Fluorescencja to zjawisko, które zachodzi, gdy substancja pochłania światło o określonej długości fali i emituje światło o innej długości fali. Fluorescencja występuje w momencie, gdy elektron, który został wzbudzony do wyższego i bardziej niestabilnego stanu energetycznego, powraca do stanu podstawowego, emitując foton światła. Światło odpowiedzialne za wzbudzenie, czyli przejście elektronu do wyższego stanu energetycznego, ma krótszą długość fali i wyższą energię niż emisja fluorescencyjna, która charakteryzuje się dłuższą długością fali, niższą energią i innym kolorem.
Mikroskopia fluorescencyjna łączy właściwości powiększające mikroskopu optycznego z technologią fluorescencyjną, która umożliwia wzbudzanie oraz detekcję emisji fluoroforów – fluorescencyjnych związków chemicznych. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej naukowcy mogą obserwować rozmieszczenie konkretnych typów komórek w tkankach lub cząsteczek wewnątrz komórek.
Główne elementy mikroskopu fluorescencyjnego w dużej mierze pokrywają się z elementami tradycyjnego mikroskopu świetlnego. Dwie główne różnice to jednak rodzaj źródła światła oraz zastosowanie specjalistycznych elementów filtrujących.
Mikroskopia fluorescencyjna wymaga bardzo mocnego źródła światła, takiego jak ksenonowa lub rtęciowa lampa łukowa, podobna do tej pokazanej tutaj. Światło emitowane przez rtęciową lampę łukową jest od 10 do 100 razy jaśniejsze niż w przypadku większości lamp żarowych i zapewnia światło w szerokim zakresie długości fal, od ultrafioletu po podczerwień. To wysokiej mocy źródło światła jest najniebezpieczniejszą częścią zestawu mikroskopu fluorescencyjnego, ponieważ bezpośrednie patrzenie w nieprzefiltrowane światło może poważnie uszkodzić siatkówkę oka, a niewłaściwe obchodzenie się z żarówkami może doprowadzić do ich wybuchu.
Zasada działania mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta. Światło emitowane przez lampę łukową przechodzi przez filtr wzbudzenia, który wybiera odpowiednią długość fali wzbudzenia.
Światło to jest odbijane w stronę próbki przez specjalne lustro, zwane lustrem dichroicznym, które jest zaprojektowane tak, aby odbijać światło wyłącznie o długości fali wzbudzenia. Odbite światło przechodzi przez obiektyw, gdzie zostaje skupione na fluorescencyjnym preparacie. Emisje z preparatu przechodzą następnie z powrotem przez obiektyw – gdzie następuje powiększenie obrazu – a następnie przez lustro dichroiczne.
Światło to jest filtrowane przez filtr barierowy, który wybiera długość fali emisji i odfiltrowuje światło zanieczyszczające pochodzące z lampy łukowej lub innych źródeł, które odbiło się od elementów mikroskopu. Ostatecznie przefiltrowana emisja fluorescencyjna trafia do detektora, gdzie obraz może zostać zdigitalizowany, lub jest przekazywana do okularu w celu obserwacji optycznej.
Filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr barierowy mogą być zmontowane razem w komponent znany jako kostka filtracyjna. Podczas obserwacji preparatu można wymieniać kostki filtracyjne, aby zmienić długość fali wzbudzenia, a seria przysłon może służyć do modyfikacji natężenia wzbudzenia.
W przypadku przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej fluorofor może być równie istotny jak sam mikroskop, a rodzaj obrazowanego fluoroforu determinuje stosowaną długość fali wzbudzenia oraz wykrywaną długość fali emisji. Fale wzbudzenia obejmują niewielki zakres energii, która może zostać pochłonięta przez fluorofor, powodując jego przejście w stan wzbudzony. Po wzbudzeniu możliwe jest szerokie spektrum emisji, czyli przejść z powrotem do stanu o niższej energii, co skutkuje powstaniem widma emisyjnego.
Różnica między szczytem krzywej absorpcji (wzbudzenia) a szczytem krzywej emisji jest znana jako przesunięcie Stokesa. Im większa odległość w tym przesunięciu, tym łatwiejsze jest rozdzielenie dwóch różnych długości fal. Dodatkowo, wszelkie nakładające się widma muszą zostać usunięte przez elementy kostki filtracyjnej, aby zredukować tło i poprawić jakość obrazu.
