3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring

Het doel van dit onderzoek is het bestuderen van de morfologie en ruimtelijke verspreiding van parasieten in het retinale vaatstelsel met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken. Om een gedetailleerd beeld te geven van de morfologische kenmerken van parasieten, beschreef de studie een nieuwe benadering die de retroorbitale injectie van fluorescerend middel, immunofluorescerende kleuring en weefselopruimingsbehandeling combineert om het onderzoek in ons vakgebied vooruit te helpen.

Vergeleken met de pre-klaringstoestand van het retinale weefsel van de muis, zijn de achtergrondsignalen van bloedvaten en parasieten gelabeld met fluorescerende tomatenlactine en PDGFR-bèta significant verminderd na weefselopruiming, wat een nauwkeurigere observatie van hun ruimtelijke relatie mogelijk maakt.

Onze resultaten geven aan dat deze technieken zeer compatibel zijn voor het aantonen van de parasieten in het retinale vaatstelsel in het hele netvlies. De combinatie van deze histologische technieken is een effectieve benadering om de morfologische kenmerken van parasieten in detail te visualiseren vanuit een driedimensionaal perspectief.

[Docent] Plaats om te beginnen de verdoofde muis in de rechter zijdelingse lighouding met het hoofd naar links gericht. Druk voorzichtig met twee vingers op het periorbitale gebied om het linkeroog van de muis bloot te leggen. Gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 27 gauge en prik voorzichtig ongeveer twee tot drie millimeter in de orbitale veneuze sinus, waarbij u ervoor zorgt dat de afschuining van de naald in een hoek van 45 graden naar voren wijst. Injecteer 0,1 milliliter fluorescerende tomatenlactine in de orbitale veneuze sinus. Euthanaseer de muis na vijf minuten retroorbitale injectie en gebruik een chirurgische schaar om de borstholte te openen. Steek een naald van 24 gauge twee millimeter in de linker hartventrikel via de linkerventrikeltop. Voer perfusie uit met een snelheid van drie milliliter per minuut met 20 milliliter 0,9% fysiologische zoutoplossing, gevolgd door 20 milliliter 4% fysiologische zoutoplossing. Injecteer 0,1 milliliter 0,9% formaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Plaats vervolgens de geofferde muis op zijn zij en verwijder de huid die de ogen bedekt met een schaar. Reinig de ogen met een schaar en een tang. Snijd de oogzenuw en de omliggende weefsels door en til het oog op. Breng het oog over op een plaat met 12 putjes om gedurende twee uur 4% formaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer te fixeren. Na fixatie het oog cryoprotecteren in 25% sucrose in 0,1 molaire fosfaatbuffer bij vier graden Celsius totdat het naar de bodem van de oplossing zakt. Breng het oog met behulp van een plastic pastoorpipet over in een petrischaaltje met 0,1 molaire fosfaatbuffer. Prik met een scherpe schaar in de rand van het hoornvlies, knip rond het hoornvlies en de iris en gooi ze weg. Verwijder met een tang de lens en glasvocht. Gebruik vervolgens een fijne tang om het komvormige netvlies weg te trekken van het midden van het oog. Spoel het netvlies met 0,1 molaire fosfaatbuffer in een schoon petrischaaltje. Na het isoleren van het komvormige netvlies van de muis, incubeer het in een 20-uurs incubator met een 2% Triton X-100-oplossing in 0,1 molaire fosfaatbuffer 's nachts bij vier graden Celsius. Breng de volgende dag het netvlies over in de blokkerende oplossing en draai het 's nachts met 72 tpm op de schudder bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens het netvlies in een microcentrifugebuisje met de primaire antilichamen van geitenanti-PDGFR bèta in verdunningsbuffer. Draai de buis op de shaker twee dagen rond op vier graden Celsius. Was het netvlies na twee dagen twee keer met wasbuffer op kamertemperatuur. Plaats het netvlies in de wasbuffer en zet het een nacht bij vier graden Celsius in de schudder. Breng de volgende dag het netvlies over in een microcentrifugebuisje met een oplossing van één milligram per milliliter secundair antilichaam van ezel-anti-geit 488 en 0,2 nanogram per milliliter fluorescerende kernvlek DAPI. Draai de buis op de shaker vijf uur lang op 72 RPM bij vier graden Celsius. Was het netvlies twee keer een uur op kamertemperatuur in een bord met zes putjes met wasbuffer. Incubeer het netvlies in een wasbuffer op de schudder een nacht bij vier graden Celsius. Breng de volgende dag het netvlies over naar het weefselopruimingsreagens en draai het voorzichtig op de shaker op 60 RPM gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Spoel na het opruimen van het weefsel het netvlies met 0,1 molaire fosfaatbuffer in een schoon petrischaaltje. Maak met een veerschaar vier radiale incisies die ongeveer 2/3 van de straal van het netvlies bereiken om een bloembladvorm te creëren. Maak het netvlies plat en monteer het op een microscoopglaasje met de binnenkant van het netvlies naar boven. Gebruik een klein stukje absorberend papier om overtollig fosfaatbuffer te verwijderen. Omcirkel het gemonteerde netvlies met een afstandsstuk. Vul de opening met vers weefselopruimingsreagens en plaats er een dekglaasje op. Scan de montageweergaven van het gelabelde netvlies met behulp van de panoramische weefselplakscanner. Maak de beelden met een hogere vergroting met behulp van een beeldvormingssysteem dat is uitgerust met een 2X- en een 10X-lens met numerieke diafragma's van respectievelijk 0,40 en 0,95. Leg 50Z-stapelbeelden vast van het gelabelde netvlies in frames van twee micrometer. Klik achtereenvolgens op Set Start brandpuntsvlak, Set Einde brandpuntsvlak, Set Step Size, kies Dieptepatroon, Image Capture en Z-Series om alle afbeeldingen te integreren in één scherp beeld met behulp van de projectie- en topografiemodus. Maak vervolgens afbeeldingen met behulp van de groene fluorescentie op 499 en 519 nanometer, rode fluorescentie op 591 en 618 nanometer en blauwe fluorescentie op 401 en 421 nanometer. Selecteer achtereenvolgens Nieuwe oppervlakken toevoegen, kies Volume-instellingen, kies Bronkanaal, pas de weergave aan, pas de oppervlaktehoek en snapshot aan om de confocale Z-Stack-afbeeldingen in de analysesoftware te importeren en de afbeeldingen in het driedimensionale patroon te reconstrueren. De weefseltransparantie van het hele netvlies was verhoogd na de weefselopruimingsbehandeling in vergelijking met het netvlies zonder weefselopruiming. Retinale vasculatuur gelabeld met tomatenlectine en retinale parasieten gelabeld met PDGFR-β waren zowel voor als na weefselopruiming zichtbaar, maar het achtergrondgeluid werd verminderd na weefselopruiming. Retinale parasieten werden waargenomen langs de vasculaire boom, die een gradationele verdeling vertonen van de centrale naar perifere gebieden van het netvlies. De driedimensionale Z-Stack-beelden van het geklaarde netvlies toonden parasieten die strak rond retinale vaten van verschillende diameters waren gewikkeld met sterkere PDGFR-β-kleuring in haarvaten.