Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow
6 november 2014
Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.
Het algemene doel van deze procedure is om osteoclasten in grote aantallen te isoleren uit het beenmerg van muizen. Dit wordt bereikt door eerst botten te verzamelen van geëuthaniseerde muizen. Vervolgens worden de cellen bevrijd uit het beenmerg door gebruik te maken van een vijzel en stamper om de botten te pletten in een factenbuffer.
Vervolgens wordt de beenmerglossing in de dichtheidsgradiëntcelscheidingsmedium gelaagd en wordt dichtheidsgradiëntcelscheiding uitgevoerd. Uiteindelijk wordt de laag met de cellen van belang geaspireerd en worden de cellen in beenmergmacrofaag-inductiemedium geplaatst. Uiteindelijk wordt trapkleuring gebruikt om de aanwezigheid van een groot aantal osteoclasten te tonen.
De implicaties van deze techniek reiken tot ziekten die geassocieerd zijn met veranderde osteoclastfunctie, die in ernst kunnen variëren van dodelijke neonatale ziekten als gevolg van het niet kunnen vormen van een beenmergruiimte voor hematopoëse tot vaker voorkomende pathologieën zoals osteoporose omdat het een betrouwbare methode produceert voor het isoleren van een groot aantal osteoclasten uit muizenbeenmerg. Om te beginnen, breng 10 milliliter van commercieel verkrijgbare dichtheidsgradiëntcelscheiding, medium naar kamertemperatuur in een 50 milliliter conische buis. Plaats een 50 milliliter aliquot faxbuffer bij kamertemperatuur om te gebruiken met het dichtheidsgradiëntcelscheidingsmedium.
Na het voorbereiden van aanvullende media en het euthanaseren van een C 57 zwarte zes muis, volgens het tekstprotocol, plaats de muis op een dissectiebord en gebruik 70%ethanol. Om het te besproeien, verzamel het fera tibia hum eye en de wervelkolom. Plaats vervolgens de botten in factenbuffer op ijs.
Vervolgens, met behulp van schoon tissuepapier, verwijder het spier- en zacht weefsel van de botten. Plaats de botten in een vijzel en stamper met drie milliliter factenbuffer en plet ze voorzichtig. Aspibeer vervolgens het bloedbevlekte vocht en laat het door een 70 micrometer zeef in een 50 milliliter conische buis lopen.
Voeg een extra vijf milliliter effectenbuffer toe aan het geplette bot en plet verder voordat je het vocht door de zeef in de 50 milliliter buis overbrengt. Ga door met dit proces tot het vocht niet meer rood kleurt voordat je het beenmerg bij 200 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bezinkt. Om een gradiëntscheiding uit te voeren, aspibeer de supernatanten van de celpellet en gebruik 10 milliliter faxbuffer om opnieuw te suspenderen.
Schors de pellet, kant de conische buis van kamertemperatuur dichtheidsgradiëntcelscheidingsmedium naar ongeveer 30 graden, en gebruik een elektrische pipet met de punt van de pipet tegen het binnenste oppervlak van de buis. Laag langzaam de beenmerglos op het medium met behulp van een centrifuge op kamertemperatuur zonder versnelling of vertraging. Draai de gradiënt bij 200 Gs gedurende 15 minuten.
Aspibeer vervolgens de troebele middelste laag, die de cellen van belang bevat, en breng deze over in een nieuwe conische buis. Voeg 20 milliliter ijskoud faxbuffer toe om de cellen te wassen. Gebruik vervolgens één milliliter beenmergmacrofaag stimulerend medium om de uiteindelijke celpellet op te schorsen na celtelling.
Plaats twee milliliter macrofaag stimulerend medium in elke put van een 24-welplaat. Voeg vervolgens 200.000 cellen toe aan elke put, een celdichtheid die zorgt voor adequaat in vitro osteoclastcultuur. Schud de plaat voorzichtig en incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius zonder het medium te verversen.
Na de derde dag, verander het medium in beenmergosteaclastinductiemedium en begin het dagelijks te verversen gedurende vijf tot zeven dagen. Op dat moment zouden grote multinucleaire osteoclasten zichtbaar moeten zijn. Raadpleeg het tekstprotocol voor kleuring en de resorptietest zoals hier gezien.
