontcijferen menselijke botziekte 11-13. Talrijke protocollen voor osteoclasten kweektechnieken verschijnen in de literatuur vele variaties beschreven 9,12,14. Xing en collega&#39;s beschrijven soortgelijke methodologie de hieronder beschreven in de beschrijving van osteoclastogenic assays van murine beenmergcellen protocol. Echter de beenmergcellen na lang bot oogst vrij, Xing et al. Spoel de mergholte met α-MEM compleet medium14. Catalfamo onderzoekt het effect van hyperglycemie op de functie van osteoclasten en beschrijft een werkwijze waarbij alle cellen gemobiliseerd beenmerg spoelen worden gedurende 24 uur, waarna de niet-hechtende cellen verwijderd 12, een techniek die ook door Boyle et al . 9 De eerder gepubliceerde protocollen vereisen het gebruik van spoelen van het beenmerg, een vervelende praktijk, die ook introduceert het risico van een naald prikt en verlies van waardevolle beenmerg, als een beide uiteinden van het bot moet snijden. Het protocol, dat we beschrijven implementeert het gebruik van een mortier en stamper om osteoclasten te isoleren, die vergelijkbaar is met de werkwijze beschreven door macrofaag isolatie Weischenfeldt et al. 15 Onze ervaring is echter dat osteoclast isolatie en in vitro kweek met eerder gepubliceerde technieken leidt tot variabele resultaten inzake osteoclast productie, vaak resulterendin een onvermogen te cultiveren osteoclasten. Daarom hebben we een protocol waarmee de consequente scheiding van muis beenmerg grote aantallen meerkernige osteoclasten in vitro produceren met een geschatte opbrengst van 70-80% van de cellen aanvankelijk vormen macrofagen uitgeplaat en vervolgens osteoclasten ontwikkeld in aanwezigheid van osteoclasten inductie media.

<table><tbody><tr><td>MEM, geen glutamine, geen fenol rood</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinante muis</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Muis TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli geëxprimeerd)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandine E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay botenresorptie platen, 24 wel platen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast afleiding van mouse bone marrow

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

<html> Osteoclasten zijn zeer gespecialiseerde cellen die zijn afgeleid van de monocyt / macrofagen van het beenmerg. Hun unieke capaciteit om zowel de organische als anorganische matrices bot resorberen betekent dat zij een belangrijke rol in de regulering skelet remodeling. Samen osteoblasten en osteoclasten zijn verantwoordelijk voor het dynamisch koppelen proces dat zowel botresorptie en botvorming gezamenlijk optreden om het normale skelet in gezondheid en ziekte handhaven omvat. Als belangrijkste botresorberende cellen in het lichaam, kunnen veranderingen in osteoclastdifferentiatie of functie leiden tot ingrijpende effecten in het lichaam. Ziekten geassocieerd met veranderde functie van osteoclasten kan in ernst variëren van dodelijke neonatale ziekte gevolg van het niet een merg ruimte hematopoiese vormen om vaker waargenomen aandoeningen zoals osteoporose, waarbij overmatige osteoclastische botresorptie predisponeert vorming breken. ent &quot;&gt; Het vermogen om osteoclasten te isoleren in hoge aantallen in vitro is toegestaan ​​aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van de botombouw cyclus en is de weg voor de ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën die deze ziekten te bestrijden verhard. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken osteoclasten uit muizen beenmerg dat grote aantallen osteoclasten oplevert.

<html> Het doel van deze methode gemakkelijk isoleren grote aantallen osteoclasten in vitro, typisch in een week. Succesvolle isolatie van grote aantallen osteoclasten werd bevestigd met behulp tartraat-resistent zuur fosfatase kleuring (Figuur 1A). Grote osteoclasten worden gevisualiseerd als grote paarse cellen met meerdere kernen (typisch ≥ 3 kernen). Met dit protocol, is het gebruikelijk om osteoclasten isoleren met maar liefst 30 kernen per osteoclast (Figuur 1B). <p cl...

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Het algemene doel van deze procedure is om osteoclasten in grote aantallen te isoleren uit het beenmerg van muizen. Dit wordt bereikt door eerst botten te verzamelen van geëuthaniseerde muizen. Vervolgens worden de cellen bevrijd uit het beenmerg door gebruik te maken van een vijzel en stamper om de botten te pletten in een factenbuffer.Vervolgens wordt de beenmerglossing in de dichtheidsgradiëntcelscheidingsmedium gelaagd en wordt dichtheidsgradiëntcelscheiding uitgevoerd. Uiteindelijk wordt de laag met de cellen van belang geaspireerd en worden de cellen in beenmergmacrofaag-inductiemedium geplaatst. Uiteindelijk wordt trapkleuring gebruikt om de aanwezigheid van een groot aantal osteoclasten te tonen.De implicaties van deze techniek reiken tot ziekten die geassocieerd zijn met veranderde osteoclastfunctie, die in ernst kunnen variëren van dodelijke neonatale ziekten als gevolg van het niet kunnen vormen van een beenmergruiimte voor hematopoëse tot vaker voorkomende pathologieën zoals osteoporose omdat het een betrouwbare methode produceert voor het isoleren van een groot aantal osteoclasten uit muizenbeenmerg. Om te beginnen, breng 10 milliliter van commercieel verkrijgbare dich

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate the isolation and culture of bone marrow stromal cells from the long bones of mice. The isolated adherent BMSCs can be used for further analysis.

Isolation and Culture of Bone Marrow Stromal Cells from a Mouse Tibia

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het huidige protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om zeer homogene beenmergmesenchymale stamcellen (BMSC's) van muizen te zuiveren, uit te breiden en te karakteriseren. Deze aanpak vergemakkelijkt de verwerving van grote hoeveelheden BMSC's met een hoog proliferatie- en differentiatiepotentieel, het ondersteunen van muismodellen en het bevorderen van preklinisch onderzoek.

Zuivering, expansie en op flowcytometrie gebaseerde fenotypering van van muizen afgeleide beenmergmesenchymale stamcellen

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

Leer osteoclasten isoleren uit muizenbeenmerg voor botbiologieonderzoek. Deze methode gebruikt dichtheidsgradiëntscheiding en TRAP-kleuring om grote hoeveelheden cellen betrouwbaar te verkrijgen.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Meer video's verkennen