Model miażdżycy indukowanej zaburzeniem przepływu w tętnicy szyjnej myszy poprzez częściowe podwiązanie oraz prosta metoda izolacji RNA z endotelium tętnicy szyjnej

Podsumowanie

Opisano tutaj zabieg częściowego podwiązania tętnicy szyjnej, który wywołuje zaburzenia przepływu krwi i późniejszy rozwój miażdżycy (w ciągu dwóch tygodni) z neowaskularyzacją wewnątrzblaszczkową (w ciągu czterech tygodni) w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Opisano również nową metodę izolacji RNA z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej, zapewniającą wysoką czystość RNA śródbłonkowego.

Streszczenie

Pomimo dobrze znanego bliskiego związku, brakowało bezpośrednich dowodów łączących zaburzony przepływ z aterogenezą. Niedawno zastosowaliśmy zmodyfikowaną wersję metod częściowego podwiązania tętnicy szyjnej [1,2], aby wykazać, że indukuje ona w sposób ostry warunki przepływu niskiego i oscylacyjnego — dwie kluczowe cechy przepływu zaburzonego — w wspólnej tętnicy szyjnej myszy. Wykorzystując ten model, dostarczyliśmy bezpośrednich dowodów na to, że zaburzony przepływ rzeczywiście prowadzi do szybkiego i silnego rozwoju miażdżycy u myszy z nokautem apolipoproteiny E [3]. Opracowaliśmy również metodę przygotowania RNA z endotelium o wysokiej czystości z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej myszy [3]. Stosując ten model mysi oraz tę metodę, stwierdziliśmy, że częściowe podwiązanie powoduje dysfunkcję śródbłonka w ciągu tygodnia, po czym w ciągu dwóch tygodni następuje silne i szybkie formowanie się miażdżycy w hiperlipidemicznym modelu mysim, wraz z cechami tworzenia złożonych zmian, takimi jak neowaskularyzacja wewnątrzblaszczkowa do czwartego tygodnia. Ten szybkiin vivomodel i metoda przygotowania RNA z komórek śródbłonka mogą zostać wykorzystane do określenia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zależnej od przepływu regulacji biologii naczyń i chorób. Mogą one również służyć do testowania różnych interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcję śródbłonka i miażdżycę w znacznie krótszym czasie trwania badania.