Een hoog aantal osteoclasten kan worden bevestigd met behulp van tartraat resistente assay. Fosfotaten kleuring van osteoclasten wordt gevisualiseerd als grote paarse cellen met meerdere kernen volgens het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd. Het is gebruikelijk om osteoclasten te isoleren met maar liefst 30 kernen per cel.
Het gebruik van een gemineraliseerd oppervlak wordt beschouwd als de gouden standaardmethode voor het beoordelen van osteoclastische resorptieactiviteit in vitro. In deze figuur toont helderveldmicroscopie bij 10x vergroting een percentage gemineraliseerd oppervlak of resorptieputten die zijn gevormd zoals aangegeven in zwart, wat de bepaling van osteoclastische resorptiecapaciteit mogelijk maakt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u op betrouwbare wijze een groot aantal osteoclasten uit muizenbeenmerg kunt isoleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van osteoclasten uit muisbeenmerg in grote hoeveelheden. Het proces omvat het verzamelen van botten, het bevrijden van cellen en het gebruik van dichtheidsgradiëntscheiding om osteoclasten te verkrijgen voor verder onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Botbiologie
- Celisolatietechnieken
- Kwantificering van osteoclastactiviteit
Achtergrond
- Osteoclasten zijn essentieel voor botresorptie.
- Begrip van osteoclastbiologie is cruciaal voor inzichten in botziekten.
- Isolatietechnieken hebben de studie van deze cellen gevorderd.
- Dit protocol beoogt de opbrengst van osteoclasten voor onderzoek te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om osteoclasten uit muisbeenmerg te isoleren.
- Om osteoclasten in vitro te cultiveren voor experimentele analyse.
- Om osteoclastactiviteit te kwantificeren met behulp van specifieke kleuringsmethoden.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van botten van geëuthaniseerde muizen.
- Botten verpletteren in factis buffer om cellen te bevrijden.
- Uitvoeren van dichtheidsgradiëntcelscheiding.
- Gebruik van beenmergmicrofaag-inductiemedium voor celkweek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van osteoclasten in grote aantallen.
- Effectieve cultivatie van osteoclasten in vitro.
- Aantoonbaarheid van osteoclastaanwezigheid door trapkleuring.
- Kwantificering van osteoclastactiviteit bereikt.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor osteoclastisolatie.
- Het faciliteert verder onderzoek naar osteoclastbiologie.
- Mogelijke toepassingen bij het bestuderen van botgerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable in vitro derivation of osteoclasts from mouse bone marrow enables high-confidence interrogation of bone resorption mechanisms and disease-relevant cellular phenotypes. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in early-stage bone disease drug discovery. The method supports portfolio decisions by providing scalable access to functional osteoclasts for quantitative assessment of therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of bone resorption hypotheses in a controlled system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating osteoclast-specific effects.
- Facilitates functional target validation for bone disease pathways.
- Provides a platform for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Generates validated osteoclast populations for downstream resorption assays.
- Enables standardization of quantitative TRAP staining and resorption pit assays.
- Supports reproducible, scalable workflows for compound screening.
- Allows for robust evaluation of osteoclast-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro osteoclast function with disease-relevant bone remodeling endpoints.
- Provides continuity from cellular mechanism to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted therapeutic candidates.
- Supports translational biomarker development for bone resorption activity.
Pipeline & Workflow Integration
This osteoclast derivation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational studies in bone biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of osteoclast-mediated bone resorption mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for compound or genetic screening.
- Analytics: Enables measurement of multinucleation, TRAP positivity, and resorptive capacity for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo bone remodeling and disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for osteoclast isolation across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in bone resorption target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible osteoclast cultures at scale.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality for bone disease programs by reducing biological ambiguity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of osteoclast-targeted therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and bone marrow handling.
- Needs access to density gradient separation and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of TRAP staining and resorption assays.
- May require adaptation for different mouse strains or disease models.
- Dependent on careful quantification and validation of osteoclast identity and function.
