Name: Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Leer hoe u mitochondriale calciumdynamiek in levende cellen monitort met de genetisch gecodeerde indicator ratiometric pericam-mt. Deze methode maakt real-time fluorescentiebeeldvorming en kwantitatieve analyse van calciumfluxen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Atsushi Miyawaki bedanken voor het verstrekken van ons de ratiometrische-pericam-mt expressie-construct. Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​GM081685 van de National Institutes of Health (DB).

1. Pericam-mt Transfectie en Cell voorbereiding. <ol><li> Plaat HeLa cellen de nacht voor transfectie op steriele glazen dekglaasjes geplaatst in een standaard 6-well cultuur plaat. </li><li> Bereid DNA / Lipofectamine 2000 complexen zoals voorgesteld door de fabrikant (Invitrogen). We maken gebruik van 4 ug van ratiometrische-pericam-mt expressievector en 10 pi van Lipofectamine 2000 verdund in 0,5 ml van de Opti-MEM voor elk putje. De cellen moeten ~ 70% confluent voor transfectie zijn. </li><li> Vervang HeLa cultuur media (Dulbecco's gewijzigd adelaars medium, 10% FBS, penicilline / streptomycine) in elk putje met 1,5 ml van dezelfde media zonder antibiotica. </li><li> Voeg de DNA / Lipofectamine complexen aan elk putje te worden getransfecteerd. Meng voorzichtig met schommelen en incubeer gedurende 4 uur in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Vervang de antibiotica-vrije media met de cultuur media met antibiotica. Laat cellen om ratiometrische pericam te uiten voor 1-2 dagen voor de beeldvorming. </li></ol> 2. Microscoop Setup en Image Acquisition <ol><li> Plaats een dekglaasje met HeLa cellen in een geschikte beeldvormende kamer met imaging-oplossing: 107mm NaCl, KCl 7.2mm, 1.2mm MgCl2, 1 mM CaCl2, 11.5mm glucose, 0,1% bovine serum albumine, en 20mm HEPES 7.2. Ons laboratorium maakt gebruik van de Attofluor cel kamer van Invitrogen. Monteer de beeldvorming kamer in een omgekeerde microscoop podium. </li><li> Zoek een gebied van belang die een of meer cellen die ratiometrische pericam met behulp van een 40x (of hoger) olie-immersie objectief. We hebben ontdekt dat ratiometrische pericam is minder bestand tegen fotobleken bij 380 nm, en dus gebruiken we deze golflengte om geschikte cellen te identificeren. Voor de beelden die in figuur 1, was een Nikon Superfluor 40X objectief met een 1,3 numerieke apertuur gebruikt. Hogere vergroting doelstellingen zou passend zijn ook (60-100x). Gebruikte excitatie filters werden Chroma Technology filters D380/30x (380 + / - 30 nm) en D495/10 (495 + / - 5 nm), beamsplitter was 505DCXR (505nm longpass), en de emissie filter was HQ535/50m (535 + / - 25Nm). Onze microscoop gebruikt om de afbeeldingen in figuur 1 bestaat uit een Nikon TE2000 omgekeerde microscoop uitgerust met een Roper Scientific Coolsnap HQ gekoelde CCD-camera, Ludl MAC6000 snelle filter wiel en de wisselaar, en een MetaFluor data acquisitie en analyse software. Dit protocol kan worden aangepast aan elke standaard wide-field microscoop met de juiste filters en software in staat is van het vastleggen en verwerken van ratiometrische afbeeldingen. </li><li> Het opzetten van de software voor dual excitatie het gebruik van de 495 en 380 nm filters. Calcium binding aan ratiometrische pericam verhoogt absorptie bij 495 nm, waardoor de verhouding moet worden ingesteld om te worden 495 nm/380 nm. Ratiometrische pericam heeft een calcium-vrije excitatie piek bij 415 nm 4. In dit protocol adviseren wij het gebruik van een 380 nm filter alleen omdat het alomtegenwoordig is in de meeste calcium imaging laboratoria. Als een 410 nm filter beschikbaar is, verdient het de voorkeur om de 380 nm filter. </li><li> Acquire beelden achter elkaar door afwisselend spannend 495 en 380 nm. Acquire beelden van baseline calcium waarden voor ten minste 30 s voor de toepassing van de agonist via een perfusie apparaat. Markeer de toevoeging voor elke agonist. Belichtingstijden en acquisitie intervallen moet worden geoptimaliseerd om te voorkomen dat fotobleken terwijl die voldoende tijd resolution.For voorbeeld, voor semi-snelle calcium dynamiek gevolgd in reactie op agonist stimulatie, werden beelden die elke twee seconden in de figuren 1B en C. Veel sneller overname tarieven zijn ook mogelijk 6. Op lange termijn imaging na staurosporine toediening werd verworven met een langere interval (30 sec) tussen overnames (Figuren 1 D en E). </li></ol> 3. Image Processing and Analysis <ol><li> Zodra het experiment is voltooid, kan worden verkregen beelden worden geanalyseerd offline. Definieer de regio's of interest (ROI) in die u wilt veranderingen in de calcium-spiegels te controleren. Gebruik een ROI geselecteerd in een leeg gebied van het veld op de achtergrond af te trekken indien nodig. Opgemerkt moet worden dat de mitochondriën zijn zeer beweeglijk en dynamisch, en het extrapoleren van evenementen in een mitochondrion gedurende langere perioden is het niet altijd mogelijk. Dus, gezien de hoge beweeglijkheid van dit organel in sommige celtypes, moet de selectie van ROI zorgvuldig worden gecontroleerd. Bovendien, zoals blijkt uit figuur 1, mitochondria reactie heterogeen op verschillende stimuli. Het is daarom belangrijk te analyseren data offline en RO1 plaatsing op een frame-by-frame basis te controleren. Een gedetailleerde beschrijving van het meten van mitochondriale calcium in zeer beweeglijke mitochondria is elders 7 beschreven. </li><li> Verkregen verhouding metingen van de ROI kan worden geïmporteerd in Excel of vergelijkbare graphingsoftware. De gegevens kunnen worden gepresenteerd als een trace die veranderingen in de mitochondriale calcium niveaus in een enkele cel of een mitochondrion, of gemiddeld fluorescence signalen van verschillende ROI. We hebben ook gebruik gemaakt van deze techniek gemiddelde mitochondriale calcium niveaus in een populatie van lymfocyten ondergaan apoptose geïnduceerd door Fas ligand 8 te meten. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (A) subcellulaire lokalisatie van ratiometrische-pericam-mt. Deze eerste afbeelding toont live HeLa cel die ratiometrische-pericam-mt. De tweede afbeelding toont fluorescerende kleuren met mitochondrion-selectieve kleurstof MitoTracker Red CMXRos. De gele fluorescentie in de samengevoegde afbeelding toont co-lokalisatie van ratiometrische-pericam-mt en MitoTracker fluorescentie. (B) Een reeks van pseudocolor ratio (495:380 nm) beelden van de vier HeLa cellen die mt-ratiometrische pericam die werden behandeld met 10 mM ATP . (C) Kwantificering van veranderingen in de mitochondriale calcium niveaus in de regio van belang (ROI), vermeld in (B) die werden behandeld met 10 mM ATP. (D)-serie van pseudocolor ratio (495:380 nm) beelden van een HeLa cel die mt -ratiometrische pericam behandeld met 0,5 uM staurosporine. Heterogeniteit in de calcium-respons in de afzonderlijke mitochondriën is evident, evenals sterke versnippering van de mitochondria met 60 minuten. Sommige mitochondriën hebben oscillerende toename van de calcium (witte pijlpunt), terwijl anderen geen significante veranderingen in de calcium-niveau (gele pijl hoofd). (E) Kwantificering van de toename van de wereldwijde mitochondriale calcium niveau in een HeLa cel na inductie van apoptose met 0,5 uM staurosporine.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

