Inzicht in de veranderingen in mitochondriale morfologie door middel van dynamische en driedimensionale fluorescentiemicrofoto's
15 augustus 2025
Hier beschrijven we de mitochondriale gebeurtenislokalisator (MEL), een ImageJ-plug-in die nuttig is bij het kwantificeren van de 3-dimensionale veranderingen in mitochondriale splijting en fusieactiviteit in de loop van de tijd. We beschrijven ook een beeldverwerkingspijplijn die nuttig is voor het opschonen van microfoto's voorafgaand aan analyse in ImageJ.
Het doel van ons onderzoek is om veranderingen in mitochondriale netwerken waar te nemen en te onderzoeken hoe deze mitochondriale netwerken veranderen als reactie op cellulaire omstandigheden. We gebruiken open source-tools zoals Fiji en Python, waarbij we bestaande bibliotheken combineren met aangepaste macro's en scripts om de mitochondriale morfologieanalyse van complexe fluorescentiemicroscopiegegevens te automatiseren. Het blijft een uitdaging om betrouwbare kwantitatieve gegevens en metrieken te verkrijgen die de dynamiek van mitochondriale splijting en fusie beschrijven met hun lokalisatie in 3D.
Standaardisatie voor het genereren van dergelijke gegevens is niet algemeen beschikbaar. Daarom bestaat er beperkte kennis over celspecifieke splijtings- en fusiefrequentie en intracellulaire lokalisatie. We hebben levensdetectie van mitochondriale splijting en fusie toegevoegd aan de beschikbare onderzoeksstatistieken.
En door deze te combineren met het aantal mitochondriale structuren, konden we een nieuwe metriek definiëren voor het begrijpen van de dynamiek van mitochondriale netwerken. Onze bevindingen stellen ons in staat om celspecifieke splijtings- en fusieparameters te karakteriseren en voor het eerst te bepalen of het mitochondriale systeem in evenwicht is of verschuift. Dit voorkomt grote verkeerde interpretaties van fenotypes in gezondheid en ziekte en biedt een duidelijk kader voor nauwkeurige rapportage.
Open om te beginnen het onbewerkte bestand in ImageJ. Pas de kleurinstellingen aan om de zichtbaarheid van het interessegebied te verbeteren, maar stel niets in. Dupliceer de afbeelding op basis van het aantal afzonderlijke cellen dat moet worden geanalyseerd.
Als er meerdere cellen aanwezig zijn in een gezichtsveld, navigeert u naar Analyseren, Extra en gebruikt u de tools Gesynchroniseerde vensters en Tekenen uit de vrije hand om een interessegebied rond een interessante cel te tekenen, selecteert u vervolgens Bewerken en kiest u Buiten wissen om de geselecteerde cel te isoleren. Splits de rode en blauwe kanalen van elkaar en sla het mitochondriale kanaal op als een tif-bestand. Als u een puntspreidingsfunctie of PSF wilt genereren, opent u de onbewerkte afbeelding opnieuw.
Open vervolgens de PSF-generatorplug-in door Plug-ins te selecteren, vervolgens PSF-generator te kiezen en het Born wolf 3D optische model te selecteren. Open de afbeeldingsinformatie van de RAW-afbeelding door Afbeelding te selecteren en vervolgens Informatie weergeven te kiezen of door op I op het toetsenbord te drukken. Schuif naar de onderkant van het informatievenster voor afbeeldingen.
Selecteer de voxelgrootte en diepte-optie en verander de golflengte in 568 nanometer. Stel de Pixelsize XY in op 166,1 nanometer, Z-step op 200 nanometer. Stel het formaat XYZ in op een afbeeldingsresolutie van 512 x 512 en configureer de Z-stack om 10 Z-slices te bevatten.
Klik op Uitvoeren. Sla de PSF op als een tif-bestand in een eigen map. Navigeer naar Plug-ins, selecteer Macro's, kies vervolgens Bewerken, gevolgd door Deconvolution_time_lapse_mine.
