Bergmeyer glucosekwantificering voor microbiologische monsters

Het onderzoek evalueert de glucoseconcentratie in microbiële monsters met behulp van kwantificeringstechnieken van bacterie- en gistfilters. Het doel is om de nauwkeurigheid van glucosemassagram in microbiologische onderzoeken te verbeteren. Uitdagingen zijn onder meer het nauwkeurig kwantificeren van lage glucoseconcentraties in complexe microbiële monsters en het onderscheid maken tussen microbiële en omgevingsbronnen van glucose in gemengde culturen.

Het onderzoek heeft een duidelijke correlatie aangetoond tussen specifieke microbiële stammen en hun glucoseconsumptie, waaruit blijkt hoe omgevingsfactoren de metabole routes beïnvloeden. Ons protocol verbetert de glucosedetectie door de specificiteit en gevoeligheid te verbeteren en tegelijkertijd de verwerkingstijd te verkorten. Door zwavelzuur op een gecontroleerde manier te gebruiken, wordt interferentie tot een minimum beperkt.

Toekomstig onderzoek zal zich richten op het optimaliseren van glucosedetectiemethoden voor industriële microbiologische toepassingen en het onderzoeken van de rol van een specifiek gen in het glucosemetabolisme onder verschillende omgevingsomstandigheden. Weeg om te beginnen 1,28 gram kaliumdiwaterstoffosfaat en 0,1304 gram dikaliumfosfaat af in een glazen bekerglas. Voeg 70 milliliter gedeïoniseerd water toe en pas de pH aan op 5,5 met behulp van 1 molair zoutzuur of kaliumhydroxide.

Breng de oplossing vervolgens over in een maatkolf van 100 milliliter en stel het volume in op 100 milliliter met gedeïoniseerd water. Bewaar de bereide oplossing in een amberkleurige container bij 4-8 graden Celsius gedurende maximaal drie maanden. Weeg vervolgens 0,01 gram o-Dianisidine-dihydrochloride af in een centrifugebuis van 2 milliliter.

Voeg met een pipet van 1.000 microliter 1 milliliter gedeïoniseerd water toe om de verbinding op te lossen en meng de oplossing langzaam. Wikkel de centrifugebuis in aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen en bewaar hem bij 20 graden Celsius. Voeg vervolgens o-Dianisidine-dihydrochlorideoplossing toe aan 10 milliliter fosfaatbuffer in een maatkolf van 100 milliliter en pas het uiteindelijke volume aan op 100 milliliter met de fosfaatbuffer.

Nadat u de oplossing in een amberkleurige kolf hebt overgebracht, bewaart u deze 3-4 maanden bij 4-8 graden Celsius. Plaats nu een maatkolf van 100 milliliter met 30 milliliter gedeïoniseerd water in een ijsbad. Giet na 10 minuten langzaam 51 milliliter 98% zwavelzuur langs de wanden van de kolf terwijl u deze voorzichtig schudt.

Pas later het uiteindelijke volume aan op 100 milliliter met gedeïoniseerd water en breng de oplossing over in een glazen amberkleurige kolf voor opslag. Weeg voor enzymbereiding 0,01 gram glucose-oxidase af in een steriele microbuis van 2 milliliter. Voeg 1 milliliter natriumacetaatbuffer van 50 millimolair bij pH 5 toe aan de microtube en meng voorzichtig.

Weeg vervolgens in een nieuwe microbuis van 2 milliliter 0,0031 gram peroxidase-enzym af en los het op in 1 milliliter fosfaatbuffer ingesteld op pH 5,5. Dek beide microbuisjes met enzymen af met aluminiumfolie en bewaar ze bij 20 graden Celsius. Bereid vervolgens 1 gram per liter D-Glucose standaardoplossing met gedeïoniseerd water.

Bereid om te beginnen de glucosestandaard en alle andere vereiste oplossingen voor de test voor. Voeg de juiste hoeveelheid glucose toe aan verse buisjes van 2 milliliter. Stel een droog thermobad in op 37 graden Celsius en laat het stabiliseren.

Voeg de juiste hoeveelheden buffer toe aan elke microbuis, gevolgd door 3,3 microliter glucose-oxidase en 1,2 microliter peroxidase. Incubeer de buizen op 37 graden Celsius en stel de timer in op 20 minuten. Voeg direct na de incubatie 750 microliter 50% zwavelzuur toe aan elke microbuis en plaats ze 2 minuten in een ijsbad om af te koelen.

Breng het afgekoelde mengsel van 1.500 microliter over naar een plastic cuvet en meet de absorptie bij 529 nanometer. Reinig vervolgens het werkgebied met een oplossing van 70% alcohol en steek een brander aan om asepsis te voorkomen. Verkrijg bacteriën of gisten in een vloeibaar kweekmedium.

Breng 100 microliter van de cultuur over in microbuisjes van 1,5 milliliter met behulp van steriele uiteinden. Centrifugeer de monsters bij 7.500 G gedurende 7 minuten bij 4 graden Celsius. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant, dat glucose in oplossing bevat.

Meng 0,5 microliter van het bovenstaande met alle benodigde componenten om het reactiemengsel te bereiden. Incubeer de microbuisjes gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en voeg onmiddellijk 750 microliter 50% zwavelzuur toe. Laat het mengsel 2 minuten afkoelen in een ijsbad.

Meet ten slotte de absorptie bij 529 nanometer. De spectrofotometrische analyse gaf een maximale extinctiepiek aan bij 529 nanometer. De analyse van de glucoseconsumptie door Debaryomyces hansenii toonde consistente resultaten aan tussen glucose-oxidase- en DNS-methoden totdat er significante verschillen opdoken na 6, 8 en 12 uur.

De toepassing van de glucose-oxidase-zwavelzuurmethode vergemakkelijkte de analyse van hoge glucoseconcentraties tot 100 gram per liter, met betrouwbare resultaten na verdunning.