Inzicht in de veranderingen in mitochondriale morfologie door middel van dynamische en driedimensionale fluorescentiemicrofoto's

Het doel van ons onderzoek is om veranderingen in mitochondriale netwerken waar te nemen en te onderzoeken hoe deze mitochondriale netwerken veranderen als reactie op cellulaire omstandigheden. We gebruiken open source-tools zoals Fiji en Python, waarbij we bestaande bibliotheken combineren met aangepaste macro's en scripts om de mitochondriale morfologieanalyse van complexe fluorescentiemicroscopiegegevens te automatiseren. Het blijft een uitdaging om betrouwbare kwantitatieve gegevens en metrieken te verkrijgen die de dynamiek van mitochondriale splijting en fusie beschrijven met hun lokalisatie in 3D.

Standaardisatie voor het genereren van dergelijke gegevens is niet algemeen beschikbaar. Daarom bestaat er beperkte kennis over celspecifieke splijtings- en fusiefrequentie en intracellulaire lokalisatie. We hebben levensdetectie van mitochondriale splijting en fusie toegevoegd aan de beschikbare onderzoeksstatistieken.

En door deze te combineren met het aantal mitochondriale structuren, konden we een nieuwe metriek definiëren voor het begrijpen van de dynamiek van mitochondriale netwerken. Onze bevindingen stellen ons in staat om celspecifieke splijtings- en fusieparameters te karakteriseren en voor het eerst te bepalen of het mitochondriale systeem in evenwicht is of verschuift. Dit voorkomt grote verkeerde interpretaties van fenotypes in gezondheid en ziekte en biedt een duidelijk kader voor nauwkeurige rapportage.

Open om te beginnen het onbewerkte bestand in ImageJ. Pas de kleurinstellingen aan om de zichtbaarheid van het interessegebied te verbeteren, maar stel niets in. Dupliceer de afbeelding op basis van het aantal afzonderlijke cellen dat moet worden geanalyseerd.

Als er meerdere cellen aanwezig zijn in een gezichtsveld, navigeert u naar Analyseren, Extra en gebruikt u de tools Gesynchroniseerde vensters en Tekenen uit de vrije hand om een interessegebied rond een interessante cel te tekenen, selecteert u vervolgens Bewerken en kiest u Buiten wissen om de geselecteerde cel te isoleren. Splits de rode en blauwe kanalen van elkaar en sla het mitochondriale kanaal op als een tif-bestand. Als u een puntspreidingsfunctie of PSF wilt genereren, opent u de onbewerkte afbeelding opnieuw.

Open vervolgens de PSF-generatorplug-in door Plug-ins te selecteren, vervolgens PSF-generator te kiezen en het Born wolf 3D optische model te selecteren. Open de afbeeldingsinformatie van de RAW-afbeelding door Afbeelding te selecteren en vervolgens Informatie weergeven te kiezen of door op I op het toetsenbord te drukken. Schuif naar de onderkant van het informatievenster voor afbeeldingen.

Selecteer de voxelgrootte en diepte-optie en verander de golflengte in 568 nanometer. Stel de Pixelsize XY in op 166,1 nanometer, Z-step op 200 nanometer. Stel het formaat XYZ in op een afbeeldingsresolutie van 512 x 512 en configureer de Z-stack om 10 Z-slices te bevatten.

Klik op Uitvoeren. Sla de PSF op als een tif-bestand in een eigen map. Navigeer naar Plug-ins, selecteer Macro's, kies vervolgens Bewerken, gevolgd door Deconvolution_time_lapse_mine.

IJM om toegang te krijgen tot de deconvolutiemacro. Bewerk de invoer- en uitvoerlijnen naar wens en druk op Uitvoeren om de macro uit te voeren. Voor verbetering en vervaging van het beeldcontrast navigeert u naar Plug-ins, selecteert u Macro's, kiest u Bewerken en opent u Voorbewerking.

