Dynamische multiparameter beoordeling van de bloedplaatjesfunctie met behulp van een capacitieve biosensor

We ontwerpen een test om de bloedplaatjesfunctie in fysiologische omgevingen te evalueren, om de beperking van stroomtesten aan te pakken door bloedplaatjes te activeren in een halfstijve micro-omgeving met een membraancapaciteitssensor. De test meet het aantal bloedplaatjes, de stimulatiesterkte en de activeringsroutes. Deze tool biedt een uitgebreide benadering voor het bestuderen van bloedplaatjesmechanismen tijdens de hemostase.

Ons protocol kan meerdere parameters van de bloedplaatjes evalueren in de enkele test onder fysiologische omstandigheden. We zullen ons richten op het verbeteren van dit protocol en de ontwikkeling van andere hemostase-evaluatiesensoren. Begin met het gebruik van standaard CAD-lay-outsoftware om de lay-out van de teammembraancapaciteitschip, of MCC, te ontwerpen voor een vier-inch siliciumwafersubstraat voor het microfabricageproces zoals beschreven in het manuscript.

Reinig voor biofunctionalisering de detectie-elektrode van TMCC met zuurstofplasma gedurende 45 seconden bij 100 watt. Voeg een Do Decanal-oplossing in 200 proof ethanol toe aan het monsterputje op de TMCC's. Plaats de TMCC's in een container gevuld met droge stikstof.

Sluit de container af en wikkel deze 24 tot 48 uur in met parafilm. Spoel na twee dagen het gouden oppervlak van TMCC af met gedeïoniseerd water en 200 proof ethanol. Droog de TMCC's met stikstofgas bij kamertemperatuur.

Voeg menselijke fibronectineoplossing in PBS toe aan het monsterputje van TMCC en incubeer gedurende twee tot acht uur bij 37 graden Celsius. Gebruik voor het instellen van de capaciteitssensor een LCR-meter met micropositioneerders en naaldsondes om elektrisch contact met de sensor tot stand te brengen. Gebruik 3D-geprinte plastic armaturen om de TMCC en BMCC stevig te plaatsen.

Zorg ervoor dat de onderste bevestiging is uitgerust met stoppers op de XY-as om de TMCC precies over de BMCC uit te lijnen en een condensator te vormen. Pas een sinusvormig signaal toe van 0,5 volt bij 100 kilohertz met een bemonsteringsfrequentie van acht hertz. Om geconcentreerd bloedplaatjesrijk plasma of CPRP te verkrijgen, centrifugeert u de menselijke bloedmonsters.

Breng de CPRP over naar een steriele container en voer het aantal bloedplaatjes uit. Voor remmerstudies wordt de CPRP geïncubeerd met een vooraf bepaalde concentratie aspirine in de buffer van Tyrode. Voor de functionele test van de bloedplaatjes monteert u TMCC en BMCC in de 3D-geprinte armaturen.

Meet de basiscapaciteit van de geassembleerde MCC's gedurende vijf minuten en voeg vervolgens 45 microliter CPRP toe aan het monsterputje in het TMCC en wacht 30 minuten zodat bloedplaatjes zich kunnen hechten aan de met fibronectine beklede elektrode in het TMCC. Verwijder vervolgens 30 microliter CPRP uit het monsterputje zonder de aangehechte bloedplaatjes te verstoren en vul het putje aan met de buffer van Tyrode. Voeg na de laatste wasbeurt 10 microliter van de agonistoplossing toe in de gewenste concentratie en breng het monster gedurende 80 minuten in evenwicht.

Meet de maximale verandering in capaciteit na 30 minuten hechting om de delta C-hechting te bepalen. Meet voor de activeringsfase de maximale verandering in capaciteit, ook wel delta C-activering genoemd. Bereken de helling van de capaciteitscurve tussen 200 en 300 seconden na activering om de S-activering te bepalen.

Voer statistische analyse uit met behulp van variantieanalyse met de postoperatieve test van Tukey om de resultaten tussen groepen te vergelijken. Gebruik Shapiro-Wilk goodness of fit om te testen op normale verdeling. Een CPRP-oplossing met een vooraf bepaald aantal bloedplaatjes vertoonde een lineaire afname van de capaciteit tijdens de adhesie.

Een exponentiële afname van de steady-state werd waargenomen na activering van trombine. Delta C-adhesiewaarden vertoonden een sterke correlatie met het aantal bloedplaatjes over een reeks bloedplaatjes, met een significante vermindering bij de aspirineconcentratie van 1,3 millimol. De snelheid van exponentiële afname van de capaciteit na stimulatie van bloedplaatjes nam toe met de celconcentratie.

De omvang van het capaciteitsverlies nam ook toe met hogere concentraties, wat een duidelijke opwaartse trend in delta C-activering laat zien. Een vergelijkbare trend werd waargenomen voor S-activering en het aantal bloedplaatjes. Met toenemende aspirinedosering vertoonden capaciteit, delta C-activering en S-activering afnemende trends.

Er werd een statistisch significant verschil in S-activering waargenomen tussen hoge en gemiddelde doses, terwijl er geen significant verschil werd gevonden in delta C-activering. Capaciteitssignalen voor CPRP-monsters geactiveerd met trombine toonden aan dat de capaciteitsvermindering meer uitgesproken werd bij toenemende trombineconcentratie. Zowel delta C-activering als S-activering vertoonden een statistisch significante trend met trombinespiegels.