Gestandaardiseerde verwerking voor formaline-vaste, paraffine-ingebedde cel pellet immunohistochemische controles

Goed gekarakteriseerde positieve en negatieve celpelletcontroles met gedefinieerde eiwit- of transcriptexpressieniveaus zijn essentieel voor het ontwikkelen van immunohistochemische assays. Dit protocol beschrijft een proces voor het maken en verwerken van formule vaste, paraffine-ingebedde cel pellet controles. Dergelijke controles kunnen worden gebruikt om de bindingsspecificiteit te karakteriseren tijdens het ontwikkelen van een nieuwe immunohistochemische test.

IHC-assays zijn van cruciaal belang voor onze ontdekkings- en biomarkerontwikkelingsinspanningen in therapeutische gebieden, en het ontwikkelen van gevalideerde controles is essentieel voor het ontwikkelen van deze assays. Het is essentieel om de gel op basis van hydroxyethyl agarose te verwarmen tot ten minste 40 graden Celsius voordat u deze aan de celpellet toevoegt. De gel moet goed worden gemengd met de cellen voordat deze stolt.

Begin met de fixatie van de 293T-cel pellet door 30 milliliter 10% neutraal gebufferd formaline toe te voegen aan een drie milliliter cel pellet om een 10 op één fixatieve tot cel verhouding te creëren. Resuspendeer de cellen door herhaaldelijk de goed afgedekte buis van 50 milliliter om te keren en laat ze 's nachts bij kamertemperatuur bezinken. Om de fixatie te verbeteren, verhoogt u de verhouding tussen oppervlak en volume door de buis de volgende dag om te keren en de cellen te resuspenderen.

Na 24 uur fixatie, centrifugeer de buis op 930 maal G bij vijf graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Zorg ervoor dat de celpellet zichtbaar is en verwijder het fixatiemiddel door het te decanteren of voorzichtig te aspirateren met een steriele transferpipet. Voeg gesmolten hydroxyethyl agarose gebaseerde gel toe bij 40 tot 60 graden Celsius aan de pellet in een één tot vier gel/cell pellet verhouding.

Gebruik een schone vijf inch en twee millimeter tip sterling sonde met een oog gespoeld met kraanwater om de inhoud van de 50 milliliter conische buis voorzichtig te roeren, waardoor een gelijkmatige suspensie van vaste cellen in de gesmolten gel aan de onderkant ontstaat. Nadat de vaste cellen gelijkmatig in de gesmolten gel zijn gesuspendeerd, sluit u de kroniekbuis af en plaatst u deze gedurende vijf tot 10 minuten op het natte ijs. Zodra de gelpellet is gestold, plaatst u voorzichtig een schone microspatula langs de zijkant van de buis en gebruikt u de pellet voorzichtig zonder deze te doorboren.

Leg de gestolde pellet op het biopsiepapier. Gebruik een schone microspatula om de celpellet in vier tot vijf millimeter dikke plakken te snijden om in een weefselcassette van 26 millimeter bij 26 millimeter bij vijf millimeter te passen. Plaats individuele plakjes gelpellet in het midden van een stuk biopsiepapier.

Vouw de twee tegenover elkaar liggende zijden en wikkel het plakje in papier voordat je het in een tissuecassette van 26 bij 26 bij vijf millimeter plaatst. Sluit het deksel. Plaats de bijgesneden celpelletcassette in de retort van de weefselprocessor gevuld met 10% neutraal gebufferd formaline en voer een kort verwerkingsschema uit.

Voor het insluiten van de celpellet plaatst u de verwerkte cassettes in het bewaargebied van het insluitcentrum. Open het deksel van de tissuecassette en vouw het biopsiepapier voorzichtig open. Plaats de celpellet in een kleine wegwerpvorm van 15 bij 15 millimeter in gesneden kant naar beneden.

Terwijl u de celpellet voorzichtig met een tang in de bodem van de mal houdt, voegt u 62 graden Celsius weefselinfiltratie toe of integreert u paraffine in de mal, waardoor de celpellet wordt bedekt. Verplaats de vorm naar een koud blok om de paraffine te stollen. Pas de celpellet aan terwijl de paraffine stolt en bevestig deze op de juiste positie aan de onderkant van de mal.

Verwijder het deksel van de cassette. Plaats de cassette onderzijde naar beneden op de insluitvorm en voeg extra gesmolten paraffine toe om de cassette te bedekken. Wanneer paraffine over de weefselcassette is gevuld, brengt u de mal terug naar het koude blok voor stolling.

Pak de paraffinesecties die met behulp van de roterende microtoom zijn bereid uit het flotatiebad op positief geladen dia's. Plaats het eerste gedeelte bovenaan de dia binnen de afdekslip en de vlekgrens en plaats de volgende secties serieel als een onder de andere. Als je klaar bent, droog je de dia's eerst op 23 graden Celsius gedurende 24 uur, daarna op 60 graden Celsius gedurende 30 minuten.

De ingebedde celpellet bereid met behulp van deze methode vertoonde een gelijkmatige celverdeling door de sectie, met minimale celklontering en interacties in de pellet. Wanneer immunolabeling werd gevisualiseerd met het bruine diaminobenzeen, chromogeen en drie cellijnen, werden verschillende niveaus van de TEAD-transcriptiefactorexpressie waargenomen in de kern, variërend van nee, tot zwak, tot de sterke expressie. Door de celpellets in een microarray op te nemen, konden controles met verschillende expressieniveaus in dezelfde dia worden geëvalueerd zonder variatie in de procedures.

Zoals in dit voorbeeld wordt getoond, kan negatieve controle van PEG 10-deficiënte embryonale stamcellen van muizen en positieve controle van 293T-cellen die PEG 10 overexpressie vertonen, worden gezien. Door ervoor te zorgen dat cellen adequaat worden gefixeerd en homogeen door de gelpellet worden verdeeld, ontstaat een uniforme gestandaardiseerde testcontrole. De celpellets kunnen worden gebruikt als controles in downstream immunohistochemie en NC2-hybridisatietests met standaard antigeen ophaal- en etiketteringsmethoden.

Celpelletcontroles hebben de ontwikkeling van veel immunohistochemische testen mogelijk gemaakt, met name voor nieuwe of minimaal gekarakteriseerde eiwitten. Ze dienen als goed gedefinieerde controles die kunnen helpen bij het karakteriseren van antilichaamspecificiteit.