Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Streszczenie

Choć wiele wiadomo już o podstawowym metabolizmie komórek bakteryjnych, wiele fundamentalnych pytań wciąż pozostaje zaskakująco bez odpowiedzi, w tym na przykład to, w jaki sposób generują i utrzymują one specyficzne kształty komórek, ustanawiają polarność, segregują swoje genomy i dzielą się. Aby zrozumieć te zjawiska, potrzebne są technologie obrazowania, które wypełnią lukę w rozdzielczości między fluorescencyjną mikroskopią świetlną a metodami o wyższej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia NMR.

Kriotomografia elektronowa (ECT) to rozwijająca się technologia, która pozwala na wizualizację ultrastruktury komórek w stanie zbliżonym do natywnego, w trzech wymiarach (3D), z rozdzielczością „makromolekularną” (~4nm).^{1, 2} W ECT komórki są obrazowane w szklistym stanie „zamrożonego nawodnienia” w kriomikroskopie elektronowym transmisyjnym (cryoTEM) w niskiej temperaturze (< -180°C). W przypadku komórek smukłych (o grubości do ~500 nm³), nienaruszone komórki są mrożone metodą plunge-freezing w mediach na siatkach EM w kriogenach, takich jak etan lub mieszaniny etanu i propanu. Grubsze komórki oraz biofilmy mogą być również obrazowane w stanie szklistym poprzez uprzednie „mrożenie wysokociśnieniowe” (high-pressure freezing), a następnie „kriosekcjonowanie”. Następnie gromadzi się serię dwuwymiarowych obrazów projekcyjnych próbki, która jest stopniowo pochylana wzdłuż jednej lub dwóch osi. Z tych obrazów można następnie obliczyć rekonstrukcję trójwymiarową, czyli „tomogram”. Chociaż ECT wymaga drogiej aparatury, w ostatnich latach była ona wykorzystywana w kilku laboratoriach do ujawniania struktur różnych wyrostków zewnętrznych, struktur różnych otoczek komórkowych, pozycji i struktur filamentów cytoszkieletu oraz lokalizacji i architektury dużych kompleksów makromolekularnych, takich jak silniki flagellarne, przedziały wewnętrzne i macierze chemoreceptorów.^{1, 2}

W tym artykule wideo przedstawiamy sposób obrazowania komórek za pomocą ECT, w tym procesy przygotowania próbek, zbierania danych, rekonstrukcji tomogramów oraz interpretacji wyników poprzez segmentację, a w niektórych przypadkach korelację z mikroskopią świetlną.

Protokół

I. Przygotowanie hodowli komórek bakteryjnych

1. Hodować komórki bakteryjne w ich standardowych pożywkach do pożądanej fazy w kilku ml kultury ciekłej. Jeśli wymagane jest wyższe stężenie, można zastosować wirowanie i ponowne zawieszenie w świeżej pożywce, należy jednak pamiętać, że proces ten czasami wprowadza zmiany strukturalne w komórkach.
2. Sprawdzić w mikroskopie świetlnym, czy kultura jest wolna od zanieczyszczeń i czy osiągnęła odpowiednią konfluencję.
3. Niektóre komórki bakteryjne mogą przywierać lub nawet rosnąć na siatkach EM. Podczas hodowania komórek na siatkach najczęściej stosuje się siatki złote z powłoką węglową, aby uniknąć toksyczności dla komórek. Powinny one zostać poddane wyładowaniu glow przez 2 minuty, wystawione na działanie światła UV przez 15 minut w celu sterylizacji, a następnie umieszczone bezpośrednio w kulturze ciekłej. Komórki adherentne naturalnie przylgną do siatki; w przypadku pozostałych można wspomóc adhezję do siatki, pokrywając ją wcześniej 0,1% poly-L-lysine. Przed zamrożeniem należy sprawdzić siatki w mikroskopie świetlnym, aby upewnić się, że stężenie komórek jest odpowiednie.