Długotrwała ekspozycja fluoroforu na wzbudzenie powoduje jego fotoblaknięcie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji. Aby zmniejszyć fotoblaknięcie, do preparatu na szkiełku można dodać medium montażowe zapobiegające blaknięciu (anti-fade) i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci. Szkiełko powinno być również przechowywane w ciemności, gdy nie jest obrazowane.
Aby rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne, włącz źródło światła ksenonowego lub rtęciowego i pozwól mu rozgrzewać się przez maksymalnie 15 minut, aby osiągnęło stałą intensywność oświetlenia.
Następnie umieść próbkę na stoliku i przymocuj ją. Następnie włącz źródło białego światła w mikroskopie. Ustaw ostrość próbki, korzystając z obiektywu o najmniejszym powiększeniu, regulując pokrętła grubego i precyzyjnego ustawiania ostrości. Następnie użyj pokręteł regulacji stolika, aby zlokalizować obszar zainteresowania.
Następnie wyłącz źródło białego światła oraz wszelkie zbędne oświetlenie pomieszczenia, aby zredukować tło.
Wybierz odpowiednią kostkę filtracyjną dla barwnika, który obrazujesz, i otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę.
Na koniec dokonaj precyzyjnej regulacji ostrości i skieruj światło wyjściowe do kamery obrazującej. Prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie czasu ekspozycji dla każdego innego fluoroforu lub użytego barwnika fluorescencyjnego. Należy jednak pamiętać, aby zachować stały czas ekspozycji podczas porównywania cech z tym samym barwnikiem w różnych próbkach.
Aby obrazować wiele barwników w tej samej próbce, zmień kostkę filtracyjną tak, aby odpowiadała każdemu fluoroforowi, i zarejestruj nowy obraz.
Po wykonaniu obrazowania każdego barwnika w próbce, poszczególne obrazy można nałożyć na siebie i połączyć.
Wiele różnych rodzajów eksperymentów może wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną i angażować różne typy fluoroforów. Jednym z najczęstszych zastosowań mikroskopii fluorescencyjnej jest obrazowanie białek znakowanych przeciwciałami, które są przyłączone lub „skoniugowane” z związkami fluorescencyjnymi. W tym przypadku przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir wykryto za pomocą przeciwciała wtórnego skoniugowanego z alexafluor-488, który po wzbudzeniu fluorescuje na zielono.
Innym sposobem na wyróżnienie konkretnej cechy za pomocą fluorescencji jest zintegrowanie kodu białka fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), z DNA organizmu. Gen GFP został pierwotnie wyizolowany z meduzy i może być eksprymowany, czyli produkowany, przez hodowlane komórki w odpowiedzi na konkretne wyzwalacze lub jako część określonego typu komórek, takich jak świecące komórki nowotworowe widoczne na tym obrazie.
Kolejnym zastosowaniem obrazowania fluorescencyjnego jest mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (Fluorescence Speckle Microscopy), która jest technologią wykorzystującą fluorescencyjnie znakowane kompleksy makromolekularne, takie jak widoczna tutaj sieć F-aktyny, do badania ruchu i kinetyki wymiany tego ważnego białka cytoszkieletowego.
Zaawansowana technika znana jako odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) polega na celowym fotowybielaniu niewielkiego obszaru próbki w celu monitorowania szybkości dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek z powrotem do obszaru wybielonego.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do mikroskopii fluorescencyjnej.
W tym filmie dowiedzieliśmy się, czym jest zjawisko fluorescencji, czym mikroskopia fluorescencyjna różni się od mikroskopii świetlnej oraz jak wykonać obraz fluorescencyjny przy użyciu mikroskopu. Poznaliśmy również niektóre podstawowe i zaawansowane zastosowania wykorzystujące fluorescencję. Dziękujemy za uwagę i przypominamy, że choć fotowybielanie wygląda świetnie na zębach, nie jest ono korzystne dla Państwa próbek.