Hier presenteren wij een zeer eenvoudige methode voor het meten van mitochondriale calcium met behulp van mitochondriaal-gerichte ratiometrische pericam. Zoals weergegeven in Figuur 1A, met behulp van standaard groothoek optiek met geen deconvolutie is het mogelijk om gemakkelijk de individuele mitochondria bekijken in HeLa cellen met acceptabele signaal-ruisverhouding. Dit komt omdat HeLa cellen, zoals de meeste cellen in cultuur, significant plat wanneer aanhanger wegnemen van de noodzaak voor confocale microscopie of andere gespecialiseerde apparatuur. Wij hebben gevonden soortgelijke resultaten in Jurkat cellen gehandeld op grond van poly-lysine gecoate dekglaasjes 8. In tegenstelling tot de methodes met behulp van kleurstoffen, is het ook mogelijk om niet-invasieve mitochondriale calcium-monitor voor uren gebruik van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals ratiometrische pericam (figuur 1E). Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van mitochondriale calcium tijdens celdood. Bovendien is het ook mogelijk om kernsplijting / fragmentatie van mitochondria visualiseren tijdens het apoptotische proces. Zoals in de figuren 1D en E, staurosporine behandeling veroorzaakt een langzame toename van de calcium in bepaalde subpopulaties van de mitochondriën, die pieken op 20 minuten. Calciumgehalte gaan weer met mitochondriale fragmentatie gelijktijdig voordat je weer twee uur na de behandeling. Dit is consistent met de langzame golven in cytosol veroorzaakt door calcium gemeten staurosporine behandeling met behulp van Fura-2 9. Zo kunnen belangrijke kinetische informatie worden verkregen die niet mogelijk is met methoden gebruik statische metingen. Hoewel we hebben gepresenteerd ratio&#39;s en niet calcium concentraties in figuur 1, is het mogelijk om de sensor te kalibreren in situ van absolute calcium niveau 4, 10 te berekenen. Een belangrijk voorbehoud om te overwegen is dat ratiometrisch pericam is gevoelig voor pH 4, 10. Omdat zowel de cytosolische en mitochondriale pH-waarde kan drastisch veranderen tijdens apoptosis 11, is dit een belangrijke overweging. Titratie van de pH in geïsoleerde mitochondria uiten pericam aan te tonen dat een verhoging van [H +] verhoogt de uitstoot van pericam toen opgewonden 495 nm, met weinig effect op de uitstoot gestimuleerd wordt door excitatie bij 410 nm, een woning die is benut om gelijktijdig meten van zowel de mitochondriale calcium en pH 12. Zo selectief controle emissie met 410 nm excitatie biedt een middel om niet-ratiometrically monitoren mitochondriale calcium met een verminderde zorg voor de pH. Ten slotte is het protocol hier gepresenteerde vereist alleen toegang tot een standaard epifluorescerende microscoop met op grote schaal beschikbaar filters, waardoor deze techniek toegankelijk voor de meeste laboratoria.

