Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

De ontwikkeling en optimalisatie van biosensoren naar biotechnologische toepassingen is de reikwijdte van ons onderzoek. Concreet willen we begrijpen hoe biosensoren kunnen worden geoptimaliseerd en gemanipuleerd door modulatie van hun genetische elementen. Intuïtie-gedreven ontwerpkeuzes, zoals klassieke promotor-engineering en fluorescentie-activerende celsortering, zijn technieken die routinematig worden toegepast bij de karakterisering en het ontwerp van biosensoren.

Het ontwerp van experimentmethodologieën is nog niet op grote schaal toegepast in het ontwerp van genetische circuits. Door middel van dit protocol proberen we de acceptatie van dit soort technieken in het ontwerp van genetische circuits en biosensoren te vergroten. Bepaal om te beginnen de theoretische bibliotheekgrootte en bereken het aantal individuele varianten dat nodig is om een bibliotheekdekking van meer dan 95% te garanderen.

Bereken de benodigde hoeveelheid met antibiotica gesupplementeerde lysogene bouillonmedia op basis van het aantal kolonies dat moet worden gescreend. Open de liquid handler-software en klik op uitvoeren naast het MTP-vloeistofoverdrachtsprogramma. Plaats de voorbereide media in de overeenkomstige reservoirpositie.

Vul vervolgens het dek met lege microtiterplaten volgens de lay-out. Stel het programma in op het doseren van 200 microliter media. Klik op OK om te bevestigen dat het programma is gestart.

Breng nu gevulde microtiterplaatputjes over naar een koloniekiezerplatform en ontzegel en breng vierkante vijzelplaten van Pseudomonas putida over die zijn getransformeerd met plasmidevariantbibliotheek-DNA naar het koloniekiezersplatform. Gebruik de koloniekiezer om elke voorgevulde put te inoculeren met een enkele kolonie van de transformatorplaten. Sluit de geënte platen opnieuw af en breng ze over naar een offline schudbroedmachine.

Plaats na de incubatie de gegroeide platen terug op het vloeistofbehandelingsplatform en verwijder de afdichting. Klik op uitvoeren naast het protocol glycerol toevoegen aan MTP. Zorg ervoor dat de plaatlay-out op het scherm overeenkomt met die van het dock voor vloeistofbehandeling.

En klik achtereenvolgens op OK om het protocol uit te voeren. Als u klaar bent, sluit u de platen af en mengt u ze kort in een offline schudbroedmachine met 800 omwentelingen per minuut gedurende vijf minuten. Barcode de borden en bewaar ze bij 80 graden Celsius tot je ze nodig hebt.

Bereken de benodigde hoeveelheid met antibiotica aangevulde media voor deepwell-blokken. Klik op uitvoeren naast het DWB-programma voor vloeistofoverdracht. Zorg ervoor dat het medium in het juiste reservoir wordt geplaatst.

De lege deep-well blokken bevinden zich op de juiste lay-outposities en er is voldoende voorraad tips beschikbaar. Stel het programma in om 495 microliter media af te geven. Als u klaar bent, klikt u achtereenvolgens op OK om het programma te starten.

Sluit nu de gevulde deepwell-blokken af met een ademend membraan en breng ze over naar tijdelijke opslag bij 4 graden Celsius. Klik vervolgens op uitvoeren naast het inoculaat van ontdooid MTP-programma. Zorg ervoor dat MTP cryo voorraden en vulblokken voor diepe putten per lay-out naar het platform worden overgebracht en dat er voldoende tips worden geladen.

Klik achtereenvolgens op OK om te initialiseren. Wanneer het programma is afgelopen, sluit u de geënte 's nachts deep-well blokken af met een ademend membraan. Breng ze over naar een offline plate shaker-incubator die 16 uur lang is ingesteld op 30 graden Celsius, 800 omwentelingen per minuut en 75% luchtvochtigheid.