Mikroskopia fluorescencyjna jest niezwykle potężnym narzędziem analitycznym, które łączy właściwości powiększające mikroskopii świetlnej z wizualizacj…
Fluorescencja to zjawisko, które zachodzi, gdy substancja pochłania światło o określonej długości fali i emituje światło o innej długości fali. Fluorescencja występuje w momencie, gdy elektron, który został wzbudzony do wyższego i bardziej niestabilnego stanu energetycznego, powraca do stanu podstawowego, emitując foton światła. Światło odpowiedzialne za wzbudzenie, czyli przejście elektronu do wyższego stanu energetycznego, ma krótszą długość fali i wyższą energię niż emisja fluorescencyjna, która charakteryzuje się dłuższą długością fali, niższą energią i innym kolorem.
Mikroskopia fluorescencyjna łączy właściwości powiększające mikroskopu optycznego z technologią fluorescencyjną, która umożliwia wzbudzanie oraz detekcję emisji fluoroforów – fluorescencyjnych związków chemicznych. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej naukowcy mogą obserwować rozmieszczenie konkretnych typów komórek w tkankach lub cząsteczek wewnątrz komórek.
Główne elementy mikroskopu fluorescencyjnego w dużej mierze pokrywają się z elementami tradycyjnego mikroskopu świetlnego. Dwie główne różnice to jednak rodzaj źródła światła oraz zastosowanie specjalistycznych elementów filtrujących.
Mikroskopia fluorescencyjna wymaga bardzo mocnego źródła światła, takiego jak ksenonowa lub rtęciowa lampa łukowa, podobna do tej pokazanej tutaj. Światło emitowane przez rtęciową lampę łukową jest od 10 do 100 razy jaśniejsze niż w przypadku większości lamp żarowych i zapewnia światło w szerokim zakresie długości fal, od ultrafioletu po podczerwień. To wysokiej mocy źródło światła jest najniebezpieczniejszą częścią zestawu mikroskopu fluorescencyjnego, ponieważ bezpośrednie patrzenie w nieprzefiltrowane światło może poważnie uszkodzić siatkówkę oka, a niewłaściwe obchodzenie się z żarówkami może doprowadzić do ich wybuchu.
Zasada działania mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta. Światło emitowane przez lampę łukową przechodzi przez filtr wzbudzenia, który wybiera odpowiednią długość fali wzbudzenia.
Światło to jest odbijane w stronę próbki przez specjalne lustro, zwane lustrem dichroicznym, które jest zaprojektowane tak, aby odbijać światło wyłącznie o długości fali wzbudzenia. Odbite światło przechodzi przez obiektyw, gdzie zostaje skupione na fluorescencyjnym preparacie. Emisje z preparatu przechodzą następnie z powrotem przez obiektyw – gdzie następuje powiększenie obrazu – a następnie przez lustro dichroiczne.
Światło to jest filtrowane przez filtr barierowy, który wybiera długość fali emisji i odfiltrowuje światło zanieczyszczające pochodzące z lampy łukowej lub innych źródeł, które odbiło się od elementów mikroskopu. Ostatecznie przefiltrowana emisja fluorescencyjna trafia do detektora, gdzie obraz może zostać zdigitalizowany, lub jest przekazywana do okularu w celu obserwacji optycznej.
Filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr barierowy mogą być zmontowane razem w komponent znany jako kostka filtracyjna. Podczas obserwacji preparatu można wymieniać kostki filtracyjne, aby zmienić długość fali wzbudzenia, a seria przysłon może służyć do modyfikacji natężenia wzbudzenia.
W przypadku przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej fluorofor może być równie istotny jak sam mikroskop, a rodzaj obrazowanego fluoroforu determinuje stosowaną długość fali wzbudzenia oraz wykrywaną długość fali emisji. Fale wzbudzenia obejmują niewielki zakres energii, która może zostać pochłonięta przez fluorofor, powodując jego przejście w stan wzbudzony. Po wzbudzeniu możliwe jest szerokie spektrum emisji, czyli przejść z powrotem do stanu o niższej energii, co skutkuje powstaniem widma emisyjnego.
Różnica między szczytem krzywej absorpcji (wzbudzenia) a szczytem krzywej emisji jest znana jako przesunięcie Stokesa. Im większa odległość w tym przesunięciu, tym łatwiejsze jest rozdzielenie dwóch różnych długości fal. Dodatkowo, wszelkie nakładające się widma muszą zostać usunięte przez elementy kostki filtracyjnej, aby zredukować tło i poprawić jakość obrazu.
Długotrwała ekspozycja fluoroforu na wzbudzenie powoduje jego fotoblaknięcie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji. Aby zmniejszyć fotoblaknięcie, do preparatu na szkiełku można dodać medium montażowe zapobiegające blaknięciu (anti-fade) i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci. Szkiełko powinno być również przechowywane w ciemności, gdy nie jest obrazowane.
Aby rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne, włącz źródło światła ksenonowego lub rtęciowego i pozwól mu rozgrzewać się przez maksymalnie 15 minut, aby osiągnęło stałą intensywność oświetlenia.
Następnie umieść próbkę na stoliku i przymocuj ją. Następnie włącz źródło białego światła w mikroskopie. Ustaw ostrość próbki, korzystając z obiektywu o najmniejszym powiększeniu, regulując pokrętła grubego i precyzyjnego ustawiania ostrości. Następnie użyj pokręteł regulacji stolika, aby zlokalizować obszar zainteresowania.
Następnie wyłącz źródło białego światła oraz wszelkie zbędne oświetlenie pomieszczenia, aby zredukować tło.
Wybierz odpowiednią kostkę filtracyjną dla barwnika, który obrazujesz, i otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę.
Na koniec dokonaj precyzyjnej regulacji ostrości i skieruj światło wyjściowe do kamery obrazującej. Prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie czasu ekspozycji dla każdego innego fluoroforu lub użytego barwnika fluorescencyjnego. Należy jednak pamiętać, aby zachować stały czas ekspozycji podczas porównywania cech z tym samym barwnikiem w różnych próbkach.
Aby obrazować wiele barwników w tej samej próbce, zmień kostkę filtracyjną tak, aby odpowiadała każdemu fluoroforowi, i zarejestruj nowy obraz.
Po wykonaniu obrazowania każdego barwnika w próbce, poszczególne obrazy można nałożyć na siebie i połączyć.
Wiele różnych rodzajów eksperymentów może wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną i angażować różne typy fluoroforów. Jednym z najczęstszych zastosowań mikroskopii fluorescencyjnej jest obrazowanie białek znakowanych przeciwciałami, które są przyłączone lub „skoniugowane” z związkami fluorescencyjnymi. W tym przypadku przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir wykryto za pomocą przeciwciała wtórnego skoniugowanego z alexafluor-488, który po wzbudzeniu fluorescuje na zielono.
Innym sposobem na wyróżnienie konkretnej cechy za pomocą fluorescencji jest zintegrowanie kodu białka fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), z DNA organizmu. Gen GFP został pierwotnie wyizolowany z meduzy i może być eksprymowany, czyli produkowany, przez hodowlane komórki w odpowiedzi na konkretne wyzwalacze lub jako część określonego typu komórek, takich jak świecące komórki nowotworowe widoczne na tym obrazie.
Kolejnym zastosowaniem obrazowania fluorescencyjnego jest mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (Fluorescence Speckle Microscopy), która jest technologią wykorzystującą fluorescencyjnie znakowane kompleksy makromolekularne, takie jak widoczna tutaj sieć F-aktyny, do badania ruchu i kinetyki wymiany tego ważnego białka cytoszkieletowego.
Zaawansowana technika znana jako odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) polega na celowym fotowybielaniu niewielkiego obszaru próbki w celu monitorowania szybkości dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek z powrotem do obszaru wybielonego.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do mikroskopii fluorescencyjnej.
W tym filmie dowiedzieliśmy się, czym jest zjawisko fluorescencji, czym mikroskopia fluorescencyjna różni się od mikroskopii świetlnej oraz jak wykonać obraz fluorescencyjny przy użyciu mikroskopu. Poznaliśmy również niektóre podstawowe i zaawansowane zastosowania wykorzystujące fluorescencję. Dziękujemy za uwagę i przypominamy, że choć fotowybielanie wygląda świetnie na zębach, nie jest ono korzystne dla Państwa próbek.