Protokół

1. Częściowe podwiązanie lewej tętnicy szyjnej

1. Do doświadczeń wykorzystuje się myszy w wieku około 8 tygodni. Zaleca się, aby waga myszy wynosiła co najmniej 18 g.
2. Sterylizuj narzędzia przez 30 s w sterylizatorze koralikowym i pozostaw do ostygnięcia.
3. Wprowadź zwierzę w stan znieczulenia za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (i.p.) Ketaminy (80 mg/kg) i Ksylazyny (10 mg/kg) lub alternatywnego środka znieczulającego zatwierdzonego przez IACUC. W przypadku wstrzyknięcia i.p., wykonaj zastrzyk w lewy dolny kwadrant brzucha myszy.
4. Umieść mysz w komorze grzewczej do momentu pełnego znieczulenia. Zweryfikuj głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję na uciśnięcie palca u nogi.
5. Umieść mysz na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej (brzuchem do góry). Przymocuj łapami przednimi dłońmi do góry oraz łapami tylnymi podeszwami do dołu do stołu za pomocą taśmy.
6. Nanieś obfitą ilość preparatu do depilacji (np. Nair) na szyję między żuchwą a mostkiem. Delikatnie masuj, aż do całkowitego usunięcia włosów.
7. Zmyj preparat do depilacji i nanieś obfitą ilość Betadyny na zdepilowany obszar.
8. Przygotuj fragmenty nici jedwabnej 6-0 o długości 1 cala do ligacji. Dla każdej myszy będą potrzebne dwa kawałki nici.
9. Za pomocą ostrych, małych nożyczek wykonaj nacięcie pionowe o długości 4-6 mm na środku szyi. Należy przeciąć zarówno skórę, jak i leżącą pod nią powięź.
10. Przesuń lewy gruczoł ślinowy przyuszny z linii środkowej w lewo i rozpocznij rozdzielanie tępe narzędziem tuż po prawej stronie tchawicy. Powinieneś być w stanie łatwo zidentyfikować pulsującą lewą tętnicę szyjną wspólną.
11. Podążaj za tętnicą szyjną wspólną w kierunku ogonowym, aż zlokalizujesz miejsce jej rozwidlenia.
12. Wykonaj rozdzielanie tępe w miejscu rozwidlenia, aby odsłonić cztery następujące odgałęzienia dystalne lewej tętnicy szyjnej wspólnej: tętnicę szyjną zewnętrzną, tętnicę szyjną wewnętrzną, tętnicę potyliczną i tętnicę tarczową górną. Naczynia te, szczególnie tętnica tarczowa górna, mogą być kruche. Zachowaj dużą ostrożność podczas rozdzielania.
13. Podwiąż tętnicę szyjną zewnętrzną POWYŻEJ tętnicy tarczowej górnej, używając nici jedwabnej 6-0. Aby to zrobić, wprowadź jedną pęsetę pod tętnicę i chwyć kawałek wcześniej przeciętej nici za pomocą drugiej pęsety. Delikatnie pociągnij nić, aby przeszła pod tętnicą. Zawiąż ciasły węzeł, unikając uwięzienia w nim otaczających tkanek. Jeśli zawiążesz nić poniżej odejścia tętnicy tarczowej górnej, pod koniec procedury de facto wykonasz całkowitą ligację, co stanowi istotnie inny model.
14. Podwiąż tętnicę szyjną wewnętrzną oraz tętnicę potyliczną jednym węzłem, stosując tę samą technikę.
15. Zweryfikuj położenie szwów oraz drożność tętnicy tarczowej górnej.
16. Zbliż brzegi skóry i zamknij ranę, używając niewielkiej ilości Tissue-Mend.
17. Umieść myszy w komorze grzewczej do czasu wybudzenia. Wybudzenie trwa zazwyczaj od 30 do 60 minut.
18. Pojedynczą dawkę Buprenorfiny (0,1 mg/kg) należy podać natychmiast po operacji, jeżeli zastosowane znieczulenie nie zapewnia przedłużonego uśmierzenia bólu (np. izofluran wziewny) lub jeśli zwierzę wykazuje oznaki stresu w ciągu pierwszych 24 godzin. W naszym doświadczeniu dawka Ketaminy podana w celu znieczulenia zapewnia wystarczającą analgezję, gdy operację wykonuje doświadczony chirurg i dalsza analgezja nie jest potrzebna.

2. Badanie USG tętnic szyjnych

1. Aby zweryfikować, czy częściowe podwiązanie spowodowało zaburzenia przepływu, należy zbadać przepływ w tętnicy szyjnej jeden dzień po zabiegu podwiązania
2. Wprowadzić zwierzę w stan znieczulenia za pomocą izofluranu – w razie potrzeby można użyć komory do indukcji znieczulenia
3. Umieścić znieczulone myszy na stole do obrazowania, brzuchy skierowane ku górze
4. Przymocować łapy przednie i tylne taśmą do czujnika EKG na stole do obrazowania
5. Usunąć owłosienie z szyi, obficie nakładając preparat Nair (ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy nie został wykonany przed procedurą podwiązania)
6. Wprowadzić termometr rektalny w celu pomiaru temperatury
7. Nałożyć żel do badań USG na szyję
8. Rozpocząć badanie w trybie B-mode.
9. Płaszczyzna obrazowania powinna być ustawiona pod kątem 90 stopni (pokrętło na głowicy powinno być skierowane w stronę nosa myszy)
10. Obniżyć głowicę na szyję myszy, aż zostanie uzyskany obraz.
11. Przesuwać stół w lewo i w prawo, aż do zidentyfikowania tchawicy (struktura w linii środkowej)
12. Zidentyfikować lewą wspólną tętnicę szyjną
13. Przechylić stół do obrazowania tak, aby powstał kąt między płaszczyzną obrazowania a tętnicą szyjną. Im większy będzie ten kąt, tym silniejszy będzie sygnał Dopplera.
14. Umieścić próbkę Dopplera falowego w środkowej części lewej wspólnej tętnicy szyjnej.
15. W razie potrzeby zastosować korekcję kąta.
16. Powtórzyć pomiary na prawej wspólnej tętnicy szyjnej.
17. Prawidłowe częściowe podwiązanie tętnicy szyjnej spowoduje ogólny spadek przepływu (~80-90%) w lewej wspólnej tętnicy szyjnej w porównaniu z prawą stroną, wraz z odwróceniem kierunku przepływu w stronę wlotu aorty podczas rozkurczu.
18. Po uzyskaniu satysfakcjonujących obrazów wyłączyć znieczulenie, usunąć żel z ciał myszy i zdjąć taśmy mocujące. Umieścić myszy w ogrzewanej komorze wybudzeń.

3. Izolacja RNA z wewnętrznej błony naczyń tętnic szyjnych

1. Uśmierć myszy poprzez inhalację CO₂ zgodnie z instytucjonalnym protokołem IACUC
2. Przymocuj łapy taśmą do ręcznika papierowego.
3. Nacinij skórę myszy od brzucha do górnej części klatki piersiowej.
4. Otwórz ścianę brzucha poniżej klatki piersiowej za pomocą ostrych nożyczek.
5. Podnieś mostek pęsetą i przetnij przeponę, a następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
6. Przetnij żyłę główną nożyczkami.
7. Przeprowadź perfuzję ciśnieniową (120 mmHg) przez 2 do 3 min roztworem soli fizjologicznej zawierającym 10 Units/mL heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade.
8. Nacinij skórę szyi i usuń cały tłuszcz, mięśnie oraz tkanki łączone, aż odsłonięte zostaną tętnice szyjne.
9. Umieść mysz pod mikroskopem sekcyjnym.
10. Wykonaj nakłucie bezpośrednio poniżej miejsc podwiązania w lewej tętnicy szyjnej w celu przeprowadzenia drugiej perfuzji.
11. Ponownie przeprowadź perfuzję ciśnieniową przez ~ 1 min roztworem soli fizjologicznej zawierającym 10 Units/mL heparyny przez lewą komorę, upewniając się, że lewa tętnica szyjna jest dobrze przepłukana.
12. Używając pęsety z cienką końcówką i małych nożyczek sprężynowych, ostrożnie usuń tkanki okołozewnętrzne otaczające tętnice szyjne. Należy uważać, aby nie ściskać ani nie rozciągać tętnic szyjnych podczas tego etapu oczyszczania.
13. Odetnij lewą tętnicę szyjną między łukiem aorty a punktami podwiązania powyżej rozwidlenia tętnicy szyjnej.
14. Odetnij prawą tętnicę szyjną między punktem odgałęzienia prawej tętnicy podobojczykowej a rozwidleniem tętnicy szyjnej.
15. Przenieś tętnice szyjne do 35 mm szalki hodowlanej zawierającej lodowaty HBSS. W razie potrzeby ostrożnie usuń pozostałą tkankę okołozewnętrzną.
16. Przygotuj strzykawkę insulinową (strzykawka 3/10 ml) z igłą 29g, napełniając ją 150 μl buforu lizującego QIAsol (Qiagen) na każdą tętnicę szyjną.
17. Ostrożnie wprowadź końcówkę igły do jednego z końców tętnicy szyjnej.
18. Trzymając tętnicę szyjną i końcówkę igły pęsetą, szybko (~ 1 sec) wypłucz bufor lizujący QIAsol (150 μl) do probówki 1,5 ml (eluat błony wewnętrznej).
19. Przepłucz raz w HBSS pozostałość tętnicy szyjnej (błona środkowa+zewnętrzna), umieść ją w probówce 1,5 ml i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie.
20. Eluat błony wewnętrznej oraz zamrożone pozostałości są następnie wykorzystywane do izolacji RNA z błony wewnętrznej lub błony środkowej+zewnętrznej przy użyciu zestawu miRNeasy mini kit (QIAGEN) zgodnie z instrukcjami producenta.