Verzegel, meng en breng cryostock microtiterplaten terug naar de vriezer van 80 graden Celsius. Bereken nu het benodigde volume media aangevuld met verschillende effector- en antibioticaconcentraties voor de nachtelijke deepwell-blokken die moeten worden gescreend. Klik op uitvoeren naast het DWB-programma voor vloeistofoverdracht.

Zorg er vervolgens voor dat de met effector aangevulde mediareservoirs correct zijn geplaatst. Voeg lege deepwell-blokken toe aan het liquid handler-platform. Als er voldoende tips beschikbaar zijn, klikt u achtereenvolgens op OK om het protocol te starten om testblokken voor diepe putten te genereren.

Sluit na het vullen de deep-well blokken van de test af met een ademend membraan. Vul de vloeistofverwerker bij met lege platen. Herhaal de inoculatie totdat alle analyseblokken gevuld zijn.

Klik vervolgens op uitvoeren naast het DWB-programma voor overbrengen naar test. Nadat niet-verzegelde testblokken met met effector aangevulde media correct zijn geplaatst, brengt u 's nachts deepwell-blokken met gekweekte P.putida over en verwijdert u deze per lay-out. Klik achtereenvolgens op OK om het protocol te starten.

Wanneer het programma is afgelopen, verzegelt u de testplaten naar de offline incubator. Gooi de nachtelijke deepwell-blokken na inoculatie weg. Breng vervolgens de deepwell-blokken over in een centrifuge.

Pelletcellen bij 4.000 G in een door ijs gecontroleerde rotor bij 18 graden Celsius gedurende vijf minuten. Nadat u de supernatant hebt weggegooid, plaatst u de centrifugeblokken op het vloeistofbehandelingsplatform. Bereken het volume van één keer PBS dat nodig is op basis van het aantal te screenen deepwell-blokken.

Klik op uitvoeren naast de test, stel het PBS-resuspensie DWB-programma in en stel het doseervolume in op 500 microliter. Zorg er vervolgens voor dat PBS aan het juiste reservoir wordt toegevoegd en rangschik de gecentrifugeerde platen op basis van de lay-out. Klik op OK om het programma te starten nadat u de beschikbaarheid van fooien hebt bevestigd.

Sluit de geresuspendeerde deepwell-blokken opnieuw af en verwijder deze uit de vloeistofverwerker. Controleer de onderkant van de plaat om er zeker van te zijn dat de pellets volledig opnieuw zijn gesuspendeerd. Klik op uitvoeren naast de cellen van de testinstellingen en het MTP-programma van de PBS-editie.

Breng vervolgens geresuspendeerde deepwell-blokken over in de vloeistofverwerker volgens de lay-out. Laad de lege microtiterplaten volgens de lay-out en stel het doseervolume in op 200 microliter voordat u op OK klikt. Breng de gevulde microtiterplaten over naar een offline multi-mode plaatlezer en meet de relatieve fluorescentie en OD600.

Geautomatiseerde screening van 5.000 promotorvarianten identificeerde topkandidaten met een meer dan 3,6-voudige activering. De EC 50-waarden voor 100 unieke varianten werden uitgezet om de gevoeligheidsverdeling te visualiseren en robuuste kandidaten te identificeren. EC 50-waarden werden berekend voor 226 verrijkte varianten en gerangschikt met behulp van Lin-log-transformatie om een bibliotheek op gevoeligheidsschaal te vormen.

Er werd een definitief screeningsontwerp gemaakt met behulp van een afwijking van 1, 0 en 1 niveau uit vier modules. Transport, Regulator, P-out en Output Ribosome-Binding Site-modelprofielen onthulden hoe veranderingen in expressieniveaus van de vier modules niet-lineair van invloed waren op EC 50 en de Hill's-coëfficiënt. Identificeren van optimale expressiecombinaties met RBS-Out, die een sterk positief effect laten zien op zowel de gevoeligheid als de helling.

De wereldwijd geoptimaliseerde biosensorvariant met ideale modulesterktes vertoonde een verbeterde gevoeligheid en Hill-coëfficiënt in vergelijking met zowel de ouderlijke als de DSD-geoptimaliseerde versies.