IJM om toegang te krijgen tot de deconvolutiemacro. Bewerk de invoer- en uitvoerlijnen naar wens en druk op Uitvoeren om de macro uit te voeren. Voor verbetering en vervaging van het beeldcontrast navigeert u naar Plug-ins, selecteert u Macro's, kiest u Bewerken en opent u Voorbewerking.
IJM om toegang te krijgen tot de voorbewerkingsmacro. Voer achtergrondaftrekking uit door de straal van de rollende bal in te stellen op 6. Stel de Sigma Filter Plus zo in dat de straal wordt ingesteld op 1 keer de schaalfactor.
Het aantal gebruikte pixels is 2 en de minimale pixelfractie is 0,2, zodat de plug-in is ingesteld op uitbijters. Pas de CLAHE-instellingen aan door de blokgrootte te configureren op 64, histogrambakken op 256, maximale helling op 2,5 en gamma op 0,8 en vervolgens op Uitvoeren te klikken. Open een interessant bestand dat is gewijzigd met behulp van het voorproces.
ijm macro's in ImageJ. Navigeer naar Plug-ins en selecteer Adaptieve drempel. Stel de lokale drempelwaarde in op gewogen gemiddelde en pas de pixelblokgrootte naar wens aan.
Klik op Voorbeeld en pas de blokgrootte aan om duidelijk zoveel mogelijk mitochondriën op te nemen. Wijzig de aftrekwaarde voor elke cel om de onnodige achtergrond te verwijderen en noteer de resulterende microfoto. Als u de tijd wilt optimaliseren, sorteert u afbeeldingen in bestanden op basis van de toegepaste aftrekwaarde.
Navigeer nu naar Plug-ins, selecteer Macro's, kies Bewerken en open Drempel. IJM om toegang te krijgen tot de drempelmacro. Bewerk het macroscript om de juiste invoer- en uitvoerpaden, blokgrootte en aftrekwaarden te definiëren.
Klik op Uitvoeren om de macro uit te voeren. Open maximaal 10 microfoto's met drempelwaarden die bij dezelfde behandelingsconditie horen. Navigeer naar Afbeelding, Stapels, Extra en selecteer Aaneengeschakeld, druk vervolgens op OK.To resterende kleine puncta te verwijderen die is achtergelaten door drempelwaarden, ga naar Plug-ins, gevolgd door Integrale afbeeldingsfilters en selecteer vervolgens Uitschieters verwijderen.
Gebruik voorvertoning om de X- en Y-formaten te verfijnen om fragmenten te verwijderen. Sla het aaneengeschakelde bestand op als een TIF-bestand. Navigeer ten slotte naar Plugins, Macro's, Bewerken, QuickTest_new.ijm.
Bewerk de invoer- en uitvoerpadregels om naar de juiste mappen te verwijzen, klik op Uitvoeren en visualiseer de mitochondriale gebeurtenislokalisator of MEL-resultaten. De mitochondriale dynamiek werd in de loop van de tijd gevolgd, waarbij rode puncta splijtingsgebeurtenissen markeerde en groene puncta fusiegebeurtenissen markeerde in zowel 3D- als 2D-weergaven. Mitochondriale netwerken vertoonden behandelingsspecifieke verschillen in structuur in de loop van de tijd, met meer langwerpige en onderling verbonden vormen in met metformine behandelde cellen en sterk gefragmenteerde netwerken in metformine CCCP Baf-behandelde cellen.
De metformine CCCP Baf-groep vertoonde een significant hogere splijtings- en fusieactiviteit dan de controlegroep of de groep met alleen metformine, wat wijst op een verhoogde mitochondriale remodellering. Deze groep had ook een significant hoger aantal mitochondriën, consistent met verbeterde fragmentatie. Het mitochondriale volume was significant verminderd in dezelfde groep, wat een verschuiving naar kernsplijting verder ondersteunde.
