Test pierścienia aortalnego

Ogólnym celem testu pierścienia aortalnego jest zapewnienie elastycznego systemu eksperymentalnego, w którym naczynia krwionośne są kiełkowane z całych fragmentów aorty myszy wewnątrz matrycy 3D. Osiąga się to, najpierw wycinając aortę piersiową u myszy, a następnie ostrożnie oczyszczając ją z resztek otaczającej tkanki. Plastry czystej aorty lub pierścieni aorty umieszcza się w pojedynczych dołkach 48-dołkowej płytki, z których każda zawiera ekstrakt z macierzy podstawowej lub BME uformowane w kopuły.

Dodatkowa kropla BME otacza pierścień w strukturze 3D. Matryca może zawierać dowolny odczynnik eksperymentalny do wyboru. Po kilkudniowej inkubacji można zaobserwować, że naczynia wyrastają z pierścieni aortalnych i można ocenić potencjał angiogenny badanych związków.

Cześć, nazywam się Karen Bein i pracuję w laboratorium dr E. Lewisa na Wydziale Biochemii Klinicznej na Uniwersytecie Negatywnym Beon w Be Sheva Israel. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę testu pierścienia aortalnego u myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania wpływu różnych materiałów na tworzenie naczyń krwionośnych.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, pozwól, aby ekstrakt z macierzy podstawowej lub BME rozmroził się na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu nadal utrzymuj BME w niskiej temperaturze, aby zapobiec jego ponownemu zestaleniu.

W dniu eksperymentu należy poddać eutanazji sześcio- lub siedmiotygodniową mysz za pomocą standardowego zastrzyku ketaminy i ksylazyny, które szybko krwawią przez tętnice szyjne, a następnie powodują zwichnięcie szyjki macicy. Rozpocznij procedurę od przetarcia zwierzęcia 70% etanolem w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Następnie, podczas pracy pod lunetą sekcyjną, za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych należy wykonać pionowe nacięcie skóry i otworzyć ścianę otrzewnej.

Nacięcie należy wykonać w celu odsłonięcia górnego mostka, w którym przecina się również klatkę piersiową i usuwa się przeponę. Kontynuuj ostrożne odsuwanie wszystkich narządów na bok, całkowicie odsłaniając aortę piersiową znajdującą się wzdłuż kręgosłupa z odsłoniętą aortą, włóż cienką sterylną pęsetę między aortę a kręgosłup. Rozłóż pęsetę i stopniowo podnieś aortę z jej łożyska, oddzielając odcinek piersiowy od reszty aorty.

Teraz, gdy aorta jest oddzielona, użyj ostrych nożyczek, aby odciąć ją od myszy, zaczynając od końca, który znajduje się w bliskiej odległości od naczyń nerkowych i kończy się w pobliżu serca. Umieść wyciętą aortę piersiową na szalce Petriego wypełnionej zimnym, sterylnym PBS. Teraz, po usunięciu aorty, pierścienie aortalne można przygotować za pomocą dwóch sterylnych pęset i pracować pod lornetką.

Oczyść aortę piersiową z otaczającej tkanki tłuszczowej. Upewnij się, że nie uszkodziłeś aorty i trzymaj ją tylko za krawędzie. Aortę należy wielokrotnie zanurzać w PBS zawierającej szalkę Petriego, aby zapobiec odwodnieniu, aż do ostatecznego oczyszczenia.

Teraz, gdy aorta piersiowa jest czysta, użyj ostrza chirurgicznego i pracuj pod lornetką, aby równomiernie pokroić aortę na jednomilimetrowe pierścienie. Używając linijki umieszczonej pod powierzchnią cięcia jako prowadnicy, upewnij się, że używasz nowego ostrza i wymieniaj je od czasu do czasu, aby zachować ostrość. Końce aorty nie są używane Po przecięciu każdego pierścienia za pomocą pęsety bardzo delikatnie przenieś go do nowego naczynia zawierającego zimny PBS.

Umieść wszystkie pierścienie na tej samej płytce zawierającej PBS, aby upewnić się, że test jest losowy. Ponieważ każdy segment aorty ma nieco inny potencjał angiogenny, utrzymuj pierścienie na lodzie. Następnie przygotuj płytkę testową za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet.

Dodaj do każdej studzienki na 48-dołkowej płytce wokół kropli 150 mikrolitrów zimnego BME, kropla zestala się do kopuły w połowie ruchu. BME umożliwia transport substancji, chemotaksję komórek, a co najważniejsze, różnicowanie i migrację komórek, która prowadzi do tworzenia się naczyń neo studnie obwodowe są wypełnione PBS Aby uniknąć odwodnienia BME, pozwól, aby kropla BME zestaliła się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Gdy BME zestale się ostrożnie wyjmij pierścień aortalny z szalki Petriego za pomocą pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu, pierścień powinien zostać przeniesiony do kropli lipidu, która tworzy się między końcówkami pęsety W wyniku napięcia powierzchniowego cieczy umieść pojedynczy pierścień aortalny w górnej środkowej części każdej kopuły i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza na szczycie każdego pierścienia, dodaj dodatkowe 150 mikrolitrów BME i inkubuj przez 20 do 30 minut.

W temperaturze 37 stopni Celsjusza pierścień jest teraz zamknięty w BME i teście. Materiały można dodać do płytki w celu zainicjowania testu. Pres uzupełnia wcześniej przygotowaną pożywkę wolną od ludzkiej surowicy śródbłonka materiałem doświadczalnym lub suplementem do wzrostu komórek śródbłonka jako kontrolą pozytywną dla kontroli ujemnej.

Użyj samego podłoża. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki z suplementem diety do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do 12 dni. Podczas tego okresu inkubacji należy zbadać płytkę pod mikroskopem i poszukać naczyń wyrastających z aorty oraz zaawansowanych dojrzałych naczyń zidentyfikowanych przez dalsze rozgałęziające się naczynia.

Powinien rozciągać się od tkanki pierścieniowej, trójwymiarowo sfotografować pierścienie między szóstym a dwunastym dniem w standardowym stereoskopie z kontrastem fazowym. Ponadto należy zbierać supernatanty w różne dni między szóstym a dwunastym dniem i przechowywać w temperaturze czterech stopni do wykorzystania w ciągu jednego dnia lub Eloqua i przechowywać w temperaturze minus 20 lub minus 80 do wykorzystania w przyszłości. Supernatanty mogą być analizowane za pomocą różnych technik, takich jak Eliza dla vgf lub test smaru dla poziomu tlenku azotu.

Obrazy te zostały zebrane 12 dni po umieszczeniu pierścieni w studzienkach i inkubacji z kulturą, pożywką widoczną w górnym rzędzie obrazów lub EKG używanym jako pozytywna kontrola kiełkowania naczyń. W dolnym panelu. Każdy obraz jest reprezentatywną migawką czterech z 12 pierścieni, która jest zwykle używana w teście dla każdego warunku.

Róg każdego pierścienia aorty w każdej oddzielnej studzience jest. Sfotografowane w ten sposób pierścienie aortalne, które zostały wystawione na działanie EKGS, wykazują wzrost naczyń, a strzałki wskazują na kilka z wielu naczyń, które się uformowały. Każde naczynie jest scharakteryzowane jako łańcuchy komórek śródbłonka z okazjonalnymi rozgałęzieniami wskazującymi, że są dojrzałe.

W kulturze nie można zaobserwować kiełkujących naczyń. Średnie studzienki w górnym panelu, Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać test kor aorty podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o dokładnej pracy i zrozumieniu ich warunków.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.