II. Mrożenie cienkich komórek metodą plunge freezing

W przypadku cienkich komórek bakteryjnych zawiesinę nienaruszonych komórek mrozi się metodą szokową (plunge freezing) na siatce do EM. Proces ten pozwala zachować ultrastrukturę komórek bakteryjnych i zapobiega odparowywaniu wody w późniejszym etapie w wysokiej próżni EM. Można to przeprowadzić za pomocą specjalnie skonstruowanych urządzeń do mrożenia szokowego lub, jak pokazano tutaj, przy użyciu komercyjnego automatycznego mroźnika szokowego FEI Vitrobot MKIII.⁴

1. Poddaj siatkę EM powleczoną węglem działaniu wyładowań żarowych przez 2-4 minuty. Dzięki temu powierzchnia siatki stanie się hydrofilowa, co pomoże w równomiernym rozprowadzeniu próbki na całej siatce.
2. Wymieszaj 100μl koloidalnego roztworu złota (średnica cząsteczek 10 nm) z 25μl 5% roztworem BSA. BSA powleka cząsteczki złota, co zapobiega ich agregacji.
3. Odwiruj mieszaninę BSA i cząsteczek złota przy 18000g przez 15 minut. Po usunięciu supernatantu pozostały osad złota wymieszaj z 20 μl zawiesiny komórek. Cząsteczki złota traktowane BSA nie reagują z komórkami, ale będą potrzebne jako znaczniki fiducyjne do rekonstrukcji tomogramów.
4. Nanieś 4 μl mieszaniny zawiesiny komórek i złota na poddaną wyładowaniom żarowym siatkę EM w urządzeniu Vitrobot przy 100% wilgotności. Następnie siatka jest automatycznie osuszana z obu stron za pomocą papieru filtracyjnego nr 1. Usuwa to nadmiar cieczy, tak aby pozostała jedynie cienka warstwa komórek w ich medium. Następnie siatkę szybko zanurz w mieszaninie ciekłego etanu i propanu schłodzonej ciekłym azotem do temperatury około 77K. Podczas tego procesu próbka zostaje zamrożona tak szybko, że zapobiega to tworzeniu się kryształków lodu w cienkich warstwach < 1 μm.
5. Ostrożnie wyjmij siatkę z mieszaniny etanu/propanu i szybko przenieś ją do pojemnika do przechowywania siatek utrzymywanego w ciekłym azocie.

III. Mrożenie pod wysokim ciśnieniem i kriosekcjonowanie grubszych komórek

W przypadku grubszych komórek mrożenie wysokociśnieniowe ogranicza krystalizację lodu, a następujące po nim mikrotomia kriogeniczna pozwala na uzyskanie próbek wystarczająco cienkich do obrazowania EM.^{5, 6, 7} Dostępnych jest wiele różnych uchwytów na próbki do mrożenia wysokociśnieniowego; wybór zależy od próbki, rodzaju zastosowanej maszyny do mrożenia lub wybranej aplikacji badawczej. W niniejszej procedurze wykorzystano mroźnik wysokociśnieniowy Bal-Tec HPM 010 oraz krioultramikrotom model UC6/FC6 firmy Leica Microsystems.