Wanneer genormaliseerd naar mitochondriaal getal, vertoonde de groep met alleen metformine echter de hoogste relatieve dynamische activiteit, wat suggereert dat metformine alleen een actiever en efficiënter remodelleringsnetwerk bevordert, terwijl co-behandeling een uitgebreide maar minder efficiënte structurele omzet veroorzaakt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert de mitochondrial event localizer (MEL), een ImageJ-plugin die is ontworpen voor het kwantificeren van 3D-veranderingen in mitochondriale fisie en fusie in de loop van de tijd. Het onderzoek beschrijft ook een beeldverwerkingspijplijn voor het verbeteren van micrografieën voorafgaand aan de analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldverwerking
Achtergrond
- Mitochondriale netwerken zijn cruciaal voor cellulaire functie.
- Inzicht in fisi- en fusiedynamiek is essentieel voor inzichten in cellulaire gezondheid.
- Gestandaardiseerde metrisches voor deze processen ontbreken.
- Bestaande tools voor analyse vereisen vaak aanpassingen.
Doel van het onderzoek
- Om veranderingen in mitochondriale netwerken onder verschillende cellulaire omstandigheden te observeren.
- Om mitochondriale morfologie-analyse van fluorescentiemicroscopiegegevens te automatiseren.
- Om het begrip van celspecifieke fisi- en fusiefrequenties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van open-source tools zoals Fiji en Python.
- Ontwikkeling van aangepaste macro's en scripts voor automatisering.
- Implementatie van een nieuwe beeldverwerkingspijplijn.
- Levend detectie van mitochondriale fisie en fusie toegevoegd aan onderzoeksmetrisches.
Belangrijkste resultaten
- Betrouwbare kwantitatieve gegevens over mitochondriale dynamiek werden bereikt.
- Standaardisatie van gegevensgeneratie werd voorgesteld.
- Inzichten in mitochondriale lokalisatie in 3D werden geboden.
- Nieuwe metrisches voor fisi- en fusiefrequentie werden vastgesteld.
Conclusies
- De MEL-plugin helpt aanzienlijk bij de analyse van mitochondriale dynamiek.
- Gestandaardiseerde methoden kunnen de reproduceerbaarheid in onderzoek verbeteren.
- Verdere studies zijn nodig om celspecifiek mitochondriaal gedrag te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative, three-dimensional analysis of mitochondrial fission and fusion dynamics is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular stress and drug response. The described pipeline and MEL plugin enable standardized, reproducible measurement of mitochondrial network remodeling, directly supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability enhances portfolio decision-making by clarifying cellular phenotypes in response to pharmaceutical intervention.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of mitochondrial remodeling under compound treatment or stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between equilibrium and shifting mitochondrial states.
- Provides standardized metrics for functional target validation in cell-specific contexts.
- Facilitates predictive confidence in linking mitochondrial dynamics to disease-relevant phenotypes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological imaging data for downstream screening workflows.
- Standardizes image processing and event detection for reproducible assay outputs.
- Enables high-content screening of mitochondrial morphology changes across treatment groups.
- Supports reliable compound evaluation by quantifying fission, fusion, and network structure metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial dynamic metrics with disease-relevant cellular models when supported by data.
- Provides continuity from discovery imaging to preclinical phenotypic validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mitochondrial remodeling data.
- Supports mechanistic de-risking in translational research pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This pipeline integrates from early discovery imaging through lead identification and preclinical model validation, supporting hypothesis testing and mechanistic clarity at each stage.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial fission and fusion events to clarify pathway responses to interventions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound triage.
- Analytics: Provides standardized readouts for comparing treatment conditions and cellular phenotypes.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical model assessment when disease relevance is established.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, open-source workflow adaptable across cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial biology studies.
- Operational Value: Standardizes image analysis, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk by clarifying cellular responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs targeting mitochondrial function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Depends on access to open-source tools (ImageJ/Fiji, Python) and compatible computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and experimental models with appropriate parameter tuning.
- Limited by the need for high-quality 3D time-lapse imaging and careful threshold optimization.
