RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

We ontwikkelden de RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactiemethode, of de RDD-methode, om chromatinecontact te karteren dat georganiseerd is door specifieke RNA-moleculen. RDD brengt RNA-specifieke chromatinebanding en langeafstandsinteractie over endogene en exogene RNA's robuust in kaart. Om te beginnen moet de permeabiliseerde kernpellet, afgeleid van Drosophila S2 dubbele kruisverbonden cellen, opnieuw worden opgeschorst in 15 milliliter 0,1% FA lysisbuffer met Triton X-100.

Aliquot 1,5 milliliter van de nucleaire suspensie in een 14-milliliter ronde bodem reageerbuis terwijl bubbelvorming wordt vermeden. Sonicaer de ophanging met een amplitude van 38% gedurende 4,5 minuten met 30 seconden aan- en 30-seconden uit-cycli. Verzamel de sonicatiechromatine in een buisje van 15 milliliter en centrifugeer op 3.200g gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.

Breng ongeveer 13 milliliter van het supernatant over in een nieuwe buis van 15 milliliter. Voeg nu 100 microliter voorbereide streptavidine C1-kralen toe aan de buis met sonicated chromatine en draai deze 20 minuten op kamertemperatuur. Plaats vervolgens de buis één minuut op een magnetisch rek en breng de supernatant met de vooraf vrijgemaakte chromatine over in een nieuwe buis van 50 milliliter.

Bewaar 10-microliter aliquot bij min 20 graden Celsius voor analyse. Incubeer 26 milliliter vers voorbereide hybridisatiebuffer met 13 milliliter vooraf vrijgemaakte chromatine op een rotator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens verdeel je het hybridisatiemengsel in drie buisjes van 15 milliliter en voeg je zes microliter 100-micromolair biotinyleerde probes toe aan elk monster.

Na het afsluiten van de buisdoppen met folie, draai je de buizen een nacht op 37 graden Celsius. Na het blokkeren van de streptavidine C1-kralen verwijder je de blokkeringsbuffer en suspendeer je de kralen opnieuw in 400 microliter hybridisatiebuffer. Voeg nu de met blokkeringsbuffer behandelde streptavidine C1-kralen toe aan de eerder bereide gehybridiseerde chromatine.

Draai het mengsel 2,5 uur op kamertemperatuur. Na het weggooien van het supernatant en het overbrengen van de kralen naar een tube van 1,5 milliliter, was je de kralen vijf keer met 800 microliter wasbuffer en daarna twee keer met TE-buffer. Na de laatste wasbeurt gooi je het supernatant weg en suspendeer je de kralen opnieuw in 1.000 microliter TE-buffer met 1X proteaseremmer op kamertemperatuur.

Voor het blokkeren van onbezette plekken op de streptavidine C1-kralen die gebonden zijn aan het probe-chromatinecomplex, voeg je 220 microliter gedenatureerde IPB toe aan de kralen en draai je de buis op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de incubatie was je de streptavidine C1-kralen vijf keer met TE-buffer. Voeg vervolgens 693 microliter eindreparatiemengsel toe aan de chromatine op streptavidine C1-kralen en meng goed.

Voeg vervolgens zeven microliter T4 DNA-polymerase toe. Incubeer het mengsel op een thermomixer op 800 omwentelingen per minuut en 12 graden Celsius gedurende 30 minuten. Incubeer het monster vervolgens op een mixer op 16 graden Celsius gedurende 15 minuten.

Was de kralen drie keer met 800 microliter ijskoude ChIA-PET-buffer en daarna één keer met TE-buffer. Voeg vervolgens 693 microliter A-tailing mengsel toe aan de chromatine op streptavidine C1-kralen en meng goed. Voeg vervolgens zeven microliter Klenow-fragment drie prime toe aan vijf prime exonuclease min.

Incubeer de buis op een mixer op 12 omwentelingen per minuut en 37 graden Celsius gedurende 50 minuten. Was de kralen drie keer met 800 microliter ijskoude ChIA-PET buffer en daarna één keer met elutiebuffer door zacht pipetteren. Voeg nu 1.390 microliter proximity ligatiemengsel toe aan de chromatine van streptavidine C1-kralen en incubeer vijf minuten op een mixer op kamertemperatuur.