1. W przypadku bakterii, pobiera się bezpośrednio z inkubatora 37°C 15ml hodowli z mieszadła o OD >0,5 i wiruje przy 1000rpm przez 3 minuty. Po usunięciu supernatantu miesza się 0,5ml pozostałego osadu hodowlanego z 0,5ml 20% krioprotektanta dekstranowego, a następnie wiruje przy 13000rpm przez 15 sekund.
2. Po usunięciu supernatantu pipetuje się 0,1ml pasty z super-osadu do termozgrzewanego końcówki mikropipety, która zawiera już 0,2ml 20% krioprotektanta dekstranowego (40000Mwt). Mieszaninę w końcówce mikropipety wiruje się przy 13000rpm przez 30 sekund i usuwa supernatantu. W zgrzanej końcówce widoczny jest zwarty osad o objętości 5-10 μl.
3. Pasta zostaje umieszczona w jednej połowie kopułki mosiężnej płytki z powłoką teflonową, zamontowanej w ramieniu uchwytu mroźnika wysokociśnieniowego, a następnie zamknięta dopasowaną płaską mosiężną nakryvką.
4. Zespół ramienia jest następnie bezzwłocznie wkładany do przygotowanego mroźnika wysokociśnieniowego w celu zamrożenia.
5. Przy ciśnieniu 2100 bar połączona mosiężna jednostka płytki zawierająca komórki jest szybko chłodzona strumieniem ciekłego azotu pod wysokim ciśnieniem; natychmiastowe wyjęcie zespołu ramienia i zanurzenie go w kąpieli ciekłego azotu zapobiega ogrzaniu płytki.
6. Jednostki płytek są przechowywane w ciekłym azocie do momentu rozpoczęcia kriosekcjonowania.
7. Aby odsłonić dobrze zamrożoną kopułkę komórek do sekcjonowania, dwie mosiężne płytki są ostrożnie rozdzielane w ciekłym azocie.
8. Idealnie zamrożona kopułka komórek ma wygląd szklisty, jest wolna od pęknięć i szczelin nukleacji lodu.
9. Płytka ta jest przenoszona do wstępnie schłodzonej komory o temperaturze -170°C i stabilnie montowana w uchwycie przypominającym imadło w kriomikrotomie.
10. Schłodzony kriomikrotom zawiera niezbędne narzędzia do sekcjonowania, w tym: niskokątowy kryzowy nóż diamentowy, diamentowe narzędzie do przycinania, platformę dociskową, kasetkę do przechowywania siatek, urządzenie do rozpylania sprayu antystatycznego oraz aparat do trzymania siatek.
11. Aby uzyskać pomyślne sekcjonowanie wstążkowe, zewnętrzny obszar kopułki jest początkowo kształtowany do wymiaru <0,2mm kwadratu za pomocą diamentowego narzędzia do przycinania przy dużej prędkości sekcjonowania, zachowując jednocześnie głębokość ~200μm dobrze zamrożonego obwodu.
12. Kierując spray antystatyczny na niskokątowy nóż i umieszczając w bliskiej odległości miedziane siatki wspierające, ostrożnie przysuwamy nóż diamentowy do wypolerowanej powierzchni bloku przygotowanej do sekcjonowania.
13. Wybiera się parametry mikrotomu, takie jak grubość przekroju od 50 do 350 nm, prędkość cięcia ~0,4mm/sec oraz wąskie okno cięcia. Ważna jest kontrola zasięgu i intensywności sprayu antystatycznego w celu zapewnienia niskiej wilgotności w bezpośrednim otoczeniu.
14. W momencie powstania pierwszych przekrojów, za pomocą rąk lub mikromanipulatora operuje się cienkim aplikatorem, aby uchwycić pierwsze sekcje zsuwające się z krawędzi niskokątowego noża diamentowego.
15. Podczas gdy wstążka przekrojów jest spychana z noża, jest ona delikatnie podtrzymywana sondą i prowadzona w stronę znajdującej się obok miedzianej siatki wspierającej.
16. Aby przytwierdzić przekroje, siatkę z załadowanymi wstążkami mocno dociska się za pomocą schłodzonej polerowanej srebrnej sondy; niektóre przekroje są tak silnie naładowane, że nowoczesne urządzenia antystatyczne mogą wspomóc proces adhezji.
17. Kasetki z siatkami są przechowywane długoterminowo w chłodzonym ciekłym azotem suchym transporterze aż do momentu przygotowania mikroskopu do transferu siatek.

IV. Badanie komórek przy użyciu kriomikroskopu świetlnego

Komórki bakteryjne na siatce można obrazować przy użyciu kriomikroskopu świetlnego (cryoLM). Mikroskop wykorzystany w tej procedurze to zmodyfikowany odwrócony mikroskop Nikon Ti E/B z obiektywem powietrznym 60x o ekstra długiej odległości roboczej (ELWD). Podczas obrazowania siatki znajdują się w kriostatyce, która stanowi zmodyfikowany stolik FEI do kriomikroskopii świetlnej. Dzięki zastosowaniu siatki pomocniczej (finder grid) możliwe jest zlokalizowanie komórek w polach siatki oraz skorelowanie obrazów z cryoLM z tomogramami cryoEM.

