Kwantificering van de modulatie van de activiteit van het elastase-enzym door middel van colorimetrische analyse

De reikwijdte van ons onderzoek richt zich op de ontwikkeling van natuurlijke reactieve verbindingen. Met behulp van een in vitro-methode willen we de activiteit van elastase evalueren, een enzym dat betrokken is bij de afbraak van elastine en het verlies van elasticiteit, om de homeostase van het weefsel te herstellen. Het kwantificeren van natuurlijke plantenextracten, de activiteit, brengt verschillende uitdagingen met zich mee, voornamelijk in verband met hun complexe chemische samenstelling en hun vaak sterke kleuring die gemeenschappelijke metingen kan verstoren.

Het ontwikkelen van betrouwbare adaptieve protocollen is van vitaal belang voor de vooruitgang van dit onderzoeksveld. Onze studie biedt verschillende voordelen voor de velden, waaronder eenvoud, gevoeligheid, snel resultaat van spanning en aanpassingsvermogen aan verschillende onderzoeksbehoeften. Weeg om te beginnen de juiste hoeveelheid Tris-base af met behulp van een analytische balans en breng de gewogen Tris-base over in een bekerglas.

Voeg met behulp van een maatcilinder gedeïoniseerd water toe aan de beker. Roer de oplossing met een magnetische roerder totdat de Tris-basis volledig is opgelost. Pas vervolgens de pH van de oplossing aan op acht met behulp van vier normale zoutzuur.

Zodra de gewenste pH is bereikt, brengt u de oplossing over in een maatkolf. Vul de kolf met gedeïoniseerd water tot het aangegeven volume. Breng de voorbereide buffer over in een geëtiketteerde opslagfles en bewaar deze bij kamertemperatuur.

Weeg voor de monstervoorbereiding de benodigde hoeveelheid monster nauwkeurig af met behulp van een analytische balans. Los het monster op in de voorbereide reactiebuffer om de gewenste concentratie te bereiken. Gebruik een vortexmixer om het monster volledig op te lossen.

En bewaar het voorbereide monster op ijs. Bereid vervolgens een werkende oplossing van het elastase-enzym in reactiebuffer tot een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter. Bewaar de elastase-oplossing op ijs tot gebruik.

Bereid nu een 0,8 millimolaire SANA-oplossing in reactiebuffer. Bescherm de oplossing tegen licht en bewaar deze tot gebruik bij vier graden Celsius. Bereid voor de fenylmethaansulfonylfluoride, of PMSF-bouillon, een 100 millimolaire PMSF-oplossing in isopropanol.

Bewaar de bereide oplossing op ijs. Bereid alle reacties in drievoud voor met behulp van microcentrifugebuisjes. Incubeer alle buisjes 20 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 100 microliter van de SANA-substraatoplossing toe aan elke buis, behalve de kleurregelaars. Keer de buisjes meerdere keren voorzichtig om om de monsters te mengen en breng 300 microliter van elke buisje over naar een plaat met 96 putjes, zodat de metingen voor elk monster in drievoud verlopen. Plaats ten slotte de plaat met 96 putjes in een microplaatlezer die is ingesteld op 410 nanometer en meet de absorptie periodiek, elke minuut gedurende 20 minuten, of totdat het signaal zich stabiliseert bij kamertemperatuur.

Extract één vertoonde een zwakke maar significante elastaseremmende activiteit bij concentraties van één, 0,75 en 0,5 milligram per milliliter, zonder significant effect bij 0,25 milligram per milliliter. Extract twee vertoonde een hoge elastaseremmende activiteit bij alle geteste concentraties, met remmingsniveaus vergelijkbaar met de positieve controle bij één, 0,75 en 0,5 milligram per milliliter.