Fluorescencja to zjawisko, które zachodzi, gdy substancja pochłania światło o określonej długości fali i emituje światło o innej długości fali. Fluorescencja występuje w momencie, gdy elektron, który został wzbudzony do wyższego i bardziej niestabilnego stanu energetycznego, powraca do stanu podstawowego, emitując foton światła. Światło odpowiedzialne za wzbudzenie, czyli przejście elektronu do wyższego stanu energetycznego, ma krótszą długość fali i wyższą energię niż emisja fluorescencyjna, która charakteryzuje się dłuższą długością fali, niższą energią i innym kolorem.
Mikroskopia fluorescencyjna łączy właściwości powiększające mikroskopu optycznego z technologią fluorescencyjną, która umożliwia wzbudzanie oraz detekcję emisji fluoroforów – fluorescencyjnych związków chemicznych. Dzięki mikroskopii fluorescencyjnej naukowcy mogą obserwować rozmieszczenie konkretnych typów komórek w tkankach lub cząsteczek wewnątrz komórek.
Główne elementy mikroskopu fluorescencyjnego w dużej mierze pokrywają się z elementami tradycyjnego mikroskopu świetlnego. Dwie główne różnice to jednak rodzaj źródła światła oraz zastosowanie specjalistycznych elementów filtrujących.
Mikroskopia fluorescencyjna wymaga bardzo mocnego źródła światła, takiego jak ksenonowa lub rtęciowa lampa łukowa, podobna do tej pokazanej tutaj. Światło emitowane przez rtęciową lampę łukową jest od 10 do 100 razy jaśniejsze niż w przypadku większości lamp żarowych i zapewnia światło w szerokim zakresie długości fal, od ultrafioletu po podczerwień. To wysokiej mocy źródło światła jest najniebezpieczniejszą częścią zestawu mikroskopu fluorescencyjnego, ponieważ bezpośrednie patrzenie w nieprzefiltrowane światło może poważnie uszkodzić siatkówkę oka, a niewłaściwe obchodzenie się z żarówkami może doprowadzić do ich wybuchu.
Zasada działania mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta. Światło emitowane przez lampę łukową przechodzi przez filtr wzbudzenia, który wybiera odpowiednią długość fali wzbudzenia.
Światło to jest odbijane w stronę próbki przez specjalne lustro, zwane lustrem dichroicznym, które jest zaprojektowane tak, aby odbijać światło wyłącznie o długości fali wzbudzenia. Odbite światło przechodzi przez obiektyw, gdzie zostaje skupione na fluorescencyjnym preparacie. Emisje z preparatu przechodzą następnie z powrotem przez obiektyw – gdzie następuje powiększenie obrazu – a następnie przez lustro dichroiczne.
Światło to jest filtrowane przez filtr barierowy, który wybiera długość fali emisji i odfiltrowuje światło zanieczyszczające pochodzące z lampy łukowej lub innych źródeł, które odbiło się od elementów mikroskopu. Ostatecznie przefiltrowana emisja fluorescencyjna trafia do detektora, gdzie obraz może zostać zdigitalizowany, lub jest przekazywana do okularu w celu obserwacji optycznej.
Filtr wzbudzenia, lustro dichroiczne i filtr barierowy mogą być zmontowane razem w komponent znany jako kostka filtracyjna. Podczas obserwacji preparatu można wymieniać kostki filtracyjne, aby zmienić długość fali wzbudzenia, a seria przysłon może służyć do modyfikacji natężenia wzbudzenia.
W przypadku przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej fluorofor może być równie istotny jak sam mikroskop, a rodzaj obrazowanego fluoroforu determinuje stosowaną długość fali wzbudzenia oraz wykrywaną długość fali emisji. Fale wzbudzenia obejmują niewielki zakres energii, która może zostać pochłonięta przez fluorofor, powodując jego przejście w stan wzbudzony. Po wzbudzeniu możliwe jest szerokie spektrum emisji, czyli przejść z powrotem do stanu o niższej energii, co skutkuje powstaniem widma emisyjnego.
Różnica między szczytem krzywej absorpcji (wzbudzenia) a szczytem krzywej emisji jest znana jako przesunięcie Stokesa. Im większa odległość w tym przesunięciu, tym łatwiejsze jest rozdzielenie dwóch różnych długości fal. Dodatkowo, wszelkie nakładające się widma muszą zostać usunięte przez elementy kostki filtracyjnej, aby zredukować tło i poprawić jakość obrazu.