<table><tbody><tr><td>Invertre wide-field fluorescent calcium-imagingmicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>Elke invertre wide-field microscoop die is uitgerust met 380 nm/495 nm excitatiefilters en geschikte longpass- en emissiefilters kan eenvoudig worden aangepast om dit protocol te gebruiken.</td></tr><tr><td>Imaging-software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor celkamer</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Elke imagingkamer voor een invertre microscoop die perfusie toestaat is voldoende.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>De meeste transfectiereagentia/protocollen zouden geschikt zijn voor deze studies</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte tijdens apoptosis met behulp van een genetisch gecodeerd calcium sensor

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamische veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in reactie op verschillende stimuli reguleert vele cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en apoptose 1. Tijdens apoptose, calcium ophoping in mitochondriën stimuleert het vrijkomen van pro-apoptotische factoren uit de mitochondriën in het cytosol 2. Het is daarom van belang om mitochondriale calcium rechtstreeks te meten in levende cellen in situ tijdens de apoptose. Hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming van cellen geladen met dual-excitatie ratiometrische en niet-ratiometrische synthetische calcium indicator kleurstoffen heeft bewezen een betrouwbare en veelzijdige tool om de verschillende aspecten van de intracellulaire calcium signaaloverdracht studie. Het meten van cytosolische calcium fluxen met behulp van deze technieken is relatief eenvoudig. Echter, het meten van intramitochondrial calciumspiegels in intacte cellen met behulp van synthetische calcium indicatoren, zoals Rhod-2 en Rhod-FF is een grotere uitdaging. Synthetische indicatoren gericht op de mitochondriën zijn afgestompte reacties op herhaalde toename van de mitochondriale calcium, en verstoren mitochondriale morfologie 3. Bovendien, synthetische indicatoren hebben de neiging om uit te lekken van mitochondriën gedurende enkele uren waardoor ze ongeschikt zijn voor de lange termijn experimenten. Zo zijn genetisch gecodeerd calcium indicatoren die gebaseerd zijn op groen fluorescerend eiwit (GFP) 4 of 5 aequorine gericht op de mitochondria aanzienlijk vergemakkelijkt het meten van de mitochondriale calcium dynamiek. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het real-time meting van mitochondriale calcium fluxen in reactie op verschillende stimuli. De methode is gebaseerd op fluorescentie microscopie van &#39;ratiometrische-pericam&#39;, die selectief is gericht op mitochondriën. Ratiometrische pericam is een calcium-indicator gebaseerd op een fusie van circulair gepermuteerd geel fluorescerend eiwit en calmodulin 4. Binding van calcium aan ratiometrische pericam veroorzaakt een verschuiving van de excitatie piek van 415 nm tot 494 nm, terwijl de emissie spectrum, dat pieken rond 515 nm, blijft ongewijzigd. Ratiometrische pericam bindt een calcium-ion met een dissociatieconstante in vitro van ~ 1,7 uM 4. Deze eigenschappen van ratiometrische pericam kan de kwantificering van een snelle en lange-termijn veranderingen in de mitochondriale calcium concentratie. Daarnaast beschrijven we de aanpassing van deze methodologie op een standaard wide-field calcium imaging microscoop met algemeen beschikbare filter sets. Met behulp van twee verschillende agonisten, de purinerge agonist ATP en apoptose-inducerende geneesmiddelen staurosporine, tonen we aan dat deze methode geschikt is voor het monitoren van veranderingen in het mitochondriale calcium concentratie met een temporele resolutie van seconden tot uren. Verder hebben we ook laten zien dat ratiometrische pericam ook nuttig is voor het meten van mitochondriale kernsplijting / fragmentatie tijdens apoptose. Zo is ratiometrisch pericam bijzonder goed geschikt voor continue lange termijn meting van mitochondriale calcium dynamiek tijdens apoptose.

Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Dynamische veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie als reactie op diverse stimuli reguleren vele cellulaire processen, zoals proliferatie, ...

Het algemene doel van deze procedure is het monitoren van veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie in levende cellen. Dit wordt bereikt door cellen eerst te transfecteren met het ratiometrische calciumindicatoreiwit peram, dat gericht is op de mitochondriale matrix, één of twee dagen vóór de transfectie. De fluorescentiemicroscoop en de bijbehorende software worden ingesteld voor live-cell imaging.Na toevoeging van een calciummobiliserende agonist worden vervolgens beelden van cellen die ratiometrische Peram tot expressie brengen, vastgelegd. De laatste stap van de procedure is de kwantitatieve analyse van de verkregen beelden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die dynamische veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie laten zien via fluorescentiemicroscopie van levende cellen die een ratiometrisch calciumindicator-eiwit tot expressie brengen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het meten van calciumgehaltes met behulp van synthetische calciumindicatoren, is dat ratio metric peram genetisch gecodeerd is en daardoor gericht kan worden op mitochondria of elk ander orgaan van belang. Hallo, ik ben Dr. Ascar, postdoc in het laboratorium van Dr. Benning, en ik zal vandaag de procedure demonstreren. Om te beginnen met het protocol: plaat de HeLa-cellen de avond voorafgaand aan de transfectie op steriele glazen dekglasjes in een standaard zes-wells kweekplaat, met een dichtheid die op de dag van transfectie ongeveer 70% confluent zal zijn. Bereid de volgende dag DNA-Lipofectamine 2000-complexen voor volgens de instructies van de fabrikant, met 4 µg van de metric peram mitochondriaal expressievector en 10 µL Lipofectamine 2000 verdund in 0,5 mL Opti-MEM voor elke te transfecteren well.Vervang vervolgens het D-M-E-M-F-B-S HELOC-kweekmedium in elke put door 1,5 milliliters van hetzelfde medium zonder antibiotica. Voeg de LIPECTOMY-oplossing toe aan de DNA-oplossing en meng voorzichtig nadat de complexen zijn gevormd. Voeg de DNA-Lipectomy-oplossing druppelsgewijs toe aan elke te transfecteren put, meng door de plaat voorzichtig te schudden en incubeer gedurende vier uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide na de incubatie.Vervang het medium door D-M-E-M-F-B-S met antibiotica. Laat de cellen één tot twee dagen metric peram tot expressie brengen voordat u met een pincet overgaat tot beeldvorming. Plaats met zorg een dekglas met HELOC-cellen in een geschikte beeldvormingskamer met beeldvormingsoplossing.Plaats de beeldkamer op de tafel van een omgekeerde microscoop. Gebruik vervolgens een olie-immersieobjectief van 40x of hoger en een golflengte van 380 nanometer. Om een interessegebied te vinden met één of meer cellen die ratio metric peram tot expressie brengen, wordt hier 380 nanometer gebruikt om de cellen als ratio metric te identificeren.Peram is minder resistent tegen fotobleken bij deze golflengte. Zodra een gebied van belang is geïdentificeerd, stelt u de software in voor dubbele excitatie bij 495 en 380 nanometers. Neem vervolgens sequentieel beelden op door afwisselend te exciteren bij 495 en 380 nanometers.Leg beelden vast van de calciumspiegels bij de baseline gedurende ten minste 30 seconden vóór de toediening van de agonist. Dien vervolgens de calciummobiliserende agonist toe via een perfusieapparaat, waarbij de toevoegingstijd voor elke agonist wordt genoteerd; de blootstellingstijden aan de agonist en de acquisitie-intervallen moeten worden geoptimaliseerd om fotobleking te voorkomen, terwijl een voldoende temporele resolutie behouden blijft. Zodra het experiment is voltooid, kunnen de beelden offline worden geanalyseerd.Om de analyse te starten, selecteert u een interessegebied binnen een leeg gebied van het gezichtsveld om indien nodig de achtergrondfluorescentie af te trekken. Exporteer vervolgens de 4 95 3 80 ratio-metingen van het interessegebied naar Excel of vergelijkbare grafische software. Dit paneel van afbeeldingen toont de subcellulaire lokalisatie van ratio metric peram en mitochondria.Links is een live-cell image van HeLa-cellen die ratio-metrisch Pericam tot expressie brengen. In het midden is de fluorescente kleuring van de mitochondriën met de selectieve kleurstof MitoTracker Red CMXRos te zien. En tenslotte, aan de rechterkant, is het samengevoegde beeld een serie pseudokleur-ratio-beelden van 495 en 580 nanometer van vier HeLa-cellen die ratio-metrisch Pericam in de mitochondriën tot expressie brengen en behandeld zijn met 10 µM ATP; de kwantificering van de veranderingen in de mitochondriale calciumspiegels van deze vier cellen wordt hier getoond in dit beeld van een HeLa-cel die ratio-metrisch Pericam in de mitochondriën tot expressie brengt.Heterogeniteit van de calciumrespons in individuele mitochondriën, evenals significante fragmentatie van mitochondriën, is duidelijk zichtbaar na 60 minuten behandeling met 0,5 µM storsporine. Sommige mitochondriën vertonen oscillerende calciumtoenames, aangegeven met de witte pijl, terwijl andere geen significante veranderingen in het calciumgehalte vertonen, aangegeven met een gele pijl. Deze grafiek toont de verandering in de globale mitochondriale calciumgehaltes in een enkele HeLa-cel na inductie van apoptose gedurende 120 minuten met 0,5 µM storsporine.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dynamische veranderingen in mitochondriale calciumspiegels als reactie op verschillende stimuli kunnen worden gemeten met behulp van het calcium-gemedieerde eiwit R geometric peram, dat selectief gericht is op de mitochondriale matrix.

