Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raków: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest zrozumienie właściwości błon pobudliwych i podstaw jonowych spoczynkowego potencjału błonowego, a także poznanie metod pomiaru potencjału błonowego, a także wykazanie właściwości transmisji synaptycznej. W jednej z części eksperymentu zostanie zmierzony spoczynkowy potencjał błonowy podczas zmiany zewnątrzkomórkowego potasu. W innej części eksperymentu badane będą mechanizmy różnicowania synaps poprzez rejestrację, stymulowane odpowiedzi synaptyczne w różnych jednostkach motorycznych.

Następnie prezentowany jest obwód neuronowy, który jest łatwy w utrzymaniu. Preparat ten może być wykorzystywany do nauczania, a także do badania różnych aspektów czuciowego przez OUN, neuron ruchowy po obwód mięśniowy. Ten zestaw eksperymentów pokazuje łatwość wykorzystania modelu raków do rozwiązywania problemów związanych z integracją i transmisją synaptyczną potencjału błonowego oraz różnicami strukturalnymi typów włókien mięśniowych.

Głównymi zaletami stosowania preparatu rakowego w nauczaniu pojęć i technik elektrofizjologicznych są łatwość preparacji, żywotność preparatu przy minimalnej ilości soli fizjologicznej, łatwość uzyskania odpowiedzi synaptycznych oraz łatwość rozpoznania ogólnego układu anatomicznego mięśni. Techniki te mogą być również stosowane do innych preparatów i przyczynią się do lepszego zrozumienia fizjologii i modulacji synaps oraz różnic biochemicznych i strukturalnych w demonstrowanym preparacie. Aby rozpocząć operację, wybierz raka o długości ciała od sześciu do 10 centymetrów i umieść go w kruszonym lodzie na pięć minut, aby go znieczulić, aby odciąć głowę rakowi, przytrzymaj go z tyłu głowy, upewniając się, że palce są poza zasięgiem pazurów i pyska raka za pomocą dużych nożyczek.

Szybko usuń głowę, wykonując czyste cięcie zza oczu raków, usuń nogi i pazury raków, aby uniknąć obrażeń. Usuń style u samców i pływaków zarówno u samców, jak i kobiet. Pozbądź się głowy i przydatków.

Następnie oddziel brzuch od klatki piersiowej, wykonując nacięcie wzdłuż błony przegubowej, która łączy brzuch i klatkę piersiową. Zachowaj brzuszną część raka i pozbądź się klatki piersiowej, kierując nożyczki lekko w dół w kierunku strony brzusznej i pod kątem wykonaj nacięcie w skorupie wzdłuż dolnej bocznej granicy każdej strony brzucha. Uważaj, aby nie wciąć się zbyt głęboko w raki.

Podążaj za naturalnym wzorem muszli linii raków, które biegną wzdłuż każdego segmentu za pomocą kleszczy. Usuń brzuszną część skorupy, pociągając ją do góry i do tyłu. Uważając, aby nie zniszczyć mięśni brzucha.

Usuń mięśnie zginaczy. W tym momencie można zobaczyć białą masę tkanki na szczycie głębokich mięśni zginaczy. Ostrożnie usuń tę tkankę za pomocą kleszczy.

Przewód pokarmowy jest teraz widoczny jako mała rurka biegnąca wzdłuż linii środkowej głębokich mięśni zginaczy. Usuń go, ściskając go kleszczami u góry i odciągając od brzucha. Przetnij dolną część przewodu pokarmowego na końcu ogona.

Spłucz preparację solą fizjologiczną, aby upewnić się, że odpady kałowe nie przeszkadzają w przygotowaniu. Za pomocą szpilek rozwarstwiających przypiąć górny i dolny róg preparatu do szalki Petriego pokrytej osłoną S. Mięśnie prostowników brzucha są teraz odsłonięte.

Wlać roztwór soli fizjologicznej na szalkę Petriego, aby przykryć preparat do czasu wykonania zapisów wewnątrzkomórkowych. Przenieś szalkę Petriego do mikroskopu i użyj wosku pod szalką, aby zapobiec jej przesuwaniu się. Aparatura używana do zapisów wewnątrzkomórkowych jest pokazana na tym rysunku.

