Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow
17 oktober 2025
Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.
De ontwikkeling en optimalisatie van biosensoren naar biotechnologische toepassingen is de reikwijdte van ons onderzoek. Concreet willen we begrijpen hoe biosensoren kunnen worden geoptimaliseerd en gemanipuleerd door modulatie van hun genetische elementen. Intuïtie-gedreven ontwerpkeuzes, zoals klassieke promotor-engineering en fluorescentie-activerende celsortering, zijn technieken die routinematig worden toegepast bij de karakterisering en het ontwerp van biosensoren.
Het ontwerp van experimentmethodologieën is nog niet op grote schaal toegepast in het ontwerp van genetische circuits. Door middel van dit protocol proberen we de acceptatie van dit soort technieken in het ontwerp van genetische circuits en biosensoren te vergroten. Bepaal om te beginnen de theoretische bibliotheekgrootte en bereken het aantal individuele varianten dat nodig is om een bibliotheekdekking van meer dan 95% te garanderen.
Bereken de benodigde hoeveelheid met antibiotica gesupplementeerde lysogene bouillonmedia op basis van het aantal kolonies dat moet worden gescreend. Open de liquid handler-software en klik op uitvoeren naast het MTP-vloeistofoverdrachtsprogramma. Plaats de voorbereide media in de overeenkomstige reservoirpositie.
Vul vervolgens het dek met lege microtiterplaten volgens de lay-out. Stel het programma in op het doseren van 200 microliter media. Klik op OK om te bevestigen dat het programma is gestart.
Breng nu gevulde microtiterplaatputjes over naar een koloniekiezerplatform en ontzegel en breng vierkante vijzelplaten van Pseudomonas putida over die zijn getransformeerd met plasmidevariantbibliotheek-DNA naar het koloniekiezersplatform. Gebruik de koloniekiezer om elke voorgevulde put te inoculeren met een enkele kolonie van de transformatorplaten. Sluit de geënte platen opnieuw af en breng ze over naar een offline schudbroedmachine.
Plaats na de incubatie de gegroeide platen terug op het vloeistofbehandelingsplatform en verwijder de afdichting. Klik op uitvoeren naast het protocol glycerol toevoegen aan MTP. Zorg ervoor dat de plaatlay-out op het scherm overeenkomt met die van het dock voor vloeistofbehandeling.
En klik achtereenvolgens op OK om het protocol uit te voeren. Als u klaar bent, sluit u de platen af en mengt u ze kort in een offline schudbroedmachine met 800 omwentelingen per minuut gedurende vijf minuten. Barcode de borden en bewaar ze bij 80 graden Celsius tot je ze nodig hebt.
Bereken de benodigde hoeveelheid met antibiotica aangevulde media voor deepwell-blokken. Klik op uitvoeren naast het DWB-programma voor vloeistofoverdracht. Zorg ervoor dat het medium in het juiste reservoir wordt geplaatst.
De lege deep-well blokken bevinden zich op de juiste lay-outposities en er is voldoende voorraad tips beschikbaar. Stel het programma in om 495 microliter media af te geven. Als u klaar bent, klikt u achtereenvolgens op OK om het programma te starten.
Sluit nu de gevulde deepwell-blokken af met een ademend membraan en breng ze over naar tijdelijke opslag bij 4 graden Celsius. Klik vervolgens op uitvoeren naast het inoculaat van ontdooid MTP-programma. Zorg ervoor dat MTP cryo voorraden en vulblokken voor diepe putten per lay-out naar het platform worden overgebracht en dat er voldoende tips worden geladen.
Klik achtereenvolgens op OK om te initialiseren. Wanneer het programma is afgelopen, sluit u de geënte 's nachts deep-well blokken af met een ademend membraan. Breng ze over naar een offline plate shaker-incubator die 16 uur lang is ingesteld op 30 graden Celsius, 800 omwentelingen per minuut en 75% luchtvochtigheid.
