Verbetering van CRISPR-Cas9-schermen in CAR T-cellen: Een verfijnde methode voor bibliotheekvoorbereiding
January 2nd, 2026
We ontwikkelden een geoptimaliseerd CRISPR-Cas9 knockout-screeningsprotocol voor primaire CAR T-cellen. Door de gDNA-overdracht via enzymatische vertering en sgRNA-cassette pulldown te verminderen, minimaliseert deze aanpak PCR-artefacten, waardoor nauwkeurige sgRNA-detectie en robuuste identificatie van functionele gendoelen worden gegarandeerd.
Ons onderzoek richt zich op het gebruik van CRISPR-screeningsmethoden om doelwitten te identificeren en de effectiviteit van CAR T-celtherapieën te vergroten. Huidige experimentele uitdagingen omvatten het bereiken van reproduceerbare laboratoriummethoden in CRISPR-screeningsmethoden. Voeg om te beginnen een vooraf bepaalde hoeveelheid Lenta virale CRISPR-bibliotheek toe aan een 24-wellplaat met T-cellen.
Voeg poly brain toe met een uiteindelijke concentratie van acht microgram per milliliter. Meng voorzichtig om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Centrifugeer de cellen op 700 G gedurende 90 minuten bij 32 graden Celsius om spin-fection uit te voeren.
Na de centrifugatie verwijder je voorzichtig de plaat van de centrifuge. Vervang het medium door een nieuw T-cel groeimedium. Voeg na zes uur de CAR lenta virale vector toe bij een infectiemultipliciteit van drie.
Incubeer de cellen vier dagen op 37 graden Celsius. Zodra de incubatie is voltooid, verzamel je de CAR T-cellen. Was één keer met PBS.
Kleur vervolgens de cellen met acradine-oranje propidiumjodide en tel ze in een fluorescerende celteller. Bereid een vier micromolaire oplossing van cas9 voor in een elektroporatiebuffer. Zes CAR T-cellen in 50 microliter cas9-oplossing vijf keer tien keer op het vermogen opnieuw ophangen.
Pipette vervolgens 50 microliter van de celsuspensie in elke put van een meer-put cuvetstrip zonder dat er bellen ontstaan. Verwijder zichtbare belletjes door voorzichtig een pipetpunt langs de randen van de put te laten lopen. Gebruik het expand T-cel drie-programma om de CAR T-cellen te nucleoffecteren.
Plaats de cuvettes 40 minuten in een broedmachine op 37 graden Celsius. Susselt de genucleoffecteerde cellen opnieuw in het T-cel groeimedium. Daarna broeden ze opnieuw uit bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen.
Tel de cellen met behulp van acradine-sinaasappelpropidiumjodide kleuring in een fluorescerende celteller. Na het aanpassen van de celdichtheid op tien tot de kracht van zes cellen per milliliter, voeg puremycine toe aan een uiteindelijke concentratie van 2,5 microgram per milliliter. Na zes dagen incubatie wordt het percentage CAR-positieve cellen beoordeeld met behulp van flowcytometrie.
Sorteer dan CAR T-celpopulaties en bewaar droge celpellets bij min 80 graden Celsius. Extracteer genomisch DNA uit de monsters met behulp van een methode van cel- en weefsel-DNA-extractie. Meet de genomische DNA-concentratie met behulp van een dubbelstrengs DNA-kwantificatiekit.
Vervolgens verteert u tot vijf microgram genomisch DNA met 20 eenheden van de geselecteerde restrictie-enzymen in een totaal volume van 50 microliter. Broed 's nachts uit bij 37 graden Celsius in een thermocycler. De volgende dag bereid je 10 milliliter elutionbuffer voor met 10 millimolartris HCL en 50 milliliter verse 70% ethanol.
Pipetteer 100 microliter van het verteerde product in een buis met vortexkralen. Pipette om de suspensie grondig te mengen en laat het vijf minuten op kamertemperatuur incuberen voordat je het nog eens vijf minuten magnetiseert. Terwijl je op de magneet zit, gooi je het supernatant weg en pipetteer je 200 microliter van de 70% ethanoloplossing zonder de pellet te verstoren.
Na 30 seconden gooi je het supernatant weg en voer je nog twee alcoholwasbeurten uit. Laat de kralen na twee wasbeurten twee minuten drogen en haal ze daarna uit de magneet. Voeg 40 microliter elucian buffer toe en pipette om de kralen opnieuw te laten hangen.
Magnetiseer de suspensie twee minuten en doe daarna het supernatant over in een nieuwe buis. Voeg één x wash bindingsbuffer toe aan een buis met één milligram vortex streptavidine magnetische kralen. Pipette om de kralen opnieuw in de buffer te laten hangen.
Plaats vervolgens de suspensie één minuut op een magneet, gooi het supernatant weg en voer nog twee wasbeurten uit. Na de derde wasbeurt worden de kralen opnieuw gebruikt in een dubbele wasband buffer. Voeg vervolgens vijf microliter 10 micromolair biotinylated pull down primers toe aan het gezuiverde spijsverteringsproduct.