Odpowiednie połączenia i ustawienia są podane w załączonym tekście. Skonfiguruj oprogramowanie do tworzenia wykresów laboratoryjnych zgodnie z instrukcjami. W załączonym tekście umieść przewód uziemiający w kąpieli solankowej.

Umieść końcówkę szklanej mikropipety wypełnionej trzema molowymi roztworami chlorku potasu w kąpieli solankowej i sprawdź rezystancję elektrody. Rezystancja elektrody powinna wynosić od 20 do 60 megaomów. Użyj grubego pokrętła na amplifier, aby przesunąć linię na wykresie laboratoryjnym do zera przy oświetleniu o dużej intensywności.

Spójrz przez mikroskop i zidentyfikuj podłużne mięśnie DEM. Użyj sondy elektrodowej, aby wprowadzić elektrodę wewnątrzkomórkową do włókna mięśniowego mięśnia DEM. Elektroda powinna być ledwo wprowadzona do włókna mięśniowego.

Uważaj, aby nie przeniknąć do końca przez komórkę. Zmierz amplitudę potencjału spoczynkowego. Przeciągnij kursor M na ślad z lokalizacji w lewym dolnym rogu okna wykresu.

Umieść znacznik M na linii bazowej i przesuń kursor do najniższego punktu na nagrywanym sygnale. Różnica między znacznikiem a aktywnym kursorem jest wyświetlana w prawym górnym rogu ekranu. Wartość ta jest napięciem spoczynkowego potencjału błony.

Podziel zarejestrowane napięcie przez wielkość wzmocnienia, w tym przypadku zastosowano 10-krotne wzmocnienie. Następnie zamień napięcie z woltów na miliwolty. Po zarejestrowaniu potencjału spoczynkowego dla tego włókna mięśniowego, spójrz przez mikroskop i ostrożnie wyjmij elektrodę z włókna mięśniowego.

Powtórz zapis wewnątrzkomórkowy na innych włóknach mięśniowych. Kolejna część tego eksperymentu będzie monitorować wpływ podniesienia zewnątrzkomórkowego stężenia potasu na błonę spoczynkową. Zostanie użytych sześć potencjalnych roztworów soli rakowej o stężeniach potasu 5,4, 20, 40, 60, 80 i 100 milimolowych.

Wybierz mięsień, który nie drga, aby wykonać następny zapis wewnątrzkomórkowy między nagraniami. Zastąp roztwór do kąpieli następnym roztworem chlorku potasu o wyższym stężeniu. Pamiętaj, aby za każdym razem całkowicie pokryć preparat.

Rejestruj zmiany potencjału błony dla każdego roztworu. Efekt podniesienia zewnątrzkomórkowego stężenia potasu, potencjał błonowy jest pokazany na tym zrzucie ekranu, wykreśl spoczynkowe potencjały błonowe dla każdego stężenia potasu na półlogarytmicznym wykresie zewnątrzkomórkowego stężenia potasu w funkcji potencjału błonowego. Wyrównaj potencjał spoczynkowy na 5,4 milimolowego potasu zewnątrzkomórkowego.

W przypadku krzywych hipotetycznych i obserwowanych porównaj nachylenie linii obserwowanej z nachyleniem linii hipotetycznej. Po zakończeniu tych zapisów elektrofizjologicznych kolejnym krokiem jest zbadanie anatomii włókien mięśniowych i ich wzorca unerwienia. Przełóż preparat do stojącego naczynia i dodaj błękit metylenowy.

Po pięciu minutach usuń błękit metylenowy i dodaj świeżą sól fizjologiczną z raków. Poszukaj głównego nerwu, który unerwia mięśnie w segmencie. Naszkicuj wzór unerwienia mięśni S-E-M-D-E-L 2D EL i DEM w segmencie.

Następnie przenieś preparat pod wyciąg. Usuń sól fizjologiczną i dodaj utrwalacz. Zastosowanym tutaj utrwalaczem jest roztwór potasu.

