Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14⁺ -monocyten

We proberen te begrijpen welke immunomodulerende behandelingen getoleriseerde dendritische cellen kunnen genereren uit reeds gedifferentieerde monocyt-afgeleide dendritische cellen, en dit is zeer waardevol voor auto-immuun- en transplantatieonderzoek. Zelftherapieën worden steeds praktischer door de vooruitgang in de productie en tolerogene dendritische cellen zijn veelbelovend gebleken in preklinische studies. Ze kunnen antigeenspecifieke tolerantie genereren. De meest voorkomende is voor cytometrie. Dit biedt een snelle en ook toegankelijke manier om getoleriseerde cellen te analyseren. Het is een uitdaging om tolerogene dendritische cellen te genereren die in beide functies in vivo blijven bestaan. Dit is de reden waarom er geen klinisch goedgekeurde dendritische celtherapieën zijn voor verdraagzaamheid. We hebben nieuwe combinaties van immunomodulerende verbindingen geïdentificeerd uit grote screeningsstudies die aantonen dat deze een verbetering aantonen in de getoleriseerde dendritische celfunctionaliteit. We ontwikkelen ook tolerante formuleringen van nanodeeltjes.

[Docent] Plaats om te beginnen de buisjes van 15 milliliter met verrijkte menselijke monocyten en met T-cellen in een centrifuge. Nadat het centrifugeren is voltooid, gebruikt u een pipet om het bovenstaande uit de buisjes op te zuigen. Voeg een milliliter MODC-kweekmedium toe aan de monocytpellet, een milliliter T-celkweekmedium aan de buis met de T-cellen en meng goed voor het tellen van de cellen. Voeg vervolgens negen milliliter warm MODC-kweekmedium toe aan de monocytensuspensie om het uiteindelijke volume van 10 milliliter te maken. Piket vervolgens 100 microliter GM-CSF en IL-4 voorraadoplossingen. Breng de suspensie over naar een gelabeld petrischaaltje, gemarkeerd als MODC, en incubeer. Voeg vervolgens een milliliter T-cel vriesmedium toe aan de T-cel suspensie. Verdeel het mengsel in twee cryoflesjes van twee milliliter. Plaats de verzegelde cryoflesjes in een vrieskamer met balanceerbuizen in ongebruikte putjes. Voeg op dag vier vijf milliliter vers MODC-kweekmedium toe aan de monocytenbuis. Piket vervolgens 100 microliter GM-CSF en IL-4 voorraadoplossingen zeven en incubeer tot dag zeven. Breng op dag zeven de gedifferentieerde van monocyten afgeleide dendritische cellen, of MDOC's, over in een buis van 50 milliliter en centrifugeer zoals eerder. Voeg een milliliter warm MODC-kweekmedium toe aan de celpellet en pipetteer op en neer om goed te mengen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun de suspensie met warm MODC-kweekmedium dat GM-CSF en IL4 bevat totdat de gewenste celconcentratie is verkregen. Doseer 100 microliter van de suspensie met 30.000 cellen in elk putje van een weefselkweekplaat met 96 putjes met platte bodem. Voeg een microliter immunomodulerende geneesmiddelen toe aan de aangewezen putjes en incubeer. Centrifugeer de volgende dag de MODC-plaat gedurende vijf minuten op 300 G. Nadat u het supernatant voorzichtig hebt verwijderd, voegt u voorzichtig 200 microliter warme HBSS toe aan de zijkant van de plaat en centrifugeert. Voeg opnieuw 100 microliter warm MODC-kweekmedium toe dat GM-CSF en IL4 bevat na supernatante aspiratie. Als immunostimulatie wordt gebruikt, voeg dan een microliter 100X voorraad lipopolysaccharide toe aan de aangewezen putjes en incubeer. Ontdooi op dag acht twee cryoflesjes in een heet kralenbad bij 37 graden Celsius totdat de inhoud begint te smelten. Eenmaal gedeeltelijk ontdooid, brengt u de injectieflacons over naar een celkweekkap. Voeg vervolgens een milliliter warm T-celkweekmedium toe om de cellen snel te ontdooien. Breng de inhoud over in een buis van 50 milliliter en spoel de cryoflesjes met een extra milliliter T-celkweekmedium om alle cellen te verzamelen. Vul de suspensie bij met vloeikleuringsoplossing tot 15 milliliter en centrifugeer. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter vloeikleuringsoplossing en centrifugeer opnieuw, en suspendeer de celpellet vervolgens in één milliliter warm T-celkweekmedium na het pipetteren van het supernatant. Voeg negen milliliter warm T-celkweekmedium toe om een eindvolume van 10 milliliter te maken. Breng de suspensie over in een petrischaaltje met het label Rethawed T-cellen en incubeer. Centrifugeer op dag acht de MODC-plaat gedurende vijf minuten op 300 G. Nadat u het supernatant hebt uitgepipetterd, voegt u 200 microliter vloeikleuringsoplossing toe aan elk putje en incubeert. Piket vervolgens op en neer om de aangehechte cellen en de celsuspensie te verwijderen naar een nieuwe V-bodemplaat met 96 putjes voordat u opnieuw centrifugeert. Pipetteer 50 microliter FC-receptorbindend remmend antilichaam in elk putje na het opzuigen van het supernatans om niet-specifieke binding te blokkeren. Nadat de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur is geïncubeerd, voegt u 50 microliter van de bereide antilichaamcocktail van het validatiepaneel toe aan elk putje. Meng 50 microliter compensatiekorrels met 50 microliter van elk verdund antilichaam in buisjes van 1,5 milliliter en incubeer. Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten op 300 G. Resuspendeer de pellet in 200 microliter vloeikleuringsoplossing om de cellen te wassen. Na de laatste wasbeurt en centrifugatie suspendeer de cellen in 110 microliter vloeikleuringsoplossing voor flowcytometrische analyse. Vervang voor de tolerogene MODC's de antilichaamcocktail door de tolerantiepanelcocktail. Breng op dag negen de ontdooide T-cel petrischaal over in een tube van 50 milliliter en vul de tube bij met vloeikleuringsoplossing. Gebruik de tweede buis met ongekleurde T-cel voor trig-analyse. Draai de buizen gedurende vijf minuten op 250 G. Na het verwijderen van het supernatant, suspendeer de cellen opnieuw in warme celkweekmedia. Tel de T-cel en zorg ervoor dat er minimaal 4 miljoen cellen worden verkregen. Centrifugeer de MODC-plaat gedurende vijf minuten op 300 G. Voeg na het opzuigen van de bovenstaande stoffen 200 microliter T-cellen toe aan elk putje. Voeg ongekleurde T-cellen toe voor trig-analyseplaten. Voeg 25 microliter per milliliter anti-CD3/CD28-antilichaamcocktail toe aan alle groepen behalve negatieve controleputjes om T-cellen te stimuleren en te incuberen tot dag 12. Breng vervolgens alle celsuspensies van de kweekplaat met 96 putjes over in een V-bodemplaat met vloeikleuringsoplossing. Was de cellen twee keer in 200 microliter vloeikleuringsoplossing. Zet enkele cellen opzij voor compensatiebesturingselementen. Na de tweede wasbeurt centrifugeert u de plaat. Voeg vervolgens 50 microliter verdund FC-receptorbindend remmend antilichaam toe aan elk putje en incubeer. Wanneer de incubatie is voltooid, voegt u 50 microliter van de bereide trig-panel-antilichaamcocktail toe aan elk putje. Meng voor compensatiecontroles 50 microliter ongekleurde compensatiecellen met 50 microliter van elk afzonderlijk gekleurd antilichaam. Incubeer de plaat en de compensatieregelaars gedurende een uur bij vier graden Celsius en was vervolgens met vloeikleuringsoplossing voordat u gaat centrifugeren. Kleur de cellen nu met Live/Dead Near-IR-kleurstof verdund in HBSS met 200 microliter per putje vóór koude incubatie. Was en centrifugeer de plaat voor het kleuren met Fox P3 en flowcytometrische analyse. Op dag één waren ongedifferentieerde monocyten overwegend HLA-DR-minus met een kleine CD14 minus, terwijl gedifferentieerde monocyten op dag zeven de meeste cellen vertoonden als HLA-DR-plus CD14 minus, CD1c-plus, CD141 plus. Behandeling met rapamycine, zowel met als zonder lipopolysaccharide, verminderde significant DC-SIGN-plus CD1c-plus-populaties en remde de opregulatie van CD86- en CD40-markers die werden waargenomen bij alleen LPS-behandeling. FOX P3-plus T-regulerende celpopulaties werden verhoogd wanneer MDC's co-cultuur met T-cellen werden gebruikt. Maar er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de vier MODC-behandelingsgroepen. De proliferatie van T-cellen was verminderd in zowel CD4-plus- als CD8-plus T-celpopulaties na co-cultuur met met Rapa behandelde MDOC's. Met interleukine-10 behandelde monsters verhoogden de productie van interleukine-10 na 24 uur aanzienlijk. Met dex behandelde MDOC's verhoogden de productie van interleukine-10 aanzienlijk, maar pas na 72 uur rusten. Voorbehandeling met dexamethason verminderde de gemiddelde TNF-alfageneratie na LPS-behandeling na 24 uur. Significante verhogingen van PDL1-plus MDOC's werden waargenomen in de met Dex plus LPS en Rapa behandelde groepen na 72 uur. Onderdrukking van CD86-expressie werd waargenomen bij alle met immunomodulator behandelde groepen na zowel 24 als 72 uur. Met immunomodulator behandelde MDOC's verhoogden de proliferatie van CD4-plus T-cellen niet.