Incubeer het mengsel vijf minuten in een droog bad op 96 graden Celsius en laat het direct vijf minuten koelen op ijs. Voeg één milligram voorgewassen, streptavidine magnetische kralen toe aan de reactie, zodat zowel de reactie als de streptavidinekralen gelijke volumes hebben. Broeuw 20 minuten op kamertemperatuur en laat het elke vier minuten opnieuw suspensjoneren.
Magnetiseer de kralen vijf minuten, was dan drie keer met één x wash binding buffer. Tot slot wordt de kralen met gebonden sgRNA-cassette opnieuw opgehangen in 50 microliter elucian-buffer. Bereid de sgRNA-bibliotheek voor en versterk deze en sequencer deze.
Na antibioticaselectie lieten CAR T-cellen transduceerd met de CRISPR-bibliotheek voortbestaan en proliferatie bij beide donoren na puromycinebehandeling. Niet-transduceerde T-cellen en CAR T-cellen zonder CRISPR-bibliotheektransductie vertoonden geen vergelijkbare proliferatie onder antibioticaselectie en dienden als negatieve controles. Beperkingsenzymdigestie met NDEL en PSPXI genereerde gefragmenteerd genomisch DNA, terwijl de enkele gids-RNA-cassette werd behouden voor verrijking.
Fragmenten met sgRNA werden vervolgens selectief geamplificeerd. Pearson en Spearman correlaties toonden aan dat de single guide RNA-leestellingen en bibliotheekcomplexiteit behouden bleven in donorgenomische DNA-monsters vergeleken met de plasmidebibliotheek. Robuuste rangaggregatieanalyse identificeerde genen die significant verrijkt of uitgeput waren na Cas9-editing in beide donoren.
Padverrijkingsanalyse onthulde toptermen in genontologie die geassocieerd zijn met de geïdentificeerde genetische regulatoren. Ons protocol biedt een betrouwbaar alternatief voor bestaande laboratoriumtechnieken met behulp van CRISPR-screeningsmethoden. Onze bevindingen zullen het veld vooruithelpen door de ontwikkeling van meer reproduceerbare en robuuste CRISPR-screeningsprotocollen te ondersteunen.
Onze resultaten effenden de weg voor het identificeren van genen en kunnen worden gemodereerd om het fenotype en de functie van CAR T-cellen te verbeteren.
Overview
This article presents an optimized CRISPR-Cas9 knockout screening protocol tailored for primary human CAR T cells. The method addresses challenges in PCR amplification of sgRNA cassettes from large amounts of genomic DNA, enabling more efficient and reproducible identification of genetic regulators that influence CAR T cell function. The workflow incorporates enzymatic digestion and selective pulldown steps to enhance sgRNA recovery, supporting the discovery of targets to improve CAR T cell therapies.
Key Study Components
Area of Science
- Immunotherapy
- Genetic screening
- Cellular engineering
Background
- CAR T cell therapies are highly effective in hematological malignancies but face limitations in solid tumors and relapse rates.
- Improving CAR T cell efficacy and persistence is a major research focus.
- CRISPR-Cas9 screening enables systematic identification of genes regulating CAR T cell function.
- Standard PCR-based sgRNA recovery from genomic DNA is often inefficient, especially in challenging samples.
Purpose of Study
- To develop a robust and reproducible CRISPR screening protocol for primary human CAR T cells.
- To overcome technical barriers in sgRNA cassette amplification from genomic DNA.
- To facilitate the identification of genetic determinants that modulate CAR T cell phenotype and function.
Methods Used
- Transduction of T cells with a lentiviral CRISPR sgRNA library and CAR lentiviral vector.
- Spin-fection and nucleofection for efficient gene delivery and Cas9 introduction.
- Antibiotic selection (puromycin) to enrich for successfully edited CAR T cells.
- Genomic DNA extraction, enzymatic digestion with restriction enzymes, and selective pulldown of sgRNA cassettes using biotinylated primers and streptavidin magnetic beads.
- PCR amplification and sequencing of enriched sgRNA cassettes.
- Bioinformatic analysis including correlation of read counts, library complexity assessment, and pathway enrichment analysis.
Main Results
- The optimized protocol enabled efficient recovery and amplification of sgRNA cassettes from CAR T cell genomic DNA.
- CAR T cells transduced with the CRISPR library survived and proliferated under antibiotic selection, while controls did not.
- Restriction enzyme digestion preserved sgRNA cassettes for selective enrichment.
- Sequencing data showed maintained library complexity and high correlation with the original plasmid library.
- Robust rank aggregation and pathway analysis identified key genetic regulators affecting CAR T cell function.
Conclusions
- This protocol provides a reliable and reproducible method for CRISPR screening in primary human CAR T cells.
- The workflow overcomes previous limitations in sgRNA recovery from genomic DNA.
- Findings support the identification of genetic targets to enhance CAR T cell therapies.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
CAR T Cell Production and CRISPR-Cas9 Screening Workflow in Primary Human T Cells
2:59
Genomic DNA Digestion and sgRNA Cassette Enrichment for CRISPR Screening
4:40
Streptavidin-Based Pulldown of sgRNA Cassettes for CRISPR-Cas9 Screening
6:14
Results
7:35
Conclusion
