Name: Test pierścienia aortalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-24T15:33:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj test pierścienia aortalnego do badania angiogenezy z wykorzystaniem mysiej aorty w macierzy 3D. Ta metoda pozwala ocenić wpływ związków na wzrost naczyń krwionośnych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jeden dzień przed eksperymentem:
<ol>
 <li>Pozostawić BME (zredukowany czynnik wzrostu, Cultrex, Trevigen) do rozmrożenia na lodzie lub w temperaturze 4°C; po rozmrożeniu przechowywać na lodzie, aby zapobiec ponownemu zestaleniu.</li>
</ol>
Dzień eksperymentu:
<ol>
 <li>Myszy (w wieku 6-7 tygodni) należy znieczulić i upuścić im krew.</li>
 <li>Wyciąć aortę piersiową do szalki Petriego wypełnionej zimnym, sterylnym PBS. </li>
 <li>Przeprowadzić mechaniczne oczyszczanie z otaczającej tkanki tłuszczowej. Uwaga: należy unikać wysychania aorty na każdym etapie.</li>
 <li>Za pomocą skalpela równomiernie pociąć aortę na pierścienie o grubości 1 mm. Cięcie musi być jednorodne i precyzyjne.</li>
 <li>Przenieść pierścienie do świeżego, zimnego PBS i przez cały czas przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Używając schłodzonych końcówek do pipety, dodać do każdej studzienki płytki 48-dołkowej wypukłą kroplę 150 ml zimnego BME. Pozostawić kroplę BME do zastygnięcia w temperaturze 37°C przez 20-30 minut.</li>
 <li>Umieścić pojedynczy pierścień aorty na górnym środku każdej kopuły. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Na każdy pierścień dodać dodatkowe 150 ml BME. Inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Przygotować pożywkę: bezsurowicza pożywka dla ludzkich komórek śródbłonkowe (GIBCO, Carlsbad, CA) uzupełniona o 2% FCS, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Cellgro).</li>
 <li>Do każdej studzienki dodać 500 ml pożywki zawierającej odpowiednio:
 <ol class="lalpha">
 <li>Próbki eksperymentalne.</li>
 <li>Kontrolę pozytywną: suplement wzrostu komórek śródbłonkowych (ECGS, stężenie końcowe 200 μg/ml, BD Biosciences).</li>
 <li>Kontrolę negatywną: samą pożywkę.</li>
 </ol>
</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 12 dni; fotografować pierścienie między 6. a 12. dniem pod standardowym stereoskopem z kontrastem fazowym.</li>
 <li>Opcjonalnie: zebrać nadytęki.</li>
</ol>
Uwagi:
<ol>
 <li>Przez cały czas należy zachować warunki sterylności.</li>
 <li>Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do BME.</li>
</ol>

<ol><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).</li>
<li>Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aortic+ring+assay%3A+a+new+approach+of+the+molecular+genetics+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis.</a> Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).</li>
</ol>

Test pierścienia aortalnego jest przydatnym narzędziem do oceny czynników angiogennych oraz antyangiogennych. Naczynia wyrastające z pierścieni aortalnych rekrutują komórki mięśni gładkich i perycyty do połączenia się z rurką komórek śródbłonkowych, co oznacza, że są one anatomicznie podobne do neonaczyni w warunkach in vivo. Co więcej, test pierścienia aortalnego myszy daje przewagę w postaci szerokiej gamy dostępnych narzędzi transgenicznych dla tego gatunku. Jednak test pierścienia aortalnego ma kilka wad. Po...

test pierścienia aortalnego

Aortic Ring Assay

Angiogeneza, czyli wyrastanie naczyń krwionośnych z już istniejącego układu naczyniowego, towarzyszy zarówno procesom naturalnym, jak i patologicznym. Różne testy angiogenezy obejmują badanie pojedynczych komórek śródbłonka w warunkach hodowli (1). Test pierścienia aorty jest modelem angiogenezy opartym na hodowli organów. W tym teście naczynia angiogenne wyrastają z segmentu aorty (zmodyfikowano z (2)). W skrócie, wycina się aortę piersiową myszy, usuwa warstwę tłuszczową oraz osłonkę zewnętrzną i przygotowuje pierścienie o długości około 1 mm. Poszczególne pierścienie są następnie zatapiane w małej, stałej kopule ekstraktu macierzy podstawowej (BME), odlewanej w poszczególnych studzienkach płytki 48-dołkowej. Do pierścieni można bezpośrednio dodawać czynniki angiogenne oraz inhibitory angiogenezy, a w celu badania parakrynnych efektów angiogennych można zastosować mieszaną kokulturę pierścieni aorty i innych typów komórek. Wyrastanie naczyń obserwuje się pod stereomikroskopem w okresie od 6 do 12 dni. Ze względu na dużą zmienność wynikającą z niejednorodności segmentów aorty, zdecydowanie zaleca się prowadzenie doświadczeń w sześciu powtórzeniach. Wzrost nowych naczyń jest monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu i obrazowany za pomocą mikroskopii fazowej, a nadnadkreszty są zbierane w celu pomiaru odpowiednich czynników angiogennych i antyangiogennych, markerów śmierci komórkowej oraz azotynów.