Verzegel, meng en breng cryostock microtiterplaten terug naar de vriezer van 80 graden Celsius. Bereken nu het benodigde volume media aangevuld met verschillende effector- en antibioticaconcentraties voor de nachtelijke deepwell-blokken die moeten worden gescreend. Klik op uitvoeren naast het DWB-programma voor vloeistofoverdracht.
Zorg er vervolgens voor dat de met effector aangevulde mediareservoirs correct zijn geplaatst. Voeg lege deepwell-blokken toe aan het liquid handler-platform. Als er voldoende tips beschikbaar zijn, klikt u achtereenvolgens op OK om het protocol te starten om testblokken voor diepe putten te genereren.
Sluit na het vullen de deep-well blokken van de test af met een ademend membraan. Vul de vloeistofverwerker bij met lege platen. Herhaal de inoculatie totdat alle analyseblokken gevuld zijn.
Klik vervolgens op uitvoeren naast het DWB-programma voor overbrengen naar test. Nadat niet-verzegelde testblokken met met effector aangevulde media correct zijn geplaatst, brengt u 's nachts deepwell-blokken met gekweekte P.putida over en verwijdert u deze per lay-out. Klik achtereenvolgens op OK om het protocol te starten.
Wanneer het programma is afgelopen, verzegelt u de testplaten naar de offline incubator. Gooi de nachtelijke deepwell-blokken na inoculatie weg. Breng vervolgens de deepwell-blokken over in een centrifuge.
Pelletcellen bij 4.000 G in een door ijs gecontroleerde rotor bij 18 graden Celsius gedurende vijf minuten. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, plaatst u de centrifugeblokken op het vloeistofbehandelingsplatform. Bereken het volume van één keer PBS dat nodig is op basis van het aantal te screenen deepwell-blokken.
Klik op uitvoeren naast de test, stel het PBS-resuspensie DWB-programma in en stel het doseervolume in op 500 microliter. Zorg er vervolgens voor dat PBS aan het juiste reservoir wordt toegevoegd en rangschik de gecentrifugeerde platen op basis van de lay-out. Klik op OK om het programma te starten nadat u de beschikbaarheid van fooien hebt bevestigd.
Sluit de geresuspendeerde deepwell-blokken opnieuw af en verwijder deze uit de vloeistofverwerker. Controleer de onderkant van de plaat om er zeker van te zijn dat de pellets volledig opnieuw zijn gesuspendeerd. Klik op uitvoeren naast de cellen van de testinstellingen en het MTP-programma van de PBS-editie.
Breng vervolgens geresuspendeerde deepwell-blokken over in de vloeistofverwerker volgens de lay-out. Laad de lege microtiterplaten volgens de lay-out en stel het doseervolume in op 200 microliter voordat u op OK klikt. Breng de gevulde microtiterplaten over naar een offline multi-mode plaatlezer en meet de relatieve fluorescentie en OD600.
Geautomatiseerde screening van 5.000 promotorvarianten identificeerde topkandidaten met een meer dan 3,6-voudige activering. De EC 50-waarden voor 100 unieke varianten werden uitgezet om de gevoeligheidsverdeling te visualiseren en robuuste kandidaten te identificeren. EC 50-waarden werden berekend voor 226 verrijkte varianten en gerangschikt met behulp van Lin-log-transformatie om een bibliotheek op gevoeligheidsschaal te vormen.
Er werd een definitief screeningsontwerp gemaakt met behulp van een afwijking van 1, 0 en 1 niveau uit vier modules. Transport, Regulator, P-out en Output Ribosome-Binding Site-modelprofielen onthulden hoe veranderingen in expressieniveaus van de vier modules niet-lineair van invloed waren op EC 50 en de Hill's-coëfficiënt. Identificeren van optimale expressiecombinaties met RBS-Out, die een sterk positief effect laten zien op zowel de gevoeligheid als de helling.
De wereldwijd geoptimaliseerde biosensorvariant met ideale modulesterktes vertoonde een verbeterde gevoeligheid en Hill-coëfficiënt in vergelijking met zowel de ouderlijke als de DSD-geoptimaliseerde versies.
Overzicht
Dit protocol schetst een systematische benadering voor het optimaliseren van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en evaluatie van genetische bibliotheken. Het integreert ontwerpmethodologieën om experimenten te verbeteren en de selectie van genetische componenten voor specifieke biosensorafstemming te vergemakkelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetische engineering
- Biosensorontwikkeling
- Automatisering in laboratoriumprotocollen
Achtergrond
- Optimalisatie van biosensoren is cruciaal voor biotechnologietoepassingen.
- Traditionele methoden omvatten promotorengineering en fluorescentie-geactiveerde celsortering.
- Ontwerpmethodologieën worden onvoldoende gebruikt in genetisch circuitontwerp.
- Dit protocol beoogt deze methodologieën te bevorderen in biosensorontwerp.
Doel van de studie
- Om de efficiëntie van biosensoroptimalisatie te verbeteren.
- Om geautomatiseerde technieken te implementeren in genetische bibliotheekgeneratie.
- Om het selectieproces van genetische componenten voor biosensoren te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Berekening van theoretische bibliotheekgrootte en vereiste mediavolumes.
- Gebruik van liquid handler software voor mediatransfer en inoculatie.
- Geautomatiseerd screenen van promotorvarianten voor fluorescentieactivering.
- Ranking van varianten op basis van EC50-waarden en gevoeligheidsverdeling.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van topkandidaten met meer dan 3,6-voudige activering.
- Berekening van EC50-waarden voor 226 verrijkte varianten.
- Creatie van een gevoeligheidsgeschaalde bibliotheek met behulp van Lin-log transformatie.
- Ontwikkeling van een definitief screeningsontwerp met meerdere variantieniveaus.
Conclusies
- Het protocol integreert succesvol automatisering in biosensoroptimalisatie.
- Ontwerpmethodologieën kunnen genetisch circuitontwerp aanzienlijk verbeteren.
- Geautomatiseerd screenen kan leiden tot de identificatie van robuuste biosensorkandidaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient exploration of genetically encoded biosensor design space is critical for accelerating discovery and optimization in biopharma R&D. Integrating Design of Experiments (DoE) with high-throughput automation enables systematic, statistically robust sampling of complex combinatorial libraries, directly impacting target validation and assay development. This workflow enhances predictive confidence and portfolio decision-making by enabling rapid identification of biosensor configurations with desired phenotypic performance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables structured interrogation of genetic circuit hypotheses through combinatorial library screening.
- Supports functional target validation by mapping genotype-phenotype relationships across biosensor variants.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying the impact of genetic module stoichiometry on biosensor output.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biosensor systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enables reproducible, quantitative measurement of dose-response parameters such as EC50 and Hill coefficient.
- Accelerates identification of robust biosensor candidates suitable for scalable screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biosensor performance traits with translational biomarker requirements when relevant to disease models.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by enabling systematic optimization of genetic circuits.
- Reduces risk of late-stage failure by ensuring biosensor configurations are functionally characterized and tunable.
Pipeline & Workflow Integration
This DoE-driven automation workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical assay development by enabling efficient, statistically powered exploration of biosensor design space.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping genetic module effects on biosensor function.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible biosensor variants with quantitative dose-response outputs.
- Analytics: Provides EC50, Hill coefficient, and sensitivity-ranked libraries for robust comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment of biosensor outputs with preclinical model requirements when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, agnostic framework for future biosensor and genetic circuit optimization projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biosensor optimization.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for genetic circuit screening.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions and improves capital efficiency in R&D pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biosensor-enabled programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering, automation, and statistical experimental design.
- Depends on access to liquid handling robotics, plate readers, and computational DoE tools.
- Necessitates cross-team standardization of library construction, screening, and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different host organisms or biosensor architectures.
- Fractional sampling strategies must be carefully designed to ensure sufficient coverage of combinatorial space.
