Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

We hebben een nieuwe methode ontwikkeld die de biomechanische eigenschappen van trombose adequaat kan vastleggen en ook protrombische afwijkingen bij mensen kan detecteren. Om te beginnen gebruik je een siliciumwafer om een SU8-fotoresist-mastermal te fabriceren via standaard fotolithografie op basis van het ontwerp en bevestig je de mastermal met tape aan de onderkant van een 15 centimeter petrischaal. Bereid het polydimethylsiloxaan- of PDMS-mengsel voor door de prepolymeerbasis en het uithardingsmiddel uit de siliconenelastomeerkit te mengen in een gewichtsverhouding van 10 op 1.

Giet het PDMS-mengsel op de mastermal. Plaats vervolgens de plaat met het PDMS-mengsel in een vacuümdesiccator om deze te ontmagnetiseren. Thermisch uitharden van het PDMS-mengsel door het twee uur in een broedmachine te plaatsen die op 75 graden Celsius staat.

Na het verwijderen van het monster uit de incubator, snijd je voorzichtig het uitgeharde PDMS uit de mastermal en snijd je het uitgeharde PDMS in afzonderlijke chipunits. Gebruik een sondenaald om gaten te ponsen op de aangewezen plekken om de inlaat en uitlaat te creëren. Gebruik in een chemische kap een 75% ethanol natgevat taaktdoekje om de glazen glaasjes schoon te maken en te drogen.

Vervolgens behandel je met een hoogfrequente generator de glasslides 30 seconden en de PDMS-chips 20 seconden. Lijn elke chip uit met een glazen schuif en druk de chip voorzichtig op het oppervlak van de glazen glijbaan om het vast te zetten. Verbind de apparaten nu thermisch door ze 15 minuten in een oven te plaatsen die op 150 graden Celsius staat.

Na het hechten bewaar je de apparaten op kamertemperatuur onder stofvrije omstandigheden. Verwijder vervolgens met een tang het plastic deel van de probenaalden en buig de metalen buizen tot 90 graden om connectoren voor de microfludiïdische apparaten te maken. Na het opzetten van de reacties voor het conjugeren van fibrinogeen en de benodigde antilichamen met Alexa Fluor, centrifugeer je de zuiveringskolommen op 1.100 G gedurende twee minuten om de opslagbuffer te verwijderen.

Na het afvoeren van de doorstroming wordt de reactieoplossing op de zuiveringskolom geladen die in een compatibel verzamelflesje is gemonteerd en centrifugeert op 1.100 G gedurende vijf minuten om het benodigde mengsel te oogsten. Meet met een spectrofotometer de absorptie van het eiwit en het kleurstofsignaal. Bereken de eiwitconcentratie en de fluorescentie-eiwit molaire verhouding.

Bewaar de kleurstoffen op vier graden Celsius in het donker. Voeg heparine toe aan de Tyrodebuffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,32 eenheden per milliliter per 10 milliliter bloed dat wordt verzameld, en bereid de spuit voor door 500 microliter Tyrode buffer bij pH 7,4 te aspireren. Na het verzamelen van het bloed via venipunctuur in de heparinehoudende spuit, doe je het over in een centrifugebuis van 15 milliliter en houd je het op 37 graden Celsius.

Verdun Von Willebrand-factor monomeer tot twee microgram per milliliter in PBS. Voorcoat de microfluïdische apparaten met het verdunde von Willebrand-factor monomeer en incubeer ze een uur op kamertemperatuur. Incubeer nu het bloedmonster met fluorescentiesensor set 1 of set 2 voor 10 minuten op kamertemperatuur.

Verbind vervolgens een microfluïdisch apparaat met inlaat- en uitlaatconnectoren en slangen. Sluit het andere uiteinde van de inlaatconnector aan op de buis met PBS, en sluit vervolgens het andere uiteinde van de uitlaatconnector aan op een spuit. Bevestig de spuit op een spuitpomp en het microfluïdische apparaat op een omgekeerde microscoop.

Manoeuvreer handmatig de microscoopfase om de plek van de stenose te lokaliseren. Vul het microfludiïdische kanaal en de slang met PBS met behulp van de spuitpomp met een debiet van 0,5 milliliter per minuut. Controleer het apparaat om te verzekeren dat er geen luchtbellen rond de plaats van de stenose aanwezig zijn.

Verbind de inlaatbuis met het bloedmonster en laat het bloedmonster door het microfluïdische kanaal perfuseren met behulp van de spuitpomp met een debiet van 0,018 milliliter per minuut. Stel in een omgekeerde microscoop de belichtingstijd en versterking in voor elk fluorescentiekanaal in de software. Voer realtime multicolor fluorescentiebeeldvorming uit door af te wisselen tussen de vier kanalen en één fluoro-4 tegelijk te exciteren.

Stel het focusvlak aan op de trombus en neem fluorescerende signalen op op de plaats van stenose gedurende 15 tot 30 minuten. Voor data-analyse opent u het databestand met ImageJ versie 1.53. Gebruik het SZ 22 fit C-kanaal om de contour van de trombus te identificeren.

Selecteer vervolgens met polygonselecties ongeveer het gebied van de trombus. Voor elk kanaal elimineer je het achtergrondsignaal door afbeelding te selecteren, Aanpassen te kiezen en vervolgens Drempel te selecteren. Meet tenslotte het gebied en de gemiddelde signaalintensiteit binnen de trombus door Analyseren te selecteren en Meten te kiezen.

Representatieve snapshots toonden trombi gevormd in gezond bloed binnen het stenotische kanaal met bloedplaatjes, fibrinogeen, von Willebrand-factor en P-selectine gevisualiseerd met sensorset 1, en bloedplaatjes, fosfatidylserine, E-positieve integrine alfa IIb beta 3, een geactiveerde integrine alfa IIb beta 3 gevisualiseerd met sensorset 2. Een enkel fluorescentiekanaalbeeld werd verwerkt door het trombusgebied te selecteren, het achtergrondsignaal te verwijderen en het signaaloppervlak en de gemiddelde helderheid te meten om kwantitatieve analyse mogelijk te maken. Continue analyse van fluorescentiesignaalintensiteit over tijd genereerde een signaal-tegen-tijd-curve voor de ophoping van bloedplaatjes tijdens de vorming van trombussen.

Voor elk tijdstip werden totale signaalintensiteiten verkregen voor vier biomarkers in sensorset één en vier biomarkers in sensorset twee. De trombusgrootte werd berekend en een zevendimensionaal trombusprofiel werd gegenereerd. Momenteel is er geen bioassay beschikbaar om de protrombontische neiging van menselijke patiënten te evalueren, en ons werk probeert dit gat te vullen.

Door de biomechanische activiteit van bloedmonsters te detecteren, kan onze test de protrombische eigenschappen van proefpersonen volledig evalueren. Onze test kan worden ontwikkeld tot een klinische test voor het detecteren van protrobotische tendens bij patiënten, en kan ook worden gebruikt om antitrombotica van de volgende generatie te screenen.