IJM om toegang te krijgen tot de voorbewerkingsmacro. Voer achtergrondaftrekking uit door de straal van de rollende bal in te stellen op 6. Stel de Sigma Filter Plus zo in dat de straal wordt ingesteld op 1 keer de schaalfactor.

Het aantal gebruikte pixels is 2 en de minimale pixelfractie is 0,2, zodat de plug-in is ingesteld op uitbijters. Pas de CLAHE-instellingen aan door de blokgrootte te configureren op 64, histogrambakken op 256, maximale helling op 2,5 en gamma op 0,8 en vervolgens op Uitvoeren te klikken. Open een interessant bestand dat is gewijzigd met behulp van het voorproces.

ijm macro's in ImageJ. Navigeer naar Plug-ins en selecteer Adaptieve drempel. Stel de lokale drempelwaarde in op gewogen gemiddelde en pas de pixelblokgrootte naar wens aan.

Klik op Voorbeeld en pas de blokgrootte aan om duidelijk zoveel mogelijk mitochondriën op te nemen. Wijzig de aftrekwaarde voor elke cel om de onnodige achtergrond te verwijderen en noteer de resulterende microfoto. Als u de tijd wilt optimaliseren, sorteert u afbeeldingen in bestanden op basis van de toegepaste aftrekwaarde.

Navigeer nu naar Plug-ins, selecteer Macro's, kies Bewerken en open Drempel. IJM om toegang te krijgen tot de drempelmacro. Bewerk het macroscript om de juiste invoer- en uitvoerpaden, blokgrootte en aftrekwaarden te definiëren.

Klik op Uitvoeren om de macro uit te voeren. Open maximaal 10 microfoto's met drempelwaarden die bij dezelfde behandelingsconditie horen. Navigeer naar Afbeelding, Stapels, Extra en selecteer Aaneengeschakeld, druk vervolgens op OK.To resterende kleine puncta te verwijderen die is achtergelaten door drempelwaarden, ga naar Plug-ins, gevolgd door Integrale afbeeldingsfilters en selecteer vervolgens Uitschieters verwijderen.

Gebruik voorvertoning om de X- en Y-formaten te verfijnen om fragmenten te verwijderen. Sla het aaneengeschakelde bestand op als een TIF-bestand. Navigeer ten slotte naar Plugins, Macro's, Bewerken, QuickTest_new.ijm.

Bewerk de invoer- en uitvoerpadregels om naar de juiste mappen te verwijzen, klik op Uitvoeren en visualiseer de mitochondriale gebeurtenislokalisator of MEL-resultaten. De mitochondriale dynamiek werd in de loop van de tijd gevolgd, waarbij rode puncta splijtingsgebeurtenissen markeerde en groene puncta fusiegebeurtenissen markeerde in zowel 3D- als 2D-weergaven. Mitochondriale netwerken vertoonden behandelingsspecifieke verschillen in structuur in de loop van de tijd, met meer langwerpige en onderling verbonden vormen in met metformine behandelde cellen en sterk gefragmenteerde netwerken in metformine CCCP Baf-behandelde cellen.

De metformine CCCP Baf-groep vertoonde een significant hogere splijtings- en fusieactiviteit dan de controlegroep of de groep met alleen metformine, wat wijst op een verhoogde mitochondriale remodellering. Deze groep had ook een significant hoger aantal mitochondriën, consistent met verbeterde fragmentatie. Het mitochondriale volume was significant verminderd in dezelfde groep, wat een verschuiving naar kernsplijting verder ondersteunde.

Wanneer genormaliseerd naar mitochondriaal getal, vertoonde de groep met alleen metformine echter de hoogste relatieve dynamische activiteit, wat suggereert dat metformine alleen een actiever en efficiënter remodelleringsnetwerk bevordert, terwijl co-behandeling een uitgebreide maar minder efficiënte structurele omzet veroorzaakt.