Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de mitochondriale calciumconcentratie in levende cellen te monitoren. Dit wordt bereikt door eerst cellen te doorsnijden met het calciumindicator-eiwit ratio metrisch peram, dat is gericht op de mitochondriale matrix, een of twee dagen na transfectie. De fluorescentiemicroscoop en software is ingesteld voor beeldvorming van levende cellen.

Afbeeldingen van ratio metrisch peram expresserende cellen worden vervolgens verkregen na toevoeging van een calciummobiliserende agonist. De laatste stap van de procedure is kwantitatieve analyse van de verkregen beelden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die dynamische veranderingen in mitochondriale calciumconcentratie tonen door middel van fluorescentiemicroscopie van levende cellen die een ratio metrisch calciumindicator-eiwit expresseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het meten van calciumniveaus met behulp van synthetische calciumindicatoren is dat ratio metrisch peram genetisch is gecodeerd en dus kan worden gericht op mitochondriën of elk ander orgaan van belang. Hallo, ik ben Dr. Ascar, een postdoc in het laboratorium van Dr. Benning, en ik zal de procedure vandaag demonstreren. Om het protocol te beginnen, plateert u helo-cellen de avond ervoor, transfectie op steriele glazen dekglasjes geplaatst in een standaard zes-wells kweekplaat met een dichtheid die ongeveer 70% confluënt zal zijn voor transfectie de volgende dag. De volgende dag bereidt u DNA-Lipectomie 2000-complexen volgens de instructies van de fabrikant met vier microgram metrisch peram mitochondriale expressievector en 10 microliters lipectomie 2000 verdund in 0,5 milliliter optimum voor elke put die getransfecteerd moet worden.

Vervang vervolgens het D-M-E-M-F-B-S HELOC-kweekmedium in elke put met 1,5 milliliter van hetzelfde medium zonder antibiotica. Voeg de LIPECTOMY-oplossing toe aan de DNA-oplossing en meng voorzichtig nadat de complexen zijn gevormd. Voeg de DNA-Lipectomie-oplossing druppelsgewijs toe aan elke put die getransfecteerd moet worden, meng door voorzichtig te schudden en incubeer gedurende vier uur in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide na de incubatie.

Vervang het medium met D-M-E-M-F-B-S dat antibiotica bevat. Laat de cellen een tot twee dagen lang metrisch peram expresseren voordat ze worden geïmagereerd met behulp van pincetten. Plaats voorzichtig een dekglas met HELOC-cellen in een geschikte beeldvormingskamer met beeldvormingsoplossing.

Monteer de beeldvormingskamer in een omgekeerde microscoopstand. Gebruik vervolgens een 40 x of hogere olie-immersie-objectief en een golflengte van 380 nanometer. Om een gebied van belang te vinden dat een of meer cellen bevat die ratio metrisch peram expresseren, wordt hier 380 nanometer gebruikt om de cellen als ratio metrisch te identificeren.

Peram is minder resistent tegen fotobleken bij deze golflengte. Zodra een gebied van belang is geïdentificeerd, stelt u de software in voor dubbele excitatie bij 495 en 380 nanometer. Vervolgens verwerft u afbeeldingen sequentieel door afwisselend te exciteren bij 495 en 380 nanometer.

Verwerf afbeeldingen van baseline-calciumniveaus gedurende ten minste 30 seconden vóór toediening van agonist. Breng vervolgens de calciummobiliserende agonist aan via een perfusie-apparaat, waarbij de toevoegtijd voor elke agonist wordt opgemerkt. Blootstellingstijden en acquisitie-intervallen moeten worden geoptimaliseerd om fotobleking te voorkomen, terwijl nog steeds voldoende temporele resolutie wordt toegestaan. Zodra het experiment is voltooid, kunnen afbeeldingen offline worden geanalyseerd.

Om met de analyse te beginnen, selecteert u een gebied van belang binnen een lege ruimte van het veld om eventueel achtergrondfluorescentie af te trekken. Exporteer vervolgens de 4 95 3 80-ratiometingen uit het gebied van belang naar Excel of soortgelijk grafieksoftware. Dit paneel met afbeeldingen toont de subcellulaire lokalisatie van ratio metrisch peram en mitochondriën.

Aan de linkerkant is een live-celbeeld van helo-cellen die ratio metrisch peram expresseren. In het midden is de fluorescente kleuring van de mitochondriën en selectieve kleurstof MIT-tracker rood CMX Ross. En ten slotte aan de rechterkant, de samengevoegde afbeelding die hier wordt getoond, is een reeks pseudokleur 4 95, 3 80 nanometer ratio-afbeeldingen van vier helo-cellen die ratio metrisch peram in de mitochondriën expresseren, behandeld met 10 micromolar ATP, en de kwantificering van veranderingen in mitochondriale calciumniveaus van die vorige vier cellen wordt hier in deze afbeelding van een hela-cel weergegeven die ratio metrisch peram in de mitochondriën expresseert.

De heterogeniteit van de calciumrespons in individuele mitochondriën evenals significante fragmentatie van mitochondriën is duidelijk na 60 minuten behandeling met 0,5 micromolar stor sporin. Sommige mitochondriën vertonen oscillerende toenames in calcium, aangegeven met de witte pijl, terwijl andere geen significante veranderingen in calciumniveau vertonen, aangegeven met een gele pijl. Deze grafiek toont de verandering in globale mitochondriale calciumniveaus in een enkele helo-cel na inductie van apoptose gedurende 120 minuten met 0,5 micromolar stor sporin.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dynamische veranderingen in mitochondriale calciumniveaus kunnen worden gemeten als reactie op verschillende tli met behulp van calcium gemedieerd eiwit R geometrisch peram, dat selectief is gericht op de mitochondriale matrix.