Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Ons in-vitromodel van driedimensionale stamcelafgeleide menselijke hartspier verbetert de biotrouw van traditionele tweedimensionale celkweek en elimineert de verschillen tussen soorten die gepaard gaan met proefdierproeven. Ons multi-weefsel bioreactorontwerp met stabiele posttrackers maximaliseert het weefselsucces en verbetert de nauwkeurigheid van diepgaande karakterisering van de gemanipuleerde hartweefselfunctie. Aangezien hartfalen wereldwijd nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak is, stellen onze gemanipuleerde hartweefsels onderzoekers in staat om hartziekten bij de mens te modelleren en potentiële therapieën te screenen.

Plaats om te beginnen vier aluminium negatieve mastercasts in de casthouder, zodat de paalgaten zijn uitgelijnd met de dode ruimte tegenover de driehoekige planken. Plaats het apparaat tussen twee parallelle beugels en klem de zijkanten aan elkaar met behulp van een rechthoekig stuk siliconenfolie van 0,5 millimeter dik als pakking om lekkage van de vloeibare PDMS te voorkomen. Meng in een ondiepe bak 0,5 milliliter PDMS-uithardingsmiddel met vijf milliliter PDMS-elastomeerbasis in een verhouding van één op 10 en roer krachtig gedurende vijf minuten.

Ontgas het PDMS-mengsel in een vacuümkamer onder sterk vacuüm totdat de belletjes zijn verdwenen. Giet vervolgens het PDMS-mengsel op het gietapparaat en vul het te vol om een volledige dekking van elke sleuf te garanderen. Voeg kleine gekleurde glaskralen toe aan het lichaam van de PDMS-rekken tegenover de zijkant met de palen voor de unieke identificatie van elk rek.

Plaats het gietapparaat horizontaal waterpas in de vacuümkamer onder een sterk vacuüm gedurende ten minste 12 uur. Laat het PDMS 48 uur lang uitharden bij kamertemperatuur, uit de buurt van stof, om volledige uitharding en maximale sterkte van de delicate stiften mogelijk te maken. Verwijder de klem, beugels en siliconenfolie van het gietapparaat.

Snijd met een roestvrijstalen scheermesje de PDMS-film aan de bovenkant van het gietapparaat en de framesteunen weg. Gebruik vingers om de PDMS-rekken van de zijkanten van de gipshouder te scheiden. Steek een bot roestvrijstalen scheermesje in de dode ruimte tussen het gips en de gipshouder en wrik ze uit elkaar, waarbij u ervoor zorgt dat het PDMS dat de dode ruimte vult, bij de gipshouder blijft.

Snijd vervolgens met een scherp roestvrijstalen mes de resterende PDMS-films en de dode ruimte PDMS weg van de uiteinden van de palen. Scheid met de vingers langzaam het PDMS-rek van het gips aan de kant tegenover de palen. Ga door met het afwisselen van kanten totdat de palen vrij zijn van de hoofdworpen.

Maak alle PDMS-rekken en de palen vrij zoals eerder gedemonstreerd, en gebruik een scherp scheermesje om eventuele resterende overtollige PDMS uit de rekken weg te snijden. Gebruik een thermoplastische 3D-printer voor gefuseerde depositiemodellering om de componenten van het stabiele posttracker- of SPoT-gietapparaat te printen. Zorg voor een veilige perspassing tussen de 3D-geprinte stukken en tussen de PDMS-rekken en de drietandige mal.

Controleer ook of de PDMS-rekken goed passen met de palen die net de bodem van de putten bereiken zonder te worden gebogen. Meng 0,5 milliliter zwart PDMS deel A tot 0,5 milliliter deel B in een kleine weegboot of een ondiepe container tot de oplossing uniform van kleur is. Ontgas de gemengde zwarte PDMS in een vacuümkamer onder sterk vacuüm gedurende 20 minuten.

Giet de ontgaste zwarte PDMS op de 3D-geprinte basis om de gaten te vullen en tik om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen achterblijven. Schraap zoveel mogelijk overtollig PDMS van de basis. Klik het drietandige stuk op de basis en plaats de PDMS-rekken in de groeven op de drietandige mal, waarbij u ervoor zorgt dat de uiteinden van de palen in de zwarte PDMS in de cirkelvormige putten duiken.

Laat de zwarte PDMS 48 uur uitharden bij kamertemperatuur, uit de buurt van stof. Schuif het drietandige stuk naar buiten, waardoor de spanning op de palen tot een minimum wordt beperkt. Schraap met een kleine pincet de dunne zwarte PDMS-film rond elke SPoT weg en steek vervolgens een fijngepunte, gebogen pincet in de SPoT-put om deze los te maken van de 3D-geprinte basis.

Inspecteer de SPoT's en knip eventuele resterende zwarte PDMS-film van het gietproces af met een fijne vannasschaar. Zorg ervoor dat de afgewerkte palen de juiste lengte hebben door de PDMS-rekken op het frame van de polys-mobiele telefoon te plaatsen en deze vervolgens op de zwarte grondplaat te schuiven. Na het autoclaveren van de bioreactor en het bereiden van het celmengsel, gaat u verder met het vervaardigen van de hECT's.

Verwijder met steriele handschoenen de zwarte grondplaat uit de geautoclaveerde zak met de onderdelen van de bioreactor en plaats deze in een schaal van 60 milliliter met de putjes naar boven gericht. Pipetteer langzaam 44 microliter van het celmengsel in elk putje om te voorkomen dat er belletjes ontstaan. Draag een nieuw paar steriele handschoenen en verwijder het polysulfonframe met de PDMS-rekken uit de autoclaafzak.