Zadaniem dygestorium jest uniknięcie oparów utrwalacza. Bądź bardzo ostrożny, aby nie dostać tego roztworu na skórę lub do oczu. Jeśli oczy zaczną piec, natychmiast przemyj je w stacji do przemywania oczu.

Pozostaw roztwór boin na preparacie przez około 10 minut, a następnie za pomocą pipety zamienij roztwór na sól fizjologiczną. Wytnij cienki segment mięśnia DEL jeden lub DEL dwa. Umieść go na szklanym szkiełku.

Oznacz slajd etykietą. Powtórz procedurę dla mięśnia SEM. Użyj mikroskopu złożonego, aby zobaczyć wzór prążków sarkomeru w obu preparatach tkankowych.

Następna seria eksperymentów zbada, w jaki sposób rejestrować reakcje synaptyczne w mięśniach brzucha raków. Wybierz innego raka, odetnij mu głowę. Usuń klatkę piersiową i przydatki oraz odsłoń mięśnie prostowników brzucha, jak pokazano w operacji.

W pierwszej części tego filmu, za pomocą mikroskopu, znajdź nerw przenoszący aksony motoryczne do mięśni prostowników. Poszukaj segmentu z najbardziej dostępnym nerwem. Nerw jest biały i można go zobaczyć, używając pipety do rozpylenia soli fizjologicznej na preparat lub lekko na preparat.

Powoduje to ruch nerwu, a tym samym ułatwia jego identyfikację. Umieść elektrodę ssącą trzymaną przez manipulator mikrom bezpośrednio nad nerwem. Delikatnie pociągnąć za strzykawkę, aby wciągnąć nerw do elektrody.

Możesz zobaczyć nerw zasysany do elektrody przez mikroskop. Dostosuj ustawienia w oprogramowaniu wykresów laboratoryjnych zgodnie z opisem w dołączonym artykule. Napełnij trzymolową szklaną mikroelektrodę z chlorkiem potasu i podłącz ją do stopnia głównego i laboratorium zasilania.

Użyj pokrętła kursu na amplifier, aby przesunąć linię na wykresie laboratoryjnym do zera. Przed włożeniem elektrody należy kilkakrotnie włączyć, a następnie wyłączyć pokrętło. W celu zbadania rezystancji elektrody należy zmierzyć amplitudę otrzymanych wartości.

Spójrz przez mikroskop i użyj sondy elektrody, aby wprowadzić elektrodę do jednego z podłużnych włókien mięśniowych, DEM lub DL jeden lub DL dwa. Uważaj, aby nie przeniknąć przez włókno mięśniowe. Preparat jest już gotowy do eksperymentu.

Elektroda ssąca służy do stymulacji segmentowego pęczka nerwowego, a szklana mikroelektroda służy do rejestrowania odpowiedzi synaptycznej z włókna mięśniowego, wyzwalania stymulatora przeszczepu, aby stymulować nerw z częstotliwością jednego herca w celu uzyskania odpowiedzi fazowych. Następnie umieść elektrodę we włóknie mięśniowym SEL. SEL jest mięśniem tonicznym.

Stymuluj nerw krótkimi impulsami o częstotliwości 10 Hz, aby uzyskać odpowiedzi toniczne. Porównaj zarejestrowane reakcje mięśni DEL i SEL. Należy zauważyć, że mięśnie fazowe DEL mają odpowiedzi synaptyczne o większej amplitudzie niż mięśnie toniczne SEL.

Następny zestaw eksperymentów koncentruje się na mięśniach zginaczy raków, a nie na mięśniach prostowników. Zaczynając od nowego raka, odizoluj brzuch, jak pokazano w tej operacji. W pierwszej części tego filmu umieść wyizolowany preparat z ogona na szalce Petriego wypełnionej solą fizjologiczną, przypnij ogon i górną część preparatu.