1. Załaduj siatki do kaset w stacji kriogenicznej. Kasety zostały zmodyfikowane z naszych standardowych kaset EM dla FEI TF30H-polara. Siatka jest przytrzymywana przez miedziane pierścienie zaciskowe. Następnie kasetę umieszcza się w probówce w ciekłym azocie w celu transportu.
2. Schłodź stolik kriogeniczny do temperatury ciekłego azotu (-190°C).
3. Załaduj kasetę do stolika kriogenicznego i przesuń siatkę do okna obserwacyjnego. Stolik może pomieścić do dwóch zmodyfikowanych kaset.
4. Obniż soczewkę kondensora i ustaw ostrość obiektywu 60x na siatce.
5. Znajdź komórki i wykonaj zdjęcia. W przypadku skorelowanych badań LM i EM, obszar wokół komórek na siatce jest skanowany, aby umożliwić późniejszą lokalizację komórek w EM.
6. Po wykonaniu obrazowania siatki włóż kasetę z powrotem do probówki i przechowuj ją w ciekłym azocie do czasu obrazowania w EM.

V. Pozyskiwanie serii pochyleń w cryo-TEM

Aby uzyskać tomogram 3D komórki bakteryjnej, wykonuje się serię obrazów projekcyjnych, podczas gdy próbka jest stopniowo przechylana wzdłuż jednej lub dwóch osi w krio-TEM. Biorąc pod uwagę kąty nachylenia i inne ustawienia eksperymentalne, dostępnych jest kilka różnych programów do automatycznego gromadzenia serii przechyłów. W przypadku naszego krio-TEM, którym jest FEI TF30H-polara, stosujemy oprogramowanie Leginon. Pozwala ono na automatyczne wykonywanie serii przechyłów dla wcześniej wybranych komórek.⁸

1. Włóż kasety do wielomiejscowego uchwytu (MSH) w schłodzonej stacji kriogenicznej. Uchwyt MSH może pomieścić do 6 kaset.
2. Podłącz MSH do TF30H-polara, wybierz jedną kasetę i włóż ją do kolumny EM.
3. Uruchom Leginon-client na komputerze EM oraz główny program Leginon na drugiej stacji roboczej.
4. Skonfiguruj ustawienia wstępne (warunki obrazowania) dla sesji Leginon. Kluczowymi parametrami są powiększenie, wartość podogniskowania (under focus), dawka elektronów oraz kąty nachylenia dla serii przechyłów, w tym kąt początkowy, kąt końcowy oraz przyrosty.
5. Wybierz cele na obrazach, zaczynając od najmniejszego powiększenia, a następnie przekaż je do następnego kroku z większym powiększeniem.
6. Ustaw w kolejce wszystkie cele do zbierania serii przechyłów i prześlij je do końcowego etapu „tomografii”.
7. Proces zbierania danych można monitorować za pomocą narzędzia internetowego ze stacji roboczej.
8. Po zakończeniu eksperymentalnego zbierania danych pobierz kompletne serie przechyłów na lokalną stację roboczą w celu rekonstrukcji.

VI. Rozważania dotyczące bezpieczeństwa biologicznego

Większość próbek biologicznych, z którymi pracujemy, jest niepatogenna i została wyizolowana z gleby, wody z kranu lub jelit owadów. Do obsługi tych próbek wystarczająca jest podstawowa technika aseptyki. Praca z patogenami wymaga wdrożenia dodatkowych środków bezpieczeństwa; w przypadku skrajnych zagrożeń niektóre laboratoria zainstalowały całe mikroskopy cryo-EM w laboratoriach BSL-3. Poniżej przedstawiono niektóre z metod, dzięki którym zminimalizowaliśmy ryzyko związane z pracą z patogenami w naszym laboratorium.

