Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

We richten ons op het ontwikkelen van hoogwaardige CTC-isolatie- en analysemethoden om precisie-oncologie te bevorderen via vloeistofbiopsie. Huidige commerciële CTC-isolatieplatforms hebben een lage doorvoer en efficiëntie. Ze zijn ook niet compatibel met downstream analyseplatforms, wat het herstel van biologische informatie beperkt.

Deze studie maakt gebruik van een microfluidic CTC-isolatieplatform om de detectiesnelheden aanzienlijk te verbeteren. We passen ook een zeldzame single cell sequencingchip toe voor diepere vloeistofbiopsie-analyse. Om te beginnen pipette je 25 microliter gewassen en opnieuw gesuspendeerde streptavidine-gemodificeerde magnetische kralen in een buis met één microgram biotinylerd EpCAM-antilichaam.

Incubeer het mengsel op kamertemperatuur terwijl het 40 minuten lang draait met 20 omwentelingen per minuut om de immunomagnetische kralen voor te bereiden. Met een magnetisch rek scheid je de kralen van het supernatant. Na het verwijderen van het supernatant worden de kralen opnieuw opgehangen in 25 microliter isolatiebuffer.

Pipetteer binnen één tot twee seconden 20 microliter van de magnetische kraal-suspensie, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de chip onmiddellijk verticaal op een magneet en laat de kralen vijf minuten onverstoorbaar bezinken. Verzamel vier milliliter van het bloedmonster in een spuit, zodat luchtbellen worden verwijderd.

Sluit de inlaat en uitlaat van de chip af met vloeistof om luchtbellen te voorkomen, en steek vervolgens de inlaat en uitlaatbuizen van het monster in de chip. Met een spuitpomp injecteert u het monster met een debiet van 1,5 milliliter per uur. Na het laden van het monster injecteer je 60 microliter DPBS in de HB-chip met een doorstromingssnelheid van 0,2 milliliter per uur om losgebonden cellen af te wassen.

Verwijder de magneet en injecteer handmatig 1,5 milliliter 5%BSA om de chip te wassen en gevangen tumorcellen vrij te laten. Bereid een oplossing van 10% MPTS in ethanol. Breng onmiddellijk 20 microliter van de oplossing in de HB-chip en incubeer het een uur op kamertemperatuur.

Spoel de HB-chip één keer af met watervrije ethanol en droog hem dan een uur op 100 graden Celsius. Bereid vervolgens de GMBS-oplossing in ethanol met een concentratie van 0,5 milligram per milliliter. Na het afkoelen van de chip tot 37 graden Celsius, breng je de GMBS-oplossing in en incubeer je.

Spoel het HB-chip twee keer af met dubbel gedestilleerd water, gevolgd door twee spoelingen met DPBS. Voeg onmiddellijk 15 microgram streptavidine per milliliter toe aan de HB-chip en laat het één uur bij kamertemperatuur incuberen of 's nachts bij vier graden Celsius. Spoel na de incubatie de HB-chip twee keer af met DPBS-zoutoplossing.

Bereid nu de CD45-antistofbuffer voor door 0,2% BSA en 20 microgram per milliliter biotinyleerd CD45-antilichaam toe te voegen aan DPBS en pas het aan op het uiteindelijke volume. Injecteer 20 microliter van de CD45-antistofbuffer in de HB-chip voor negatieve selectie van witte bloedcellen. Na een incubatie van een uur op kamertemperatuur, spoel je de chip af met DPBS.

Voeg een blokkeringsoplossing met 3% BSA en 0,05% Tween 20 toe aan de HB-chip. Aspireer het voorbereide monster in een spuit, waarbij je ervoor zorgt dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Daarna sluit je de inlaat en uitlaat van de chip af met vloeistof en verbind je de inlaat- en uitlaatbuizen met de chip.

Met een spuitpomp injecteert u het monster met een debiet van 0,6 milliliter per uur. Verzamel gezuiverde tumorcellen uit de chipuitgang voor tellen en singlecelsequencing. Pipette 200 microliter 0,5%F-68 oplossing bereid in DPBS in de chipinlaat.

Voer waterbadsonicatie uit terwijl je de chip vasthoudt. Wanneer bellen zichtbaar zijn in het microporeuze gebied, ga je 30 seconden door met sonicatie om de bellen uit de dubbele wellen te verwijderen. Vervolgens injecteer je 200 microliter tumorcelsuspensatie in de chip met 60.000 dubbele putten.

Pipetteer de celsuspensie in de chip voorzichtig twee keer omhoog en omlaag. Plaats het daarna weer op een ontkleuringsshaker voor vijf minuten om de niet-gevangen cellen opnieuw te laten ophangen en ze weer te laten zakken. Voeg nu 200 microliter DPBS en 0,5% F-68 oplossing toe via de inlaat en aspiratie uit de uitlaat.

Na het opnieuw ophangen van de barcode-bead suspension injecteer je onmiddellijk 200 microliter suspensie in de chipinlaat en schud je met 10 omwentelingen per minuut gedurende 20 seconden. Pipetteer voorzichtig de suspensie twee keer voordat je het terug op de shaker plaatst. Haal nu barcode-bead suspension uit de uitlaat, en pipetteer vervolgens 200 microliter 20X Tris-EDTA en 50 millimolar dithiothreitol oplossing.

Haal vloeistof uit de uitgang. Voor cellysie en MRNA-vangst voeg je langzaam 200 microliter cellysebuffer toe aan de chipinlaat. Voeg onmiddellijk 200 microliter minerale olie toe om de dubbele putten af te sluiten.

Verwijder de oplossing die van de chip-uitlaat naar het afvalreservoir stroomt. Leg het chipje horizontaal en laat het vijf minuten op kamertemperatuur staan. Voeg langzaam 200 microliter 6x zoutoplossing natriumcitraat toe aan de inlaat.

Verwijder de afvalvloeistof en aspireer de resterende oplossing uit de chip-uitgang. Voeg langzaam 200 microliter 6x zoutoplossing natriumcitraat toe om de chip te vullen. Houd een magneet dicht bij het chipoppervlak en beweeg deze langzaam van de inlaat naar de uitlaat om gestreepte kralen te verzamelen.

Aspiraat snel de oplossing en pareltjes in een centrifugebuis met 6X zoutoplossing natriumcitraat. Was de gestreepte kralen drie keer met 200 microliter 6x zoutoplossing natriumcitraat, gevolgd door één keer met een reverse transcriptiebuffer. Een gelijkmatige verdeling van immunomagnetische kralen werd waargenomen onder een magnetisch veld, terwijl minimale restkralen na magnetische verwijdering een succesvolle afgifte bevestigden.

De CTC-isolatiechip ving efficiënt tumorcellen uit zowel 1 milliliter als 10 milliliter monsters. De toevoeging van de zuiveringschip verhoogde de zuiverheid van de tumorcellen verder. In perifere bloedmonsters met minimale LNCaP-cellen behield het CTC-sorteersysteem een hoge vangefficiëntie en zuiverheid.

De single cell barcoding chip behaalde een bezettingsverhouding van 85,6% en 95,7% barcoded bead, wat resulteerde in een koppelingspercentage van 81,9%. Het verhogen van het aantal geladen cellen verbeterde de bezettingsverhouding van microwells zonder de vangefficiëntie te verminderen. De geïntegreerde CTC-isolatie- en single-celsequencing-workflow produceerde zeer zuivere tumorcellen en behield nauwkeurig de oorspronkelijke tumorcelverhoudingen. TSNE-analyse scheidde PC3-, LNCaP- en Jurkat-cellen duidelijk in drie clusters, elk gekenmerkt door unieke markerexpressie.

Het Jurkat-celcluster werd geïdentificeerd door sterke expressie van TRBC1, IGLL1, CD1E en CD3D, bevestigd door verrijking van de routes voor T-celactivatie. PC3- en LNCaP-clusters werden onderscheiden door differentieel expressieve genen, waarbij PC3 een hoge microseminoproteïneexpressie vertoonde en LNCaP NEDD4 tot expressie bracht.