Onderzoek naar de toepassing van oppervlakteversterkte Raman Scattering-gebaseerde biosensing van individuele sEV's in ziektediagnose en therapieën

We gebruiken oppervlakteversterkte Ramanverstrooiing gecombineerd met machine learning om vroege kankerdiagnostiek aan te pakken en leveren ook biomedische toepassingen. Een belangrijke experimentele uitdaging is de inherente heterogeniteit in exosoommonsters, de zeer complexe, hoog-dimensionale spectroscopische data, die verder wordt versterkt door de lage signaal-ruisverhouding. Begin met pipetten van ongeveer vijf microliter van het kleine extracellulaire blaasmonster op het aangewezen plasmonische substraat.

Plaats het substraat in een desiccator zodat de druppel ongeveer 15 minuten volledig kan drogen. Vervolgens wordt het gedroogde substraat overgebracht naar een confocale Raman-microscoop. Met behulp van de instrumentsoftware WiRE versie 4.4 start je gegevensverzameling.

Stel de excitatielaser in op 785 nanometer bij vijf milliwatt en kalibreer het systeem. Om spectra van het goudsubstraat te verkrijgen, voert u een scouting-scan uit over een gebied van 300 bij 300 micrometer om losse vesikels te lokaliseren met statische modus met een stapgrootte van 10 micrometer, 0,1 seconde belichting en 50% laservermogen. Zodra de vesikels zijn gelokaliseerd, voer je een hoogresolutiemapping uit in statische modus binnen een vijf bij vijf raster met een stapgrootte van één micrometer, 0,2 seconde belichting per punt en 50% laservermogen.

Vervolgens verkrijg je spectra van het grafeensubstraat door de volgende scans uit te voeren. Screen de initiële ruwe spectra en sluit alle spectra uit die overmatige ruis of abnormale spectrale vormen vertonen. Pas een Savitsk-Golay-filter toe op elk spectrum om de fluorescentieachtergrond te verminderen en de spectrale gegevens te verzachten.

Bereken de signaal-ruisverhouding voor elk spectrum met behulp van ofwel de piek-baselinemethode of de standaarddeviatiemethode. Voor elk spectrum bereken je de signaal-ruisverhouding als de verhouding van de piekintensiteit na baseline-aftrekking bij een representatieve Raman-band tot de standaarddeviatie van de ruis. Schat ruis door een Savitsky-Golay gladde versie van het spectrum af te trekken, met een venstergrootte van 11 en een polynomiale orde van drie van het oorspronkelijke spectrum.

Rangschik alle spectra in oplopende volgorde van signaal-ruisverhouding en evalueer de persistentie van diagnostische pieken over de gerangschikte spectra om de drempel te bepalen. Stel vervolgens de drempel in op het punt waar een van deze pieken verdwijnt in basislijnruis, overeenkomend met een signaal-ruisverhouding van 28. Sluit spectra uit die onder de signaal-ruisverhouding drempel van 28 vallen, zodat alleen spectra van hoge kwaliteit behouden blijven voor downstream-analyse.

En normaliseer elk overgebleven spectrum tot ofwel de maximale piekintensiteit of het totale oppervlak onder de curve. Ken een label toe aan elke spectrale meting op basis van de oorsprong, zoals een maagkankerpatiënt of een gezonde controlegroep. Voer de gelabelde spectrale gegevens in in een ondersteunende vectorclassifier met een lineaire kernel en pas een gestratificeerde schuddesplitsing toe voor vijfvoudige kruisvalidatie om een evenwichtige representatie in elke vouw te garanderen.

Gemiddeld nu de nauwkeurigheidsmetrics over alle vouwen om de algehele modelprestaties te beoordelen. Gebruik tenslotte lineaire discriminantanalyse, of LDA, om de dimensionaliteit van de oppervlakte-versterkte Ramanverstrooiingsdataset voor visualisatie te verminderen. Gebruik het getrainde lineaire discriminantanalysemodel om directe classificatie tussen de steekproefgroepen uit te voeren.

Ramanspectra met de bijbehorende gemiddelde spectra toonden verschillende moleculaire signaturen over elk monstertype, verkregen van kleine extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit weefsel-, bloed- en speekselmonsters. Lineaire discriminantanalyse toonde duidelijke clustering van extracellulaire blaasjesgegevens op basis van hun bronweefsel, bloed of speeksel. Binaire classificatie met behulp van een ondersteunende vectormachineclassifier behaalt de hoogste nauwkeurigheid voor weefselmonsters met 90,1%, gevolgd door bloed met 70,9% en speeksel met 60,7%. LDA-gebaseerde classificatie splitst duidelijk gezonde en maagkankermonsters in weefselafgeleide extracellulaire blaasjesgegevens.

Vergelijkbare LDA-gebaseerde classificatieverdelingen voor bloed- en speekselafgeleide extracellulaire blaasjesgegevens toonden een minder optimale scheiding tussen gezonde en kankermonsters. Ramanspectra van doxorubicine-geïncubeerde blaasjes zonder grafeen toonden consistente pieken rond ongeveer 1.081, 1.206 en 1.440 inverse centimeters. Bij grafeen werden een extra D-piek op ongeveer 1.350 inverse centimeters en een G-piek op ongeveer 1.580 inverse centimeters waargenomen als interne standaarden.

De verhouding van de doxorubicinpiek bij 442 inverse centimeters tot de grafeen G-piek nam toe bij hogere medicijnconcentraties en langere incubatietijden. We hebben een enkele blaasche, biochemische vingerafdruk vastgesteld om ziektebronnen te onderscheiden die potentieel voor vroege diagnose tonen. Drie belangrijke voordelen van onze techniek.

Ten eerste is het erg gevoelig. Ten tweede, het is niet-invasief. en ten derde vereist het geen lyseren, of fysiek afbreken van de deeltjes.

In de toekomst zullen we het spectrale profiel correleren met het proteomische profiel, wat op zijn beurt zou helpen om exoominhoud te correleren met specifieke functies, zoals celcommunicatie en transport.