Długotrwała ekspozycja fluoroforu na wzbudzenie powoduje jego fotoblaknięcie, czyli osłabienie lub utratę fluorescencji. Aby zmniejszyć fotoblaknięcie, do preparatu na szkiełku można dodać medium montażowe zapobiegające blaknięciu (anti-fade) i uszczelnić krawędzie lakierem do paznokci. Szkiełko powinno być również przechowywane w ciemności, gdy nie jest obrazowane.
Aby rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne, włącz źródło światła ksenonowego lub rtęciowego i pozwól mu rozgrzewać się przez maksymalnie 15 minut, aby osiągnęło stałą intensywność oświetlenia.
Następnie umieść próbkę na stoliku i przymocuj ją. Następnie włącz źródło białego światła w mikroskopie. Ustaw ostrość próbki, korzystając z obiektywu o najmniejszym powiększeniu, regulując pokrętła grubego i precyzyjnego ustawiania ostrości. Następnie użyj pokręteł regulacji stolika, aby zlokalizować obszar zainteresowania.
Następnie wyłącz źródło białego światła oraz wszelkie zbędne oświetlenie pomieszczenia, aby zredukować tło.
Wybierz odpowiednią kostkę filtracyjną dla barwnika, który obrazujesz, i otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę.
Na koniec dokonaj precyzyjnej regulacji ostrości i skieruj światło wyjściowe do kamery obrazującej. Prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie czasu ekspozycji dla każdego innego fluoroforu lub użytego barwnika fluorescencyjnego. Należy jednak pamiętać, aby zachować stały czas ekspozycji podczas porównywania cech z tym samym barwnikiem w różnych próbkach.
Aby obrazować wiele barwników w tej samej próbce, zmień kostkę filtracyjną tak, aby odpowiadała każdemu fluoroforowi, i zarejestruj nowy obraz.
Po wykonaniu obrazowania każdego barwnika w próbce, poszczególne obrazy można nałożyć na siebie i połączyć.
Wiele różnych rodzajów eksperymentów może wykorzystywać mikroskopię fluorescencyjną i angażować różne typy fluoroforów. Jednym z najczęstszych zastosowań mikroskopii fluorescencyjnej jest obrazowanie białek znakowanych przeciwciałami, które są przyłączone lub „skoniugowane” z związkami fluorescencyjnymi. W tym przypadku przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir przeciwciało przeciwko białkom powierzchniowym leptospir wykryto za pomocą przeciwciała wtórnego skoniugowanego z alexafluor-488, który po wzbudzeniu fluorescuje na zielono.
Innym sposobem na wyróżnienie konkretnej cechy za pomocą fluorescencji jest zintegrowanie kodu białka fluorescencyjnego, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), z DNA organizmu. Gen GFP został pierwotnie wyizolowany z meduzy i może być eksprymowany, czyli produkowany, przez hodowlane komórki w odpowiedzi na konkretne wyzwalacze lub jako część określonego typu komórek, takich jak świecące komórki nowotworowe widoczne na tym obrazie.
Kolejnym zastosowaniem obrazowania fluorescencyjnego jest mikroskopia plamkowa fluorescencyjna (Fluorescence Speckle Microscopy), która jest technologią wykorzystującą fluorescencyjnie znakowane kompleksy makromolekularne, takie jak widoczna tutaj sieć F-aktyny, do badania ruchu i kinetyki wymiany tego ważnego białka cytoszkieletowego.
Zaawansowana technika znana jako odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) polega na celowym fotowybielaniu niewielkiego obszaru próbki w celu monitorowania szybkości dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek z powrotem do obszaru wybielonego.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do mikroskopii fluorescencyjnej.
W tym filmie dowiedzieliśmy się, czym jest zjawisko fluorescencji, czym mikroskopia fluorescencyjna różni się od mikroskopii świetlnej oraz jak wykonać obraz fluorescencyjny przy użyciu mikroskopu. Poznaliśmy również niektóre podstawowe i zaawansowane zastosowania wykorzystujące fluorescencję. Dziękujemy za uwagę i przypominamy, że choć fotowybielanie wygląda świetnie na zębach, nie jest ono korzystne dla Państwa próbek.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Chapters in this video
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved