Tandemowa spektrometria mas

Tandemowa spektrometria mas łączy ze sobą wiele etapów spektrometrii mas, aby najpierw wyizolować biomolekułę, a następnie określić aspekty jej składu chemicznego. Biomolekuły mają duże, złożone struktury, co utrudnia określenie ich składu molekularnego. Tandemowa spektrometria mas wybiera cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, która jest następnie fragmentowana na wiele podjednostek, co może pomóc w wyjaśnieniu jej identyfikacji i sekwencji. Ten film pokaże koncepcje tandemowej spektrometrii mas, ogólną procedurę i niektóre z jej zastosowań w biochemii.

Tandemowa spektrometria mas zaczyna się jako typowy instrument do pomiaru masy: ze źródłem jonów, które przekształca próbkę w jony, oraz analizatorem masy, który rozdziela jony na podstawie ich stosunku masy do ładunku. Powszechny analizator masy, kwadrupol, przepuszcza tylko jony o określonym stosunku, podczas gdy inne rozbijają się o pręty aparatu. Gatunek, który przepuszcza się, zwany jonem prekursorowym, jest biomolekułą będącą przedmiotem zainteresowania. Jon przemieszcza się do komórki zderzeniowej, zwykle innego kwadrupola, gdzie energia jest przykładana do fragmentacji jonu w przewidywalny wzór.

Fragmenty te przemieszczają się do innego analizatora masy, takiego jak time-of-flight, który oddziela te "jony produktowe". Jony produktu są następnie przesyłane do detektora, tak jak w normalnym przyrządzie MS. W przypadku nieznanego białka otrzymane widmo zawiera wiele nakładających się na siebie fragmentów, co utrudnia wygenerowanie ostatecznej pełnej sekwencji biomolekuły. Jednak wzorzec spektralny jest unikalny dla danego białka. Oprogramowanie analityczne porównuje widmo z bazą danych znanych sekwencji peptydowych, wyjaśniając nieznane białko z nakładających się fragmentów.

W zależności od próbki i pożądanego stopnia rozdrobnienia możliwych jest wiele metod fragmentacji. Wzorce fragmentacji zależą od tego, w jaki sposób energia jest przenoszona, jej ilość i jak jest rozprowadzana przez jon prekursorowy. Energia może być przenoszona przez neutralne cząstki, promieniowanie lub elektrony. Wykorzystując neutralne atomy, proces zwany dysocjacją wywołaną zderzeniem lub CID, przede wszystkim rozszczepia wiązanie peptydowe między aminokwasami, idealne do ich identyfikacji.

Teraz, gdy podstawy tej techniki zostały omówione, przyjrzyjmy się tandemowej spektrometrii mas CID używanej do badania składnika otoczek komórek bakteryjnych.

Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów ze spektrometrią mas, pierwszym krokiem jest jonizacja próbki. W przypadku biomolekuł odbywa się to zwykle za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą lub jonizacji elektronrozpylacyjnej. Sygnał jonów prekursorowych jest następnie optymalizowany poprzez dostrojenie optyki jonowej. Po zakończeniu cel jest izolowany i wybierana jest metoda fragmentacji, taka jak CID.

Siła przyłożonego napięcia, które przyspiesza jon prekursorowy do ogniwa zderzeniowego, wpływa na stopień rozdrobnienia. Napięcie to jest zwiększane do momentu, gdy prekursor osiągnie około 10% obfitości w porównaniu z najwyższym jonem produktowym. Rejestruje się wiele widm i uśrednia je do momentu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu. Liczba potrzebnych skanów zależy od intensywności sygnału oryginalnego jonu prekursorowego i może wynosić od 3 do 300.

Analit w tym przykładzie, lipid A z Escherichia coli K-12, miał 19 głównych fragmentów po CID. Ogólna struktura lipidu A jest dobrze znana, co pozwala oprogramowaniu zrekonstruować specyficzny skład na podstawie próbki.

Teraz, gdy przyjrzeliśmy się procedurze, przyjrzyjmy się niektórym sposobom wykorzystania tandemowej spektrometrii mas w biochemii.

Powszechnym trybem skanowania w tandemowej spektrometrii mas jest monitorowanie wybranych reakcji lub SRM. W SRM oba analizatory masy są ustawione na wybrany stosunek masy do ładunku, koncentrując się na określonych jonach prekursorowych i produktowych. Ze względu na wysoki stopień czułości SRM, widma wzorców peptydów o znanym stężeniu mogą być wykorzystywane i porównywane z widmami nieznanych próbek, co pozwala na ilościowe określenie interesujących białek.

Białka są zwykle modyfikowane po translacji, zwykle przez dodanie grup funkcyjnych, takich jak grupy metylowe, grupy fosforanowe lub cukry, znane jako glikany. Są one ważne w procesach sygnalizacji komórkowej, wyjaśniając, w jaki sposób komórki komunikują się ze sobą. Ponieważ tandemowa spektrometria mas dzieli białka na mniejsze składniki, możliwe jest określenie położenia PTM w stosunku do konkretnego fragmentu, a nawet aminokwasu. Niektóre modyfikacje, takie jak acetylacja i trimetylacja, są trudne do rozróżnienia na podstawie samej masy, dlatego separację chromatograficzną przeprowadza się przed spektrometrią mas.

Wiele analitów we krwi pacjenta znajduje się w stężeniach poniżej granicy wykrywalności dla typowej spektrometrii mas. Kolejną zaletą SRM jest to, że odrzuca wszystkie jony produktu z wyjątkiem jednego, zwiększając czułość i zwiększając dolną granicę wykrywalności nawet 100-krotnie. W tym przykładzie lek immunosupresyjny, takrolimus, można wykryć na poziomie 1 ng/ml.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat tandemowej spektrometrii mas. Ten film opisał teorię instrumentu, omówił ogólną procedurę i wyjaśnił niektóre sposoby, w jakie technika ta jest obecnie wykorzystywana. Dzięki za oglądanie!