Bijgewerkt protocol voor de assemblage en het gebruik van de Minibioreactor Array (MBRA)

Ons onderzoek richt zich dus op het darmmicrobioom, met name hoe het kan worden gemanipuleerd om de kolonisatie van schadelijke ziekteverwekkers te voorkomen. Tegelijkertijd zijn we ook geïnteresseerd in het begrijpen van de ecologische regels en mechanismen achter deze kolonisatieresistentie. Technologie, zoals sequencing van de volgende generatie, geavanceerde bio-informatica, kiemvrije muizen en in-vitro-darmmodellen, veranderen allemaal de manier waarop we microbiële gemeenschappen en hun rol in gezondheid en ziekte bestuderen.

Een van de grootste uitdagingen bij in-vitro darmmodellen is het gebruik ervan met een hoge doorvoer. Wat we nodig hebben, zijn systemen die het mogelijk maken om microbiële gemeenschappen op grote schaal functioneel te ondervragen. De minibioreactor-array is een continu stroomcultuursysteem dat is ontworpen om het gebrek aan doorvoercapaciteit in andere systemen aan te pakken.

Het stelt ons in staat om experimenten op te schalen en toch complex en reproduceerbaar microbieel gemeenschapsgedrag vast te leggen. Zorg er om te beginnen voor dat de strips van de minibioreactor-array 3D-geprint zijn en zes onafhankelijke bioreactorkamers bevatten. Rangschik alle componenten die nodig zijn voor de montage.

Gebruik een 1/4-inch 28 NF-fractietap met een T-handgreepsleutel. Schroef de drie 1/4-inch poorten in elke kamer vast om fittingen te plaatsen. Nadat u de kamer met water hebt gewassen, plaatst u een magnetische roerstaaf van 10 bij 3 millimeter in elke kamer en voegt u een milliliter gedestilleerd water toe.

Plaats vervolgens een rubberen ring bovenop elke poort van de bioreactor. Schroef voor elke kamer één mannelijk kunstaas met mediastro met schroefdraad, één mannelijk kunstaas met afvalstro met schroefdraad en één mannelijk kunstaas met lege schroefdraad in de poorten. Plaats nu zes rubberen septa op 3/32-inch vrouwelijke kunstaasweerhaken en vouw de bovenste mouw van elk septum naar beneden om de nek te bedekken.

Sluit deze aan op de daarvoor bestemde poorten van elke kamer. Knip C-flex slangstrips van de gewenste lengte en aantal. Bevestig een 1/8-inch vrouwelijke kunstaashaak aan het ene uiteinde en een mannelijke lokvergrendelingsconnector aan het andere uiteinde van elke lengte buis.

Steek vervolgens een 1/16-inch vrouwelijke kunstaashaak in elk uiteinde van de rode twee-stop E-lab-buis met een binnendiameter van 1.14 millimeter en de oranje twee-stop E-lab-buis met een binnendiameter van 0.89 millimeter. Sluit de voorbereide E-lab slang aan op de C-flex slang en zorg ervoor dat elk van de zes C-flex buislengtes is aangesloten op één rode en één oranje E-lab lijn via vrouwelijk kunstaas. Knip vervolgens de C-flex-slang naar wens op verschillende lengtes.

Bevestig 1/8-inch vrouwelijke kunstaasweerhaak en een mannelijke lokvergrendelingsconnector aan beide uiteinden van een 3-inch stuk en het 12-inch stuk C-flex-buis. Bevestig de mannelijke lokvergrendelingsconnectoren aan beide uiteinden van de overige stukken. Monteer de afvalleidingboom volgens het 3D-diagram.

Bevestig de blootliggende uiteinden van de rode twee-stop E-lab-slang aan de eindvergrendelingen voor mannelijk kunstaas op de afvalleidingboom in oplopende volgorde op basis van de lengte van de C-flex-buis. Sluit vervolgens de 3-inch C-flex-buis met de 1/8-inch vrouwelijke kunstaashaak en mannelijke lokvergrendelingsconnector aan op de bovenkant van de afvallijnboom. Monteer de invoerlijnboom volgens het 3D-diagram.

Overbrug de blootgestelde uiteinden van de oranje twee-stop E-lab-buis naar de terminale mannelijke kunstaasvergrendelingen op de invoerlijnboom in oplopende volgorde op basis van de lengte van de C-flex-buis, en bevestig de 12-inch C-flex-buis aan de bovenkant van de invoerlijnboom. Bevestig de C-flex-slang met variabele lengte aan het einde van de voedingslijnboom aan de bioreactor en rangschik ze in oplopende volgorde van de kortste lijn aan de linkerkant tot de langste aan de rechterkant. Bevestig de C-flex-slang met variabele lengte aan het einde van de afvalleidingboom aan de bioreactorstrip in aflopende volgorde met de langste lijn aan de linkerkant en de kortste aan de rechterkant om de plaatsing van de pomp mogelijk te maken.

Bundel alle C-flex toevoerleidingen aan de linkerkant van de strip samen en zet ze vast met een kabelbinder. Vorm een lus met de oranje twee-stop E-lab-slang tussen de C-flex-lijnen en zet de lus vast met autoclaaftape, en herhaal het proces voor de rode twee-stop E-lab-slang aan de afvalzijde van de bioreactorstrip. Bedek het vrouwelijke kunstaas aan het einde van de afval- en voederlijn bomen met folie om besmetting te voorkomen.

Maak het kunstaas met mannelijke schroefdraad los met septa op elke bioreactorkamer om stoom te laten ontsnappen tijdens het autoclaveren. Nadat u het geheel in een autoclaafbak hebt geplaatst, rekt u de bomen van de voer- en afvallijn uit in afzonderlijke bakken naast de bak met de MBRA-strips. Om het systeem aan de pompen te bevestigen, verwijdert u de autoclaaftape waarmee de E-lab-slangen voor zowel afval- als toevoerleidingen zijn bevestigd en maakt u de bundels C-flex-slangen los.

Plaats de MBRA tussen de twee pompen bovenop de roerplaat. Klem het vast met behulp van de 3D-geprinte houders en lijn het uit met de gemarkeerde roerposities op de plaat. Bevestig nu de E-lab-slang van de toevoerleiding aan de slangenpompcartridges en plaats de slangstops in de cartridgesleuven.

Herhaal het proces voor de E-lab-slang van de afvalleiding op de pomp die zich rechts van de roerplaat bevindt. Vergrendel vervolgens de patronen van de peristaltische pomp in de pomp. Schik de C-flex slang netjes met behulp van de 3D geprinte buishouders.

Sluit het uiteinde van de afvalleidingboom aan op de slang die is aangesloten op de afvalflessen. Bevestig vervolgens het vrouwelijke kunstaas op de invoerslang van de invoerlijn aan de mannelijke connector op de 12-inch buis vanaf de dop van de mediafles. Zet beide pompen aan om de mediastroom te starten en zorg ervoor dat beide pompen zijn ingesteld op draaien met de klok mee wanneer het afval rechts van de pompen wordt geplaatst.

Let op de druppelgrootte en cadans in elke bioreactorkamer. Als er enige variabiliteit of afwijking wordt opgemerkt, vervang dan de oranje twee-stop E-lab-slang die is aangesloten op de aangetaste kamer om variatie in het debiet te verminderen. Zodra de kamers vol zijn, sluit u beide pompen af en laat u de bioreactoren 24 tot 48 uur staan om te controleren op besmetting voordat u met het experiment begint.

Schakel de media-invoer over naar een container van één liter met 10% bleekmiddel in gedeïoniseerd water en verhoog het debiet op beide pompen tot maximaal om de inhoud van de bioreactorkamers te vervangen door bleekmiddel. Zodra de kamers vrij zijn van media, keert u de MBRA om om gedurende vijf minuten boven de vullijn te desinfecteren. Zet na vijf minuten het systeem recht en wacht nog eens vijf minuten op sterilisatie.

Nadat de kamers zijn ontdaan van media en gedurende 10 minuten zijn gesteriliseerd, vervangt u het bleekmiddel door een liter gedeïoniseerd water en spoelt u het systeem door totdat het water is doorgelaten. Koppel vervolgens de slangen van de bioreactor E-lab los van de pompen en verwijder de MBRA's. Verwijder de gebruikte septa uit de bioreactor en laat elke kamer leeglopen tot er nog maar één milliliter water over is.

Vervang de septa, de oranje two-stop E-lab slang, en autoclaaf de volledig geassembleerde strip zoals eerder gedemonstreerd. Volg deze stappen na drie cycli van hergebruik. Een menselijk fecaal monster werd bereid en gekweekt in het MBRA-systeem.

Na vier dagen van continue stroom werd de microbiële gemeenschap in alle negen bioreactoren gedomineerd door 18 bacteriegeslachten, die elk ten minste 2% van de relatieve overvloed in een replicaat omvatten. 22 van de 65 gedetecteerde geslachten waren aanwezig in alle negen bioreactorreplicaten, wat een hoge reproduceerbaarheid aantoont. Alfa-diversiteitsanalyse toonde minimale variatie tussen replicaten in zowel de geobserveerde operationele taxonomische eenheden als de Shannon Diversity Index.