Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

De complexe aard van EV's maakt het moeilijk om de subpopulatie van belang te herkennen, en dit protocol kan ze detecteren met hun fenotype, grootteprofiel en nanomechanische eigenschappen. Deze combinatie van techniek is een labelvrije methode, waarmee we EV's real-time kunnen detecteren uit de conditiemedia en bloedplasma. Deze techniek maakt het mogelijk om een diepe subset van nanodeeltjes van belang te karakteriseren, om te worden gebruikt als bio-indicatoren van pathologie, of ook te worden gebruikt als nanodeeltje voor medicijnafgifte.

Omdat het een zeer gevoelige methode is, is het noodzakelijk om aandacht te besteden aan het biochippreparaat voordat u uw monster van belang injecteert. Na het coaten en functionaliseren van de chips, incubeer de biochip in een mengsel van 200-millimolar ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide / N-hydroxysuccinimide en 50 millimolar per liter N-hydroxysuccinimide gedurende ten minste 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Voeg met behulp van de spotter 300 nanoliter ligandoplossing toe en incubeer de biochip gedurende 30 minuten onder een sonische bad.

Was de biochip vanaf de bovenkant met ultrapuur water. Voeg een druppeltje olie toe met dezelfde brekingsindex als het prisma om een uniforme dunne laag tussen de biochip en het prisma te creëren en plaats deze voorzichtig op een prisma met dezelfde brekingsindex als de biochip. Voor beeldvorming van oppervlakteplasmonresonantie monteert u de biochip op het SPRi-systeem.

Navigeer naar het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant van de software en klik op de werkmap. Zoek de afbeelding waar verschillende vlekken zichtbaar zijn en klik om deze afbeelding te selecteren. Schrijf vervolgens de naam van de ligandfamilies en klik op de definities van de soort afwerken.

Sleep de zwarte lijn met de cursor naar de optimale werkhoek. Klik op Spiegel naar werkhoek verplaatsen en selecteer een werkhoek. Klik nu op Kinetics.

Als de software de gebruiker vraagt om het negatieve besturingselement te definiëren, kiest u op dit punt Geen negatieve controle. Injecteer rat serum albumine met 50 microliter per minuut gedurende vier minuten. Injecteer ethanolamine met 20 microliter per minuut gedurende 10 minuten om de carbongroepen die nog steeds aanwezig en reactief zijn op het oppervlak te deactiveren.

Was daarna de biochip door gedurende vier minuten 40 millimolaire OG bij 50 microliter per minuut te injecteren. Injecteer de extracellulaire blaasjes in een specifieke concentratie op de biofunctionele chip terwijl u tegelijkertijd de kinetiek van de interactie van blaasjes op de verschillende plekken volgt. Bepaal ook de waarde van reflectiviteit en het niveau van interactie.

Eenmaal gestabiliseerd, injecteert u glutaaraldehyde op de chip om extracellulaire blaasjes te fixeren op de plaats waar ze zich bevinden voordat u AFM-beeldvorming uitvoert. Lijn de biochip uit op de bovenkant van het masker op de glazen dia. Gebruik de CCD-camera bovenop de AFM om de cantilever te lokaliseren op de juiste plek die moet worden gescand.

Start de AFM-acquisitie in contactmodus van drie tot vijf grote tot kleine gebieden. Behandel vervolgens de AFM-afbeeldingen met JPK-gegevensverwerkingssoftware door eerst het hoogtekanaal te selecteren. Kies een polynomiale pasvorm die van elke lijn moet worden afgetrokken om rechtgetrokken scanlijnen te verkrijgen.

Selecteer de hoogtedrempel op goudkorrels om de ruwheid op het oppervlak te elimineren. De graanextractiemodule markeert de korrels met een hoogtedrempel van 8,5 nanometer. Multiplex biochips werden geanalyseerd na albumine passivering.

De chip zonder standaard. De chip met enkele defecten, als gevolg van fusie van vlekken, zwakke enting of bellen of verontreinigingen. En een naakte goudchip zonder microarrays voor het onderzoeken van de adsorptie van extracellulaire blaasjes op goud wordt getoond.

Het opname-experiment op een gemultiplexte biochip toonde goede reflectiviteitssignalen voor verschillende liganden en een goede signaal-ruisverhouding voor de verschillende liganden, omdat de respons van de negatieve controle verwaarloosbaar was. Extracellulaire vesikeladsorptie na de injectie van het extracellulaire blaasjesmonster vertoonde een hoog reflectiviteitssignaal, wat suggereert dat die blaasjes in staat waren om te adsorberen en stabiel te blijven op de goudchip. Na extracellulaire vesikelbelasting werden de grootschalige en kleinschalige AFM-beelden van extracellulaire blaasjes op biochips gegenereerd.

Een hoge resolutie nader zicht maakt de metrologie van extracellulaire blaasjes mogelijk. De effectieve diameter van de extracellulaire blaasjes op een biochip varieerde van 30 tot 300 nanometer, met een grote meerderheid rond de 60 nanometer. De resultaten verkregen in lucht en vloeistof waren vergelijkbaar.

Het Raman-spectrum van extracellulaire blaasjes geadsorbeerd op een naakte chip onthulde een duidelijk spectrum, met pieken die voornamelijk overeenkomen met methyleentrillingen, die geassocieerd zijn met de lipiden van extracellulaire blaasjesmembranen. Het is belangrijk om uw biochip grondig voor te bereiden om uw EV's nauwkeurig en reproduceerbaar te kunnen detecteren. Conventionele methoden zoals Western blotting en nanodeeltjes tracking analyse kunnen worden gebruikt om fenotypes en groottepatronen te correleren en te bevestigen.

Bovendien is het de bedoeling dat multi-omische analyses nog dieper ingaan op EV-moleculaire karakterisering en potentiële subsetdiscriminatie.