1. Patogenność próbki można zredukować chemicznie lub genetycznie. Wiele laboratoriów wykonujących kriomikroskopię elektronową (cryo-EM) wirusów unieczynnia je za pomocą utrwalaczy chemicznych przed mrożeniem gwałtownym. Alternatywnie można wprowadzić kluczowe mutacje sprawiające, że próbki stają się niezakaźne, na przykład poprzez wprowadzanie mutacji punktowych inaktywujących określone enzymy lub wyciszanie receptorów.
2. Należy stosować środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki, fartuch laboratoryjny i gogle.
3. Próbki niebezpieczne można przetwarzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC). Kultury bakteryjne mogą być hodowane, zagęszczane, a nawet mrożone gwałtownie na siatkach EM wewnątrz BSC. W tym celu dysponujemy mniejszym, ręcznym urządzeniem do mrożenia gwałtownego, które mieści się w naszej BSC. Jeśli wymagana jest większa powtarzalność oferowana przez automatyczne mrożarki gwałtowne, można je albo wprowadzić do BSC, albo, w prostszy sposób, w niektórych przypadkach wyłożyć podkładki do osuszania w naszym urządzeniu Vitrobot folią aluminiową, aby zapobiec kontaminacji urządzenia. Podczas pracy z BSC jak najwięcej narzędzi i materiałów wprowadzanych do komory lub z niej wyjmowanych powinno być dezynfekowanych 70% etanolem. Przy przygotowywaniu siatek stosujemy małe objętości kultury bakteryjnej lub wirusowej (zwykle 4 µL), z czego większość jest usuwana przez papier Whatmana. Papier do osuszania, końcówki pipet i pozostała kultura są utylizowane jako odpady biologicznie niebezpieczne. Wszystkie narzędzia i odsłonięte powierzchnie są dezynfekowane rozcieńczonym wybielaczem, 95% etanolem, a następnie wodą.
4. Po zamrożeniu siatki są przechowywane w temperaturach ciekłego azotu przez cały okres przechowywania i gromadzenia danych. Wykazano jednak, że komórki mogą przeżyć zamrażanie, a następnie rozmrażanie, dlatego przez cały czas przechowywania i zbierania danych traktujemy je jako materiał niebezpieczny. Po zakończeniu zbierania danych wkłady zawierające zamrożone siatki są wyjmowane z kriomikroskopu elektronowego (cryo-TEM) i wrzucane bezpośrednio do 70% alkoholu. Należy odnotować, że choć zdarza się to rzadko, siatki mogą czasem „wypaść” wewnątrz kolumny; konsekwencje takiego zdarzenia powinny być rozważone dla każdej niebezpiecznej próbki. Większość mikroskopu znajduje się w temperaturze pokojowej, więc próbka na wypadłej siatce prawdopodobnie rozmroziłaby się wewnątrz kolumny i całkowicie wyschła w ultrawysiej próżni EM. Oczywiście unieczyniłoby to niektóre próbki biologiczne, ale być może nie wytrzymałe wirusy, a wysuszone pozostałości próbki mogłyby potencjalnie zostać uwolnione w postaci aerozoli podczas kolejnego otwierania kolumny mikroskopu w celu serwisowania.

VII. Rekonstrukcja tomogramu

Tomogramy komórek bakteryjnych są rekonstruowane za pomocą oprogramowania. Do tego celu dostępnych jest kilka programów. Wykorzystujemy Raptor do automatycznej rekonstrukcji i przesiewania tomogramów.⁹ Ponieważ automatyczne dopasowanie serii przechyłów i późniejsza rekonstrukcja są zadaniami nietrywialnymi, Raptor nie osiąga obecnie 100% skuteczności. W przypadku niepowodzenia programu Raptor lub potrzeby uzyskania rekonstrukcji wysokiej jakości, stosujemy ręczne dopasowanie obrazów i rekonstrukcję za pomocą eTomo w pakiecie oprogramowania do tomografii IMOD.^{10, 11}