4. Reprezentatywne wyniki:

Wykonaliśmy częściową ligaturę lewej tętnicy szyjnej u myszy, a badanie ultrasonograficzne przeprowadzono dzień po zabiegu. Jak pokazano na Rysunku 1, pomyślna częściowa ligatura zmniejsza prędkość przepływu krwi i powoduje odwrócenie kierunku przepływu (przepływ zaburzony) w lewej wspólnej tętnicy szyjnej podczas rozkurczu. Częściowa ligatura u myszy z nokautem genu ApoE (KO), którym podawano dietę wysokotłuszczową, indukuje silną miażdżycę w lewej wspólnej tętnicy szyjnej (LCA), ale nie w przeciwległej tętnicy szyjnej prawej, w ciągu dwóch tygodni (Rysunek 2). RNA wyizolowane z błony wewnętrznej tętnicy szyjnej zawiera geny markerów śródbłonka, takie jak PECAM-1, przy jednoczesnym braku genów markerów komórek mięśni gładkich błony środkowej, takich jak a-SMA (Rysunek 3).

Rysunek 1: Schemat anatomii i podwiązań tętnic szyjnych: Podwiązano trzy odgałęzienia lewej tętnicy szyjnej wspólnej (LCA) [tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) oraz tętnicę potyliczną (OA)], pozostawiając otwartą tętnicę tarczycy górną (STA).

Rycina 2: Obrazy ultradźwiękowe przedstawiają profile prędkości przepływu i wykazują, że częściowa ligacja indukuje odwrócenie przepływu (wskazane strzałkami) w LCA podczas rozkurczu. Przepływ w RCA pozostaje niezmieniony po ligacji.

Rycina 3: Częściowe podwiązanie i dieta wysokotłuszczowa szybko indukują miażdżycę w LCA u myszy ApoE KO. Myszy ApoE KO poddano częściowemu podwiązaniu i karmiono dietą wysokotłuszczową przez okres od 1 do 3 tygodni. Zamrożone przekroje LCA barwiono Oil-Red-O.

Rycina 4. Metoda preparacji RNA z błony wewnętrznej. RNA z błony wewnętrznej oraz RNA z warstwy środkowej i zewnętrznej (m+a) uzyskano z prawej tętnicy wieńcowej (RCA) i lewej tętnicy wieńcowej (LCA) u myszy C57BL/6 po zabiegu pozorowanym. RNA analizowano za pomocą półilościowego RT-PCR (A) oraz qPCR (B, C) pod kątem PECAM-1 i α-SMA, stosując 18s jako kontrolę wewnętrzną. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią ± SEM, n=3.

Dyskusja

W tej procedurze niezbędna jest prawidłowa identyfikacja wszystkich odgałęzień tętnicy szyjnej wspólnej, w tym tętnicy szyjnej zewnętrznej, tętnicy szyjnej wewnętrznej, tętnicy potylicznej i tętnicy tarczyowej górnej. Ważne jest również zweryfikowanie wzorca przepływu za pomocą ultrasonografii, zgodnie z prezentacją. Dzięki naszemu doświadczeniu, skuteczność zabiegów częściowego podwiązania w oparciu o badania ultrasonograficzne przeprowadzone na ponad 500 myszach przekracza 90%. W przypadku przygotowania RNA z błony wew...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól fizjologiczna (0,9% NaCl)	Baxter Internationl Inc.	2B1323
Strzykawka insulinowa (strzykawka 3/10 ml 29g)	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
Zestaw miRNeasy mini kit (w tym QIAzol)	Qiagen	217004
System wysokorozdzielczego obrazowania mikro Vevo 770	VisualSonics, inc.	a.System Visualsonics 770 b.Stół do obrazowania c.Zintegrowany system szynowy Vevo d.Głowica skanująca RMV dla myszy	lub system podobny
Sznur jedwabny 6-0, sterylny	Covidien	s-1172 c2
Małe nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	lub podobne
Pinceta anatomiczna	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	lub podobna
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946