Voeg 10 microliter T4 DNA-ligase toe aan het mengsel en incubeer met rotatie van 20 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, schakel dan over naar 12 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur gedurende 50 minuten en zet de incubatie 's nachts voort bij 16 graden Celsius. Vervolgens was je de kralen drie keer met 800 microliter ijskoude ChIA-PET-buffer en daarna twee keer met TE-buffer. Voor chromatineafgifte voeg je 480 microliter LC ChIP elutionbuffer toe aan de chromatine op streptavidine C1-kralen en meng goed.

Voeg 20 microliter van 20 milligram per milliliter proteïnase K toe voor de-crosslinking. Incubeer de buis op een thermomixer met 950 omwentelingen per minuut en 65 graden Celsius gedurende de nacht, en zuiver vervolgens het nabijheidsgeligeerde DNA met een fenol:chloroform:isoamyl alcoholreagens. Voeg alle benodigde componenten voor de Tn5-tagmentatietest toe in een totaal reactievolume van 50 microliter in een PCR-buis op ijs.

Incubeer de tagmentatie-reactie op 55 graden Celsius gedurende 10 minuten in een thermocycler met het deksel ingesteld op 70 graden Celsius, en houd het daarna op vier graden Celsius. Voeg 50 microliter ChIP-elusjonsbuffer en één microliter proteïnase K toe aan het getagmenteerde DNA. Meng de oplossing en incubeer op een thermomixer bij 65 graden Celsius en 900 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten.

Zuiver het DNA met een DNA-zuiveringskit en kwantificeer het DNA met een automatisch capillair elektroforesesysteem. Voeg al het gefragmenteerde geligeerde DNA toe aan M280-kralen die vooraf zijn geblokkeerd met blokkerende buffer en genomisch DNA en meng de suspensie. Draai de buis 45 minuten op kamertemperatuur op een mixer.

Na een korte draai plaats je de buis op een magnetisch rek en gooi je het supernatant weg. Voeg na de wasstappen 30 microliter elutiebuffer toe aan de kralen zonder te mengen. Bereid de PCR-mix voor volgens de voorbereidingskit van de DNA-bibliotheek.

Zet de PCR-buizen over op een PCR-machine en zet het versterkingsprogramma op. Tot slot, na het zuiveren van het PCR-product met magnetische kralen, meet je 10 tot 30 nanogram bibliotheek-DNA met een nucleïnezuurkwantor om het monster voor te bereiden op sequencing. Sonicated chromatinefragmenten varieerden van ongeveer 1.000 tot 3.000 basenparen, wat wijst op geslaagde fragmentatie.

RNA-geassocieerde chromatine vertoonde een fragmentgrootte van ongeveer 1.000 tot 3.000 basenparen. Chromatine gelabeld met Tn5 vertoonde een fragmentverdeling die duidt op de efficiëntie van chromatine-tagmentatie. De sequencingbibliotheek vertoonde na amplificatie een fragmentgrootteverdeling van ongeveer 180 tot 1.000 basenparen.

Na grootteselectie werden de sequencing-bibliotheekfragmenten voornamelijk verrijkt in ongeveer 250 tot 600 basenparen. RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie, of RDD-methode, detecteerde de genomische locaties van NC RNA roX2- en 7SK-binding, samen met de bijbehorende interactielussen op afstand chromatine. Gegevens van RNA-polymerase II ChIA-PET tonen een duidelijke regulatierelatie tussen deze NC-RNA's en genexpressie, met pieken die de interactiesterkte aangeven.

Multidimensionale analyse werd bereikt door RDD-verankerde interacties te integreren met Hi-C genoom-brede chromatineconformationkaarten en epigenomische markeringen, beginnende transcriptie en RNA-polymerase II ChIA-PET-gegevens. In deze gebieden werden topologisch associerende domeinen duidelijk zichtbaar, waarbij RNA-geleide chromatinelussen vaak aan hun grenzen of meerdere domeinen beslaan. Daarnaast werden de RNA-centrische regulerende hubs bepaald.

RDD-methode en verankerde chromatine-interacties onthullen RNA-bindingsplaatsen en bijbehorende DNA-DNA-interacties in de organisatie van het 3D-genoom. Belangrijke lessen zijn het handhaven van de juiste probe-, linker- en chromatineverhoudingen en het blokkeren van onbegrensde streptavidineplaatsen met het natuurlijke biotine vóór polymerase-ligatie. Toekomstige studies kunnen onderzoeken hoe RNA chromatine-interacties dynamisch over ontwikkeling, verstoringen en infecties heen brengt.