3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen

We hebben een 3D-co-kweeksysteem ontwikkeld dat de darmslijmvliesomgeving nabootst om de seriële crosstalk te bestuderen en de geneesmiddelresponsen te evalueren, die gebruikt kunnen worden voor geneesmiddelscreening en voor het begrijpen van mucosale cellulaire interacties. Verschillende groepen hebben verschillende kweeksystemen ontwikkeld om het darmslijmvlies te modelleren met zeer complexe bio-engineeringtechnieken. Maar in plaats daarvan ontwikkelden we een co-cultuursysteem dat veel makkelijker te maken is met goedkopere materialen.

Ons co-kweeksysteem toonde aan dat een protenogeen medicijn gecoördineerde responsen oproept tussen darmbacteriën, epitheel- en immuuncellen, waardoor de gastheerimmuniteit waarschijnlijk met onze bacteriële metabolieten wordt geactiveerd en de communicatie tussen soorten wordt bemiddeld. We streven ernaar zowel aerobe als anerobische bacteriestammen en hun metabolieten te bestuderen om immuunmodulerende effecten te ontdekken, waarmee we de weg vrijmaken voor nieuwe immunotherapeutische strategieën gebaseerd op bacteriële metabolieten. Om te beginnen open je een deksel van een petrischaal en zet je het opzij.

Plaats een scalpelblad op de rand van de onderkant van de petrischaal. Neem een set steriele pincet en pak voorzichtig de onderkant van het inzetstuk omhoog om het uit de verpakking te halen. Met de andere hand neem je het steriele scalpelblad en breng het naar de inzet.

Met een C-vormige beweging doorboor je het membraan aan de rand en schuif je het scalpelblad voorzichtig rond de onderkant van de insert, dicht bij de plastic wand. Knip het PET-membraan eruit en gebruik de tweede set pincet om het te verwijderen. Gebruik vervolgens het scalpelblad om eventuele witte membraankrullen te schrapen om de rand en rand van de inzetstuk schoon te maken.

Spreid vervolgens voorzichtig een 2-3 millimeter siliconenkraal helemaal rondom de onderkant van de inzetstuk, waarbij je voorzichtig bent dat je het membraan niet raakt. Pak de tweede set steriele tangen en til voorzichtig de eerste inzet zonder membraan uit het beschermpakket te halen. Breng de twee inserts van onder naar beneden samen zodat de onderste velgen uitlijnen.

Wanneer de Flipwell-stapel is gelijmd, plaats je deze in het originele steriele pakje of een diepe petrischaal om 72 uur te drogen. Gebruik het deksel van de opgegeven petrischalen om de stapel af te dekken. Om de stapelassemblages te steriliseren, gebruik je een steriele tang om de Flipwell-stapel aan de rand van de gespecificeerde diepe petrischaalrand te hangen.

Sluit vervolgens de glazen sash van de bioveiligheidskast en zet het ultraviolet licht aan. Om lekkage te testen vóór collageencoating, voeg je eerst 500 microliter steriele PBS of steriel gedeïoniseerd water toe. De volgende dag aspireer je de vloeistof die voor het testen wordt gebruikt voordat je de stapels 1-2 uur in de bioveiligheidskast laat drogen.

Om het membraan met collageen te bedekken, open je het deksel van de Petrischaal en laat je de Flipwell aan de rand van de Petrischaal hangen. Voeg voorzichtig 200 microliter collageenoplossing toe aan één kant van de inlegsteenstack. Aspireer de collageenoplossing na een uur, en pipette vervolgens 200 microliter steriele PBS. Na het aspireren van de PBS dek je de petrischaal af met een deksel en laat je het membraan 60 minuten drogen in de kast.

Als het membraan droog is, gebruik dan een steriele pincet of pincet en draai de Flipwell naar de andere kant zodat je hem aan de rand van de Petrischaal laat hangen. Om het bacteriële inzetstuk te maken, plaats je twee sets steriele pincetten en de 24-wells inzetstukken in de bioveiligheidskast. Met een steriele pincet haal je het inzetstuk uit het steriele pakket.

Met de tweede set pincet of pincet breek je de kleine plastic voetjes onderaan de inzetplaat af. Test de 24-put insert door deze in een van de steriele Flipwell co-culture insertstacks of de originele 12-well inserts te plaatsen. Om te beginnen met het zaaien van de Flipwells, zaai je 500 microliter van de epitheelcellijnen aan elke kant van de apicale zijde van de Flipwell.

Bedek de assemblages met een petrischaaldeksel en incubeer dan bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide tot de cellen hechten. Open het deksel van de Petrischaal en aspireer het DMEM-medium aan de apicale kant van de Flipwell-stack. Met een steriele pincet pak je de Flipwell voorzichtig bij de haak en draai je hem 180 graden.