1. Pobierz każdą pojedynczą serię nachyleń z lokalnego serwera WWW Leginon. Zapisz je w katalogu, w którym można je łatwo zlokalizować.
2. Ręcznie obejrzyj serie nachyleń za pomocą przeglądarki 3dmod z pakietu IMOD i odrzuć te, w których system Leginon nie śledził celu lub nie stworzył użytecznej serii nachyleń.
3. Uruchamiamy program Raptor w trybie rozproszonym na maszynach z systemem Linux w laboratorium za pomocą Peach (system oparty na języku Perl służący do rozdzielania zadań w sieci). W wierszu poleceń określamy rozmiar markerów fiducjalnych, tj. koloidalnych cząsteczek złota, liczbę markerów wykorzystywanych do rekonstrukcji, rozmiar piksela, pożądaną grubość rekonstrukcji, współczynnik binningu oraz szereg podstawowych ustawień (takich jak ścieżki wejściowe i wyjściowe oraz format wyjściowy), a następnie pozostawiamy go do uruchomienia; proces ten trwa zazwyczaj od 20 min do 2 h dla zbioru danych składającego się ze 122 obrazów (2k na 2k). Jeśli wynik rekonstrukcji jest satysfakcjonujący, poniższe kroki w tej sekcji można pominąć.
4. W przypadku konieczności przeprowadzenia rekonstrukcji ręcznej, zmień rozszerzenia plików z „.mrc” na „.st” i wczytaj poszczególne serie nachyleń do interfejsu GUI eTomo w pakiecie tomograficznym IMOD.
5. Określ typ osi serii nachyleń (pojedyncza lub podwójna oś) i wprowadź rozmiar markerów fiducjalnych użytych podczas przygotowania próbki. Przeskanuj nagłówek pliku, aby określić rozmiar piksela, a następnie kliknij „Create Com scripts”.
6. Postępuj zgodnie z instrukcjami na każdej karcie w GUI eTomo, aby zrekonstruować tomogram z serii nachyleń. Przejrzyj i zweryfikuj wynik po każdym kroku; w razie braku satysfakcji można zawsze wrócić do dowolnego poprzedniego kroku i powtórzyć proces od tego miejsca. Karta „Pre-processing” służy do wykonania wstępnego przetwarzania i usunięcia pikseli o nienaturalnie wysokiej intensywności spowodowanej promieniowaniem rentgenowskim. „Coarse alignment” generuje serię nachyleń, w której każdy kolejny obraz projekcyjny jest dopasowany do poprzedniego za pomocą korelacji wzajemnej. W sekcji „Fiducial Model Generation” definiujemy, które złote kuleczki mają służyć jako markery fiducjalne, a następnie program śledzi te markery w każdym obrazie projekcyjnym i buduje „Fine Alignment”. „Tomogram Positioning” umożliwia przycinanie tomogramu w osi Z. „Final Aligned Stack” jest generowany za pomocą interpolacji liniowej, a opcjonalnie można zastosować takie funkcje jak korekcja CTF, Gold-Eraser i filtrowanie 2D. Tomogram jest obliczany w sekcji „Generate Tomogram” za pomocą ważonej projekcji wstecznej w przestrzeni Fouriera. „Post-processing” umożliwia przycięcie tomogramu do obszaru zainteresowania w płaszczyźnie XY oraz skalowanie kontrastu w zakresie struktur zainteresowania, a „Clean Up” usuwa pliki pośrednie i zwalnia miejsce na dysku.

VIII. Przechowywanie tomogramów w bazie danych

Do organizacji, przechowywania, wyszukiwania i udostępniania danych tomograficznych wykorzystujemy wewnętrzną bazę danych opartą na przeglądarce internetowej. Dla każdej serii nachyleń możemy zarejestrować szczegółowe informacje o próbce, parametry akwizycji z mikroskopu, surowe serie nachyleń, a także powiązane rekonstrukcje 3D i inne pliki przetworzone. Główna strona przeglądania prezentuje miniaturę oraz charakterystyczny film w stylu „YouTube” dla każdego tomogramu, a wpisy mogą być organizowane według częstotliwości pobierania, autora, rodzaju preparatu lub daty. Użytkownicy mogą przeszukiwać bazę danych, wprowadzając słowa kluczowe lub specyficzne cechy. Obecnie w bazie zdeponowano ponad 4500 tomograficznych serii nachyleń, obejmujących niemal 60 gatunków/rodzajów preparatów, z łączną liczbą ponad 11 000 powiązanych plików.