Angiogeneza, czyli wypączkowanie naczyń krwionośnych z istniejącej sieci naczyniowej, wiąże się zarówno z procesami naturalnymi, jak i patologicznymi. W niniejszej pracy prezentujemy test pierścienia aorty, który umożliwia bezpośrednie dodawanie potencjalnych stymulatorów i inhibitorów angiogenezy do pierścieni aorty w hodowli. Wypączkowanie oraz wzrost nowych naczyń można ocenić poprzez inspekcję pierścieni aorty w okresie od 6 do 12 dni.

Test pierścienia aortalnego

Angiogeneza, czyli wyrastanie naczyń krwionośnych z istniejącej sieci naczyniowej, jest powiązana zarówno z procesami fizjologicznymi, jak i patologicznymi. Różne mechanizmy angiogenezy...

Ogólnym celem testu pierścienia aorty (aortic ring assay) jest stworzenie elastycznego systemu eksperymentalnego, w którym naczynia krwionośne wypukają się z całych fragmentów aorty mysiej wewnątrz macierzy 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie aorty piersiowej z myszy, a następnie staranne oczyszczenie jej z pozostałych tkanek otaczających. Przekroje oczyszczonej aorty lub pierścienie aorty umieszcza się w poszczególnych studzienkach płytki 48-dołkowej, z których każda zawiera sformowany w kopuły ekstrakt z macierzy podstawowej (BME).Dodatkowa kropla BME zamyka pierścień w strukturze 3D. Macierz może zawierać dowolny wybrany odczynnik eksperymentalny. Po inkubacji trwającej kilka dni można zaobserwować wyrastanie naczyń z pierścieni aorty i ocenić potencjał angiogenny badanych związków.Witam, nazywam się Karen Bein i pracuję w laboratorium dr. E. Lewisa w Departamencie Biochemii Klinicznej na Uniwersytecie Beon w Be Sheva w Izraelu. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę testu pierścienia aorty mysiej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu różnych substancji na tworzenie naczyń krwionośnych.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozwolić ekstraktowi z błony podstawnej (BME) na rozmrożenie na lodzie lub w temperaturze 4°C. Po rozmrożeniu należy nadal przechowywać BME w niskiej temperaturze, aby zapobiec jego ponownemu zastygnięciu.W dniu eksperymentu uśmierć mysz w wieku od sześciu do siedmiu tygodni poprzez standardowy zastrzyk z ketaminy i ksylazyny, wykonaj szybkie upuszczenie krwi z tętnic szyjnych, a następnie dokonaj dyslokacji szyjnej. Rozpocznij procedurę, przecierając zwierzę 70% etanolem w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj sterylnej pęsety i nożyczek chirurgicznych, aby wykonać pionowe nacięcie skóry i otworzyć ścianę otrzewną.Należy wykonać nacięcie w celu odsłonięcia górnej części mostka, gdzie przecina się również klatkę piersiową i usuwa przeponę. Następnie należy ostrożnie odsunąć wszystkie organy, całkowicie odsłaniając aortę piersiową położoną wzdłuż kręgosłupa. Po odsłonięciu aorty należy wprowadzić cienką sterylną pęsetę między aortę a kręgosłup. Rozwierając pęsetę, należy stopniowo unieść aortę z jej łoża, oddzielając odcinek piersiowy od pozostałej części aorty.Po oddzieleniu aorty, użyj ostrych nożyczek, aby wyciąć ją z organizmu myszy, zaczynając od końca znajdującego się w bliskim sąsiedztwie naczyń nerkowych i kończąc w pobliżu serca. Umieść wyciętą aortę piersiową w płytce Petriego wypełnionej zimnym, sterylnym PBS. Po usunięciu aorty można przygotować pierścienie aortalne, używając dwóch sterylnych pęset i pracując pod stereomikroskopem.Oczyść aortę piersiową z otaczającej tkanki tłuszczowej. Należy uważać, aby nie uszkodzić aorty i trzymać ją wyłącznie za krawędzie. Aortę należy wielokrotnie zanurzać w szalce Petriego zawierającej PBS, aby zapobiec odwodnieniu do czasu całkowitego oczyszczenia.Po oczyszczeniu aorty piersiowej należy użyć skalpela i, pracując pod stereomikroskopem, równomiernie pociąć aortę na pierścienie o grubości 1 mm. Wykorzystując jako prowadnicę linijkę umieszczoną pod powierzchnią tnącą, należy pamiętać o stosowaniu nowego ostrza i jego okresowej wymianie w celu zachowania ostrości. Końce aorty nie są