Laat het frame op de grondplaat zakken zodat de uiteinden van het frame in de groeven aan het uiteinde van de grondplaat passen. Zorg ervoor dat de palen allemaal recht zijn en het frame niet gekanteld is, plaats de bioreactor in een schaal van 60 millimeter. Voeg een milliliter 10% FBS in onderhoudsmedium voor cardiomyocyten toe aan de schaal van 60 milliliter om de luchtvochtigheid te verhogen naarmate de hECT's stollen.

Plaats de schaal zonder deksel in een spraakmakende schaal van 100 millimeter en dek deze af met een deksel van 100 millimeter, en plaats de bioreactor vervolgens terug in een incubator van 37 graden Celsius, 5% kooldioxide om het collageen een gel te laten vormen met de cellen in suspensie. Haal de schaal na twee uur uit de broedmachine. Voeg 13 milliliter 10%FBS toe aan het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten en kantel de schaal zodat het medium tussen de PTFE-grondplaat en de PDMS-rekken kan stromen.

Inspecteer de bioreactor vanaf de zijkant op geen luchtbellen en plaats de schaal terug in de incubator. Als er lucht vastzit, kantel dan de bioreactor uit het medium om de bel te laten breken en laat hem langzaam weer zakken, of gebruik een micropipet met een gellaadtip om de lucht over te hevelen zonder de palen te verstoren. Inspecteer de hECT-verdichting door het raam in het kozijn.

Gedurende 24 tot 96 uur worden de hECT's compact en ondoorzichtig. Verwijder de grondplaat wanneer de hECT's met ten minste 30% zijn verdicht ten opzichte van de oorspronkelijke diameter. Vul de schaal van 60 millimeter met de bioreactor met onderhoudsmedium voor cardiomyocyten totdat de vloeistof met de rand van de schaal spoelt en voeg 14 milliliter toe aan een nieuwe schaal van 60 millimeter.

Draai de bioreactor met steriele handschoenen om in de schaal zodat de grondplaat erop ligt. Nadat u hebt geïnspecteerd op ingesloten luchtbellen, tilt u de grondplaat langzaam op en houdt u deze waterpas. Zorg ervoor dat de posttips scherp zijn.

Zet de drempelschakelaar aan en pas de schuifregelaar aan totdat de SPoT's mooi zijn afgebakend en niet van vorm veranderen als de hECT samentrekt. Gebruik het rechthoekgereedschap om een rechthoek rond een van de SPoT's te tekenen en klik op de knop één instellen in het vak Berichtgrenzen om de rechthoekpositie rond de SPoT in te stellen, waarbij u ervoor zorgt dat de SPoT altijd binnen de grens van de rechthoek blijft. Herhaal het proces naar de andere post en neem het op onder set twee.

Pas de instellingen voor de objectgrootte aan om te voorkomen dat het programma kleinere objecten volgt en zorg ervoor dat het aantal objecten dat in elke rechthoek wordt gevolgd, constant blijft. De interface toont de gemeten afstand tussen de gevolgde objecten in realtime. Gebruik deze grafiek om de ruis te monitoren.

Geef onder de hertz-kop van de pacingfrequentie het bereik van de gewenste frequenties aan en het gewenste interval voor de stap van min naar max. Kies in de vakken aan de rechterkant de gewenste insteltijd om de hECT zich aan te laten passen aan de nieuwe stimulatiefrequentie en specificeer vervolgens de opnametijd en de stimulatiespanning. Start het programma door op de knop Programma starten te klikken.

Nadat de gegevens van een frequentie zijn opgenomen, verhoogt u de stimulatorfrequentie met het gewenste interval voor een nieuwe opname totdat de maximale frequentie is bereikt. Representatieve afbeeldingen van hECT's worden hier weergegeven vanaf de onderkant, gemaakt zonder SPoT's en met SPoT's. De SPoT's boden een enkele gedefinieerde vorm om te volgen tijdens de gegevensverzameling.

In sommige extreme gevallen werd het volgobject zelfs verduisterd. Een betrouwbaardere vorm voor optische tracking en ruisonderdrukking maakte het mogelijk om zwakke weefsels te meten met een ontwikkelde kracht van slechts één microNewton. De SPoT's zorgden voor een dopgeometrie die het hECT-verlies voorkwam.

De gemeten hECT-functie was stabiel gedurende een langere kweektijd in de huidige stimulatie-opstelling met de verwarmde fase. Vergeleken met metingen bij fysiologische temperatuur, vertoonden hECT's een veranderde contractiedynamiek bij kamertemperatuur, met langzamere contractie- en ontspanningssnelheden. Bij hogere frequenties waren de hECT's meestal zwakker bij kamertemperatuur.

Bij lagere frequenties waren de hECT's meestal sterker bij kamertemperatuur. Bij een tempo van 36 graden Celsius hadden de hECT's een hogere spontane beatsnelheid en een uitgebreider bereik van opnamefrequenties. De temperatuurgecontroleerde omgeving zorgt voor de fysiologische relevantie van de gemeten hECT-functie.

Bovendien vergemakkelijkt het gedeelde mediabad van de multi-tissue bioreactor studies van paracriene signalering tussen hECT's van verschillende cellulaire samenstellingen. De toevoeging van SPoT's aan onze multiweefselbioreactor stelt onderzoekers in staat om ziek myocardium met abnormaal hoge of lage spanning efficiënt te bestuderen, dat anders van de uiteinden van niet-afgedekte palen zou glijden.