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Calciumhomeostase van het endoplasmatisch reticulum is verstoord bij verschillende pathologieën. Een uitgescheiden ER calcium-monitoring-eiwit (SERCaMP) reporter kan worden gebruikt om verstoringen in de ER calciumopslag te detecteren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een Gaussia luciferase SERCaMP om ER calciumhomeostase in vitro en in vivo te onderzoeken.

Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Dit protocol is gericht op het beschrijven van een methode om te onderzoeken of het Ca2 + retentie capaciteit en Ca2 +- geactiveerd mitochondriale zwelling van geïsoleerde mitochondria van SH-SY5Y cellen stapsgewijze.

Mitochondriale Ca2 + retentie capaciteit Assay en Ca2 +-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van rhodamine 123 CLIC4 knockdown-geïnduceerde HN4 cel apoptosis in vitrostudie te identificeren van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP). Onder gemeenschappelijke fluorescentie Microscoop en confocale laser scanning fluorescentie Microscoop, werd de real-time verandering van de MMP opgenomen.

Detectie van Mitochondria membraanpotentiaal CLIC4 Knockdown-geïnduceerde HN4 cel Apoptosis om te studeren In Vitro

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Dit proctocol heeft tot doel een methode te bieden voor in vitro en in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen.

Beeldvorming mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's)

Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Leer hoe u mitochondriale calciumdynamiek in levende cellen monitort met de genetisch gecodeerde indicator ratiometric pericam-mt. Deze methode maakt real-time fluorescentiebeeldvorming en kwantitatieve analyse van calciumfluxen mogelijk.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor (Video) | JoVE Journal

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Meer video's verkennen