wykorzystywane. Po wycięciu każdego pierścienia należy bardzo delikatnie przenieść go pęsetą do nowej płytki zawierającej zimny PBS.Umieść wszystkie pierścienie w tej samej płytce zawierającej PBS, aby zapewnić randomizację testu. Ponieważ każdy segment aorty ma nieco inny potencjał angiogenny, przechowuj pierścienie na lodzie. Następnie przygotuj płytkę testową, używając wcześniej schłodzonych końcówek do pipet.Do każdego dołka płytki 48-dołkowej dodaj kroplę około 150 µL schłodzonego BME; kropla utwardza się, tworząc kopułę w trakcie procesu. BME umożliwia transport substancji, chemotaksję komórek, a przede wszystkim różnicowanie i migrację komórek prowadzącą do powstawania nowych naczyń. Dołków obwodowych należy wypełnić PBS, aby zapobiec odwadnianiu BME. Pozostaw kroplę BME do utwardzenia w temperaturze 37 °C przez 20 do 30 minut. Po utwardzeniu BME ostrożnie wyjmij pierścień aorty z naczyń Petriego za pomocą pęsety. Aby zapobiec uszkodzeniom, pierścień należy przenieść wewnątrz kropli lipidu tworzącej się między końcówkami pęsety. Dzięki napięciu powierzchniowemu cieczy umieść pojedynczy pierścień aorty w górnej części centrum każdej kopuły i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Na każdy pierścień dodaj kolejne 150 µL BME i inkubuj przez 20 do 30 minut.W temperaturze 37°C pierścień zostaje teraz zatopiony w BME oraz roztworze analitycznym. Do płytki można dodać materiały w celu rozpoczęcia analizy. Uzupełnij wcześniej przygotowane bezserumowe medium dla ludzkich komórek śródbłonka albo materiałem eksperymentalnym, albo suplementem wzrostu komórek śródbłonka jako kontrolą pozytywną lub negatywną.Użyć samego podłoża. Do każdej studniki dodać 500 µL podłoża z suplementem pres i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 do 12 dni. W czasie inkubacji badać płytkę pod mikroskopem, poszukując naczyń wyrastających z aorty oraz zaawansowanych, dojrzałych naczyń, które można zidentyfikować po dalszym rozgałęzieniu.Należy przeprowadzić trójwymiarową dokumentację fotograficzną pierścieni tkanki pierścieniowej w okresie od szóstego do dwunastego dnia, korzystając ze standardowego stereomikroskopu z kontrastem fazowym. Dodatkowo należy pobierać nadsączone w różne dni między szóstym a dwunastym dniem; próbki przeznaczone do użycia w ciągu jednego dnia należy przechowywać w temperaturze 4°C, natomiast próbki do późniejszego wykorzystania należy przechowywać w temperaturze -20°C lub -80°C. Nadsączone można analizować za pomocą różnych technik, takich jak test ELISA w celu oznaczenia vgf lub test GREASE do pomiaru poziomu tlenku azotu.Obrazy te zostały wykonane 12 dni po umieszczeniu pierścieni w studzienkach i inkubacji z hodowlą (medium widoczne w górnym rzędzie obrazów) lub ECGS, użytym jako kontrola pozytywna dla kiełkowania naczyń widocznego w dolnym panelu. Każdy obraz stanowi reprezentatywny kadr z czterech z 12 pierścieni, które są zazwyczaj stosowane w tym teście dla każdego stanu doświadczalnego.Narożnik każdego pierścienia aorty w każdej oddzielnej studni jest czarny. Przy takim sposobie fotografowania pierścienie aorty poddane działaniu ECGS wykazują wzrost naczyń, a strzałki wskazują kilka z wielu powstałych naczyń. Każde naczynie charakteryzuje się strukturą łańcuchów komórek śródbłonka z rzadkimi rozgałęzieniami, co wskazuje na ich dojrzałość.W hodowli nie obserwuje się żadnych kiełkujących naczyń. Dołki z pożywką w górnym panelu. Właśnie zaprezentowaliśmy, jak przeprowadzić test aortowy podczas realizacji tej procedury. Ważne jest, aby pracować precyzyjnie i przestrzegać określonych warunków.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty (MTAC) zachowuje podstawowe cechy regularnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC), eliminując jednocześnie użycie respiratora z intubacją tchawiczą. Okazuje się, że jest to wysoce pożądana metoda w wysokoprzepustowych badaniach przeciążenia lewej komory, szczególnie w badaniach translacyjnych.