IX. Analiza i segmentacja tomogramów

1. Szczegóły strukturalne tomogramów można przeglądać i analizować za pomocą różnego oprogramowania z narzędziami do przetwarzania obrazów, np. przeglądarki 3dmod z pakietu IMOD z oknami ZAP, XYZ oraz Slicer.
2. Kolejnym krokiem jest stworzenie segmentacji obrazu 3D (tomogramu). Segmentacja przypisuje każdemu wokselowi (pikselowi wolumetrycznemu) obrazu 3D etykietę opisującą, do którego obszaru lub materiału należy dany woksel, np. do błony lub cytoszkieletu. Wykorzystujemy w tym celu narzędzia programistyczne takie jak 3dmod w IMOD oraz Amira (Visage Imaging).
3. Chociaż niektóre narzędzia programistyczne oferują moduły automatycznej segmentacji (np. segmentację progową), często działają one jedynie w przypadku obrazów o wysokim kontraście. Obrazy 3D uzyskane w niskodawkowej krio-tomografii elektronowej mają tak niski kontrast, że w większości przypadków etykietę każdego woksela musimy przypisać ręcznie.
4. Segmentacja jest przechowywana w oddzielnym pliku danych. Może ona służyć do wygenerowania modelu powierzchniowego, w którym każdy obszar jest przedstawiony innym kolorem i można go oglądać w 3D.
5. Tomogramy mogą być wykorzystane do innych analiz. Na przykład dopasowanie szablonów (template matching) i następujące po nim obliczenia mogą dostarczyć informacji statystycznych o kompleksach makromolekularnych, takich jak rybosomy. Wyrównywanie i uśrednianie podwolumenów (subvolume alignment and averaging) pozwala uzyskać struktury o wyższym kontraście i ujawnić drobniejsze szczegóły.

X. Tworzenie filmów na podstawie tomogramów

Tworzymy filmy, aby podsumować każdy projekt i zaprezentować wizualnie nasze obrazy tomograficzne.

1. Przygotuj scenariusz obejmujący cechy danych, które chcemy zaprezentować, oraz sposób ich renderowania. Na przykład w typowym filmie z projektu tomografii całych komórek zaczynamy od pokazania reprezentatywnej serii danych z różnych kątów nachylenia, a następnie przechodzimy do widoku warstwa po warstwie zrekonstruowanego tomogramu. Następnie prezentujemy segmentację kluczowych makrocząsteczek w komórce, np. silnika wiciowego, kompleksu chemoreceptorów lub filamentu cytozolowego. Na koniec kończymy modelem przedstawiającym idealistyczną interpretację badanych makrocząsteczek.
2. Do renderowania poszczególnych klatek filmu wykorzystuje się oprogramowanie do reprezentacji graficznej, takie jak Amira lub Chimera. Zazwyczaj składamy filmy z krótszych klipów, aby ułatwić wprowadzanie zmian w każdym z nich.
3. Użyj komercyjnego oprogramowania do edycji wideo, takiego jak Adobe Premiere, aby złożyć pojedyncze klatki w klipy filmowe, a następnie klipy w końcowy film.
4. Zaczęliśmy dodawać ścieżkę dźwiękową z narracją filmu. Narracja pełni funkcję „legendy filmu” i pozwala widzom skupić się na prezentowanych danych podczas oglądania materiału.

XI. Animacja

Wizualne opowiadanie historii pozwala przekazywać wiedzę bez konieczności posługiwania się złożonym słownictwem specyficznym dla poszczególnych dziedzin naukowych. Trudne koncepcje stają się proste, gdy towarzyszy im demonstracja wizualna. Praktyka ilustrowania idei biologicznych za pomocą rysunków nie jest nowa. Jednak dopiero w ostatniej dekadzie zaawansowane narzędzia profesjonalnego tworzenia treści 3D zostały wykorzystane do konstruowania animacji naukowych. Obecnie dziesiątki badaczy aktywnie przekładają systemy biologiczne na dynamiczne animacje 3D. Wiele pięknych animacji można znaleźć na stronie http://MolecularMovies.org. Witryna ta oferuje również samouczki oraz udostępnia bezpłatny zestaw narzędzi do manipulowania strukturami molekularnymi w programie Autodesk Maya. Oprogramowanie do tworzenia treści 3D o otwartym kodzie źródłowym, Blender, zawiera kilka importerów PDB stworzonych przez użytkowników.

Proces tworzenia animacji 3D zazwyczaj składa się z trzech etapów:

1. Modelowanie: Używamy oprogramowania do reprezentacji graficznej w celu eksportu powierzchni do formatów, które można zaimportować do programu Maya. Powierzchnie te są albo segmentacjami zrekonstruowanych tomogramów, na przykład błon, ziarnistości lub filamentów, albo reprezentacjami powierzchni molekularnych. Segmentacje tomogramów są wykonywane w programie Amira; powierzchnie molekularne są generowane w programach Chimera lub VMD. Reprezentacje atomowe cząsteczek mogą być importowane bezpośrednio do programu Maya z plików PDB. Po wprowadzeniu modeli do programu Maya mogą być one modyfikowane, duplikowane i odpowiednio rozmieszczone.
2. Animowanie: Animacje są tradycyjnie tworzone ręcznie, przy czym artysta ręcznie przesuwa ruchome obiekty i rejestruje serię klatek kluczowych. Nowoczesne osiągnięcia w oprogramowaniu do grafiki 3D pozwalają obecnie na proceduralne generowanie dynamiki za pomocą wbudowanych modułów i interfejsów API do skryptów.
3. Renderowanie: Dynamika proceduralna może zapewnić przekonujące animacje dynamicznych procesów biologicznych, takich jak strukturalny samomontaż. Jednak ze względu na trudność w realistycznym symulowaniu systemów biologicznych, większość animacji 3D jest nadal tworzona przy użyciu tradycyjnych technik klatek kluczowych. Po ustaleniu dynamiki można dodać adnotacje wizualne, tekstury i efekty oświetlenia. Na koniec wybierana jest ścieżka kamery, a gotowa animacja jest renderowana do postaci filmu.

Dyskusja

W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak przeprowadzać ECT komórek bakteryjnych. Ze względu na ograniczenia czasowe i przestrzenne przedstawiamy jedynie ogólny protokół. Więcej szczegółów można znaleźć w publikacjach, w internecie, w informacjach dostarczonych przez producentów sprzętu i twórców oprogramowania oraz w grupach badawczych zajmujących się ECT. W zależności od badanych gatunków bakterii, użytego sprzętu oraz interesujących nas struktur komórkowych, protokół i parametry eksperymentalne muszą zostać przetestowane i zoptymalizowane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P8920	roztwór 0.1%
MKIII Vitrobot	FEI
Roztwór koloidu złota	Sigma-Aldrich	G1527-25ml	10 nm
Swojowa albumina bydlęca	Invitrogen	P2489	10%
Papier filtracyjny Nr 1	Whatman, GE Healthcare	1001 055
Dekstran	Sigma-Aldrich	31389	15-25%, MW 39000
Kopułowy uchwyt mosiężny	Swiss Precision Company
Zamrażarka wysokociśnieniowa Bal-Tec HPm 010	Leica Microsystems
Kriomikrotom UC6/FC6	Leica Microsystems
Diamentowy nóż do wstępnego przycinania cryo trim 45	Diatome
Jonizator Static line II	Diatome
Krioprzewozyer CX100 Dry shipper	Taylor-Wharton
Stacja wprowadzania próbek MSH	Gatan
Odwrócony mikroskop Ti E/B	Nikon Instruments		Własny
Stół kriomikroskopowy LM	FEI		Własny
TF30-polara	FEI		Z kamerą UltraCam od Gatan
Amira	Visage Imaging