Należy pamiętać, że dec Caro eksperymentuje na mięśniach zginaczy tonicznych, brzuszny rdzeń nerwowy musi pozostać nienaruszony. Za pomocą skalpela rozpocząć podłużne cięcie przez błonę przegubową między dwoma żebrami po brzusznej stronie preparatu. Bądź bardzo ostrożny, aby nie ciąć zbyt głęboko podczas wykonywania tego cięcia, ponieważ głębokie cięcie może przeciąć korzeń nerwu ruchowego, aby upewnić się, że mięśnie powierzchowne nie zostaną uszkodzone.

Wykonaj następny krok. Patrząc przez mikroskop za pomocą nożyczek lub skalpela, wytnij poziomo od podłużnego nacięcia w cienkiej warstwie błony pokrywającej mięsień. Powiększ nacięcie, aby utworzyć klapę z membrany przegubowej i podnieś klapkę do góry.

Użyj nożyczek, aby odciąć płat, odsłaniając powierzchowne mięśnie zginaczy do wewnątrzkomórkowego zapisu z powierzchownych mięśni zginaczy. Użyj tego samego oprzyrządowania i konfiguracji, które były używane do rejestrowania spoczynkowego potencjału błonowego i odpowiedzi synaptycznych z prostowników brzucha. Tak jak poprzednio, użyj elektrody wewnątrzkomórkowej wypełnionej trzema molowymi chlorkami potasu.

Włóż elektrodę do włókna mięśniowego powierzchownych mięśni zginaczy, uważając, aby nie przeniknąć przez mięsień. Rejestruj spontaniczną aktywność EPSP. Zwróć uwagę na różne rozmiary EPSP i czy są one obecne.

Weź mały pędzel i ostrożnie pędzlem wzdłuż krawędzi naskórka w tym samym segmencie, w którym znajduje się elektroda rejestrująca. Należy zwrócić uwagę na wszelkie zmiany w częstotliwości lub wielkości EPSP spowodowane stymulacją, jeśli zaobserwowano większą reakcję. Wskazywałoby to na rekrutację dodatkowych neuronów ruchowych reagujących na zmianę w odpalaniu nerwów czuciowych.

Ostrożnie wymień roztwór do kąpieli solankowej na roztwór zawierający neuromodulator, taki jak mikromolowa serotonina lub sól fizjologiczna z bąbelkami dwutlenku węgla. Następnie powtórz stymulację pędzlem. Zwróć uwagę na wpływ, jaki zmiana roztworu do kąpieli ma na zarejestrowaną aktywność.

Zmień sól fizjologiczną w kąpieli z powrotem na normalną sól fizjologiczną i obserwuj, że aktywność włókien mięśniowych wraca do wartości wyjściowej. Ten rysunek przedstawia EPSP zarejestrowane w powierzchownym włóknie mięśniowym zginacza. Zwróć uwagę na różne rozmiary EPSP.

Kolejny etap tego eksperymentu wykorzystuje elektrodę zewnątrzkomórkową do monitorowania potencjałów czynnościowych neuronów ruchowych reagujących na aktywność w OUN do obwodu neuronu ruchowego. Zacznij od wykonania elektrody ssącej, aby stymulować nerwy czuciowe. Przeciągnij kawałek plastikowej rurki nad płomieniem.

Następnym krokiem jest przycięcie rurki z powrotem do żądanego rozmiaru. Aby to zrobić, będziesz musiał przyjrzeć się nerwowi w swoim przygotowaniu, aby ocenić pożądaną średnicę otworu dla elektrody ssącej. W zależności od wielkości raków, wiązki nerwowe mogą mieć różną wielkość od około jednego milimetra do kilku milimetrów średnicy.

Wytnij rozciągnięty odcinek rurki, aby otwór w końcówce miał odpowiedni rozmiar, aby utrzymać nerw. Jeśli otwór jest zbyt duży, nerw może wypaść. Jeśli otwór jest zbyt mały, nerw może zostać uszkodzony przez nacisk elektrody.

Umieść plastikową rurkę na końcówce szklanej elektrody suc. Konfiguracja elektrofizjologii i oprogramowania różni się nieco od monitorowania odpowiedzi zewnątrzkomórkowych w porównaniