Name: Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer fluorescente live-beeldvorming van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxiden in HeLa-cellen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale dysfunctie in neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de leden van het Evans-lab voor hun doordachte feedback op dit manuscript. Dit werk wordt ondersteund door Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars en Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figuur 1A is gemaakt met behulp van BioRender.com.

Kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li>
<li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MAVS%2C+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122 (5), 669-682 (2005).</li>
<li>Tait, S. W. G., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell signalling.</a> Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).</li>
<li>Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).</li>
<li>Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+complex+role+of+mitochondria+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease.</a> Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).</li>
<li>Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Parkinson%27s+disease%3A+clinical%2C+molecular%2C+and+translational+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects.</a> Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+in+the+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+of+Parkinson%27s+disease+in+204+countries%2Fterritories+from+1990+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019.</a> Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).</li>
<li>Martinez-Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mitophagy+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).</li>
<li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li>
<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+zone%3A+mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin zone: mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+compromised+by+PD-associated+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations.</a> Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).</li>
<li>Kane, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+phosphorylates+ubiquitin+to+activate+Parkin+E3+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).</li>
<li>Koyano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+is+phosphorylated+by+PINK1+to+activate+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin.</a> Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+roles+of+PARKIN+and+ubiquitin+phosphorylation+by+PINK1+in+mitochondrial+quality+control+using+a+ubiquitin+replacement+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveal+a+feedforward+mechanism+for+mitochondrial+PARKIN+translocation+and+ubiquitin+chain+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis.</a> Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).</li>
<li>Kitada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+parkin+gene+cause+autosomal+recessive+juvenile+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism.</a> Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).</li>
<li>Valente, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK6+is+a+common+cause+of+familial+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PARK6 is a common cause of familial parkinsonism.</a> Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Sriram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial-associated+mutations+differentially+disrupt+the+solubility%2C+localization%2C+binding+and+ubiquitination+properties+of+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin.</a> Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).</li>
<li>Vives-Bauza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+recruitment+of+Parkin+to+mitochondria+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).</li>
<li>Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optineurin+is+an+autophagy+receptor+for+damaged+mitochondria+in+parkin-mediated+mitophagy+that+is+disrupted+by+an+ALS-linked+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).</li>
<li>Bertolin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+maintains+mitochondrial+levels+of+the+protective+Parkinson%27s+disease-related+enzyme+17-beta+hydroxysteroid+dehydrogenase+type+10%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10.</a> Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+production+under+cellular+stress%3A+comparison+of+different+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).</li>
<li>Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+and+activation+of+ALS-associated+TBK1+with+its+target+optineurin+are+required+for+efficient+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).</li>
<li>Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+engulfed+mitochondria+is+rate-limiting+in+Optineurin-mediated+mitophagy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons.</a> eLife. 9, e50260(2020).</li>
<li>Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FuGENE+6+Transfection+Reagent%3A+the+gentle+power%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power.</a> Methods. 33 (2), 104-112 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).</li>
<li>Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats.</a> Shock. 39 (3), 304-310 (2013).</li>
<li>Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%3A+mitotracker+probes+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential.</a> Shock. 39 (6), 543(2013).</li>
<li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li>
<li>Pavel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+controls+cell+survival+and+proliferation+via+YAP%2FTAZ-autophagy+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis.</a> Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).</li>
<li>Rossignol, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).</li>
<li>Schornack, P. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+cell+metabolism+and+H%2B+diffusion+to+the+acidic+pH+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors.</a> Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).</li>
<li>Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+based+assays+for+the+measurement+of+apoptosis-associated+mitochondrial+membrane+depolarisation+and+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release.</a> Methods. 61 (2), 138-145 (2013).</li>
<li>Muller, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+extracellular+flux+analysis+for+determining+mitochondrial+function+in+mammalian+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncoupling%3A+a+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795(2019).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism and diabetes.</a> Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).</li>
<li>Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondria+in+neurodegenerative+diseases%3A+mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectrums%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).</li>
<li>Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances.</a> Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).</li>
<li>Middleton, P., Vergis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+liver+disease%3A+role%2C+relevance%2C+and+potential+for+therapeutic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation.</a> Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen aan te geven.

De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming30. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-ParkinWT of YFP-ParkinT240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te ...

Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie1, aangeboren immuniteit2,3 en celsignalering 4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft8. PD is genetisch gekoppeld aan mitofagie, een mitochondriale kwaliteitscontroleroute die nodig is voor het handhaven van cellulaire homeostase die selectief beschadigde mitochondriën verwijdert 9,10. Studies hebben meerdere onafhankelijke mitofagieroutes geïdentificeerd, waaronder het FUN14-domein met 1 (FUNDC1) -gemedieerde mitofagie, Bcl-2 interagerende eiwit 3 (BNIP3) -gefaciliteerde mitofagie, NIX-afhankelijke mitofagie en de goed gekarakteriseerde PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) / Parkin-gereguleerde mitofagie10,11. PINK1 (een vermeend kinase) en Parkin (een E3 ubiquitine ligase) werken samen met fosfo-ubiquitinaat beschadigde mitochondriën, die de vorming van autofagosomen aandrijft die het beschadigde organel overspoelen en fuseren met lysosomen om de afbraak te initiëren 12,13,14,15,16. Mutaties in Parkin zijn in verband gebracht met PD-gebonden fenotypes zoals neurodegeneratie via het verlies van dopaminerge neuronen17,18.
Hier wordt een protocol beschreven waarin HeLa-cellen, routinematig gebruikte onsterfelijke cellen afgeleid van baarmoederhalskanker, worden gebruikt om de rol van Parkin bij het handhaven van mitochondriale netwerkgezondheid te onderzoeken. HeLa-cellen drukken verwaarloosbare niveaus van endogene Parkin uit en vereisen daarom exogene Parkin-expressie19. Om de rol van Parkin in de gezondheid van mitochondriale netwerken te bestuderen, worden HeLa-cellen getransfecteerd met wild-type Parkin (ParkinWT), een Parkin-mutant (ParkinT240R) of een lege controlevector. ParkinT240R is een autosomaal recessieve juveniele parkinsonismemutatie die de Parkin E3-ligaseactiviteit beïnvloedt, waardoor de efficiëntie van de mitofagieroute aanzienlijk wordt verminderd20. HeLa-cellen zijn onderhevig aan milde (5 μM) of ernstige (20 μM) concentraties van carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Behandeling met ernstige concentraties CCCP wordt routinematig gebruikt om parkine-gemedieerde mitofagie te induceren in verschillende cellijnen, zoals HeLa- en COS-7-cellen21,22,23.
Na de behandeling maakt het protocol gebruik van live beeldvorming van het mitochondriale netwerk met behulp van twee momenteel beschikbare mitochondriale gerichte fluorescerende kleurstoffen. Tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE) is een kationische kleurstof die fluoresceert op basis van mitochondriaal membraanpotentiaal24, terwijl MitoSOX een mitochondriale superoxide-indicator is waarbij de fluorescentie-intensiteit een functie is van superoxideconcentratie25. Ten slotte maakt het geschetste protocol gebruik van een op fluorescentie gebaseerde kwantificering en eenvoudige workflow om het mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren met minimale ruimte voor gebruikersbias. Hoewel dit protocol is ontworpen om de mitochondriale functie in HeLa-cellen te bestuderen, kan het worden aangepast voor extra cellijnen en primaire celtypen om de mitochondriale netwerkgezondheid kwantitatief te karakteriseren.

<table><tbody><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCCP (carbonyl cyanide m-chlorofenylhydrazon)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) met 4,5 g/L glucose</td><td>Gibco</td><td>11-965-084</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 (transfectie reagens)</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine oplossing)&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&nbsp; Red&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (gereduceerde serum media)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchloraat (TMRE)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Experimentele modellen: Organismen/soorten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-M (Homo sapiens)</td><td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EYFP lege vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin T240R</td><td>Dit artikel</td><td>Gemaakt door middel van plaatsgerichte mutagenese vanuit YFP-Parkin</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin WT</td><td>Addgene; PMID:19029340</td><td>RRID:Addgene_23955</td><td></td></tr><tr><td>Software en algoritmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe Inc.</td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td><td>(Schindelin, 2012)</td></tr><tr><td>Excel (spreadsheetsoftware)</td><td>Microsoft Office&nbsp;</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td>https://www.microsoft.com/excel</td><td></td></tr><tr><td>Prism9 (statistische analysesoftware)</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schaal, Nr. 1.5 Dekglas, 20 mm glazen diameter, ongecoat</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Cage Incubator (milieukamer)</td><td>Okolab</td><td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td><td></td></tr><tr><td>DMiL Inverted Microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LIGHTNING Deconvolutiesoftware</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>STELLARIS 8 confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in hela-cellen

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (ParkinT240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.

In dit protocol werd op fluorescentie gebaseerde kwantificering gebruikt om de membraanpotentiaal en superoxideniveaus van het mitochondriale netwerk te meten na CCCP-behandeling (figuur 1). Deze workflow gebruikte HeLa-cellen, een vereeuwigde cellijn afgeleid van baarmoederhalskanker. HeLa-cellen worden routinematig gebruikt om mitochondriale biologie te bestuderen en zijn relatief vlak, waardoor het gemakkelijk is om het mitochondriale netwerk te visualiseren met behulp van microscopie. Om...

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Dit onderzoek richt zich op mitochondriale ontregeling bij neurodegeneratieve ziekten. Wij geloven dat dit onderzoek kan worden gebruikt om mogelijke oorzaken voor het begin van de ziekte te begrijpen die kunnen leiden tot therapieën die neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson en ALS bestrijden. Technieken zoals superresolutiemicroscopie zoals STED en SIM of expansiemicroscopie hebben het vermogen verbeterd om de eiwitverdeling binnen individuele organellen en mitochondriale distributie door de cel nauwkeurig te begrijpen.Resultaten van deze techniek kunnen worden gebruikt als uitgangspunt om het effect van aan de ziekte van Parkinson gekoppelde mutaties op mitochondriale omzet te bestuderen en het belang te begrijpen van het reguleren van reactieve zuurstofsoortenniveaus en mitochondriaal membraanpotentieel om de neuronale gezondheid te behouden. Ons laboratorium heeft tot doel om individuele mitochondriale kwaliteitscontrolepaden mechanistisch te karakteriseren om het samenspel tussen deze paden te begrijpen. Door inzicht te hebben in de dynamiek van de route, kan men begrijpen hoe mitochondriën worden onderhouden en hoe mitochondriale ontregeling bijdraagt aan het ontstaan van neurodegeneratieve ziekten.

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.

Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of In Vivo

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 ', 7'-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Dit artikel schetst een protocol voor de detectie van een of meer plasma en/of intracellulaire membraaneiwitten grondtoestand uitputting (GSD) Super resolutie microscopie met zoogdiercellen. Hier bespreken we de voordelen en de overwegingen van het gebruik van dergelijke benaderingen voor de visualisatie en de kwantificering van cellulaire eiwitten.

Super resolutie beeldvorming van de uitputting van de grondtoestand in zoogdiercellen

Leer fluorescente live-beeldvorming van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxiden in HeLa-cellen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van mitochondriale dysfunctie in neurodegeneratieve ziekten.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen (Video) | JoVE Journal

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Meer video's verkennen