Met de tweede set steriele tang pak je de Flipwell-stack bij de andere haak die nu naar boven wijst. Laat de assemblage vervolgens weer in de petrischaal zakken en hangt de haak over de rand van de petrischaal. Voeg 500 microliter THP-1-celsuspensie toe aan de apicale zijde van de co-kweek insertstack.

Pas het HT-29-medium aan voor de epitheelcellen van de dikke darm door media toe te voegen aan de diepe petrischaal. Om luchtbellen te verwijderen, houd je de Flipwell-stack met een steriele tang bij de arm vast. Laat voorzichtig een gavagenaald in en onder de insert-assemblage zakken en plaats de zachte punt heel voorzichtig tegen de luchtbel.

Trek voorzichtig en heel langzaam de zuiger van de spuit omhoog en kijk hoe de luchtbel langzaam verdwijnt. Verwijder dan voorzichtig de naald en spuit uit de Flipwell. Nadat de luchtbellen met een gavenaald zijn verwijderd, kweek je beide celtypen in de celkweekincubator.

Met een pincet plaats je het inzetstuk in een steriele petrischaal en bedek je het met het deksel. Breng de petrischaal met de Flipwells in de bioveiligheidskast en zet deze aan de andere kant van de schaal met bacteriële inzetstukken opzij. Pipette 300 microliter DMEM-medium uit de apicale zijde van de Flipwell om plaats te maken voor het bacteriële inzet, en dek het daarna af met het deksel van de Petrischaal.

Voeg nu 50 tot 100 microliter Bacillus subtilis-cultuur toe aan de 24-well bacteriële inserts en plaats deze in de bovenkant van de Flipwell. Draai de arm en hang hem aan de rand van de Flipwell co-culture insertstack. Houd de stapel vast met de tweede set steriele pincetten.

Na een incubatie van drie uur gebruik je een steriele tang om het bacteriële inzetstuk uit de Flipwell te verwijderen. Plaats de Flipwell in een 50-milliliter conische buis zonder uit elkaar te halen. Om de Flipwell uit elkaar te halen voor elektronenmicroscopie, houd je hem met beide handen vast en draai je elk gelijmd deel van de stapel af.

Draai het inzetstuk met het membraan en zet het neer met het membraan naar boven gericht. Houd het inzetstuk vast, snijd het membraan voorzichtig uit met een scalpelblad en plaats het vervolgens in een 1,7 milliliter buis met paraform-aldehydeoplossing. Voor confocale microscopie voeg 300 microliter steriele PBS toe aan de apicale zijde.

Verwijder de stapel voorzichtig uit de petrischaal nadat je de PBS hebt gepipetteerd. Draai nu de Flipwell om en voeg 300 microliter PBS toe aan de nu opwaarts gerichte RPMI-zijde van de Flipwell co-culture insertstack, en aspireer vervolgens de fosfaatgedempte zoutoplossing. Met een pipet van 200 microliter maak je een grote druppel PBS.

Draai de insert-assemblage los om deze in de inserts te scheiden. Plaats vervolgens voorzichtig de Flipwell-stapel met THP-1-cellen bovenop de 200-microliter druppel PBS. Voeg 200 microliter permeabilisatiebuffer toe aan de bovenzijde met colon-epitheelcellen en laat het 10 minuten staan.

Voor immunofluorescerende kleuring pipetten jullie 300 microliter primair antilichaam naar de bovenkant van de insert. Voeg 300 microliter primair antilichaam toe aan de put van een 12-put plaat en plaats vervolgens het inzetstuk in de put bovenop de druppel. Bedek het antilichaam goed.

Kleuring toonde een dramatische toename van slijmafscheiding in het darmepitheelcompartiment na sepiapterinebehandeling, zoals blijkt uit de toename van het epitheelmarkerproteïne CK20 en het mucosale eiwit MUC2. In THP-1 monoculturen verhoogde de sepiapterinebehandeling significant de expressie van de M1-macrofagenmarker CD80, terwijl de M2-macrofagenmarker CD163 werd verlaagd, wat wijst op M1-polarisatie. Scanning-elektronenmicroscopie toonde een verhoogde slijmafscheiding uit epitheelcellen in met septer behandelde co-culturen.

Sepiapterinebehandeling induceerde macrofagenmorfologie die lijkt op het M1-fenotype in zowel monoculturen als co-culturen. Bacteriële cellen in met sepiapterine behandelde monoculturen vertoonden gerimpelde oppervlakken die kenmerkend zijn voor biofilmvorming.