Minimalnie inwazyjne poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Tutaj prezentujemy protokół poprzecznego zwężenia aorty (TAC) za pomocą torakotomii bocznej. Technika ta jest minimalnie inwazyjnym, zamkniętym zabiegiem chirurgicznym klatki piersiowej, mającym na celu symulację przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca u myszy wykorzystujących standardowe warunki laboratoryjne TAC.

Model z zamkniętą klatką piersiową do wywoływania poprzecznego zwężenia aorty u myszy

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół chirurgicznego usuwania aorty w dobrze znanym mysim modelu zwężenia aorty. Procedura ta pozwala nie tylko na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw odwrotnej przebudowy lewej komory i regresji przerostu, ale także na przetestowanie nowych opcji terapeutycznych, które mogą przyspieszyć powrót do zdrowia mięśnia sercowego.

Badanie odwrotnej przebudowy lewej komory przez odpasowanie aorty u gryzoni

W obecnym badaniu przedstawiono nieinwazyjny protokół oceny anatomii i funkcji serca metodą echokardiografii przezklatkowej u dorosłych szczurów. Szczegółowo badane są zastawki serca, wszystkie cztery komory serca oraz aorta wstępująca, łuk aorty i aorta zstępująca.

Echokardiograficzna ocena anatomii i funkcji serca u dorosłych szczurów

Protokół ten przedstawia praktyczny przewodnik po operacji tworzenia niedomykalności aorty (AR) u myszy. Ocena myszy AR za pomocą echokardiografii i inwazyjnego pomiaru hemodynamicznego podsumowuje jej klinicznie istotne cechy hipertrofii ekscentrycznej wywołanej przeciążeniem objętościowym, co sugeruje jej obiecujące zastosowanie w badaniu przerostu mięśnia sercowego.

Chirurgicznie wywołane przeciążenie objętości serca przez niedomykalność zastawki aortalnej u myszy

Obecny protokół opisuje technikę miografu drutowego do pomiaru reaktywności naczyniowej tętnicy wieńcowej szczura.

Ustandaryzowane przygotowanie pierścienia wieńcowego u szczurów i rejestracja w czasie rzeczywistym dynamicznych zmian napięcia wzdłuż średnicy naczynia

Obecny protokół opisuje nową technikę opaski aortalnej u myszy w celu wywołania przeciążenia ciśnieniem przerostu mięśnia sercowego. Do banderolowania stosuje się gumowy pierścień o stałej średnicy wewnętrznej. Ta nowa technika obiecuje mniejszą wariancję i bardziej powtarzalne dane dla przyszłych eksperymentów.

O-ring aorty w porównaniu z tradycyjnym poprzecznym zwężeniem aorty w celu modelowania przerostu serca wywołanego przeciążeniem ciśnienia

Przedstawiamy metodę montażu zaworu aortalnego świni na powielaczu impulsów w celu przetestowania jego właściwości hydrodynamicznych. Metoda ta może być stosowana do określania zmiany hydrodynamiki po zastosowaniu procedury eksperymentalnej lub nowatorskiego wyrobu medycznego przed użyciem w dużym modelu zwierzęcym.

Model świni ex vivo do badań hydrodynamicznych eksperymentalnych procedur zastawki aortalnej i nowatorskich urządzeń medycznych

Poznaj test pierścienia aortalnego do badania angiogenezy z wykorzystaniem mysiej aorty w macierzy 3D. Ta metoda pozwala ocenić wpływ związków na wzrost naczyń krwionośnych in vitro.

Test pierścienia aortalnego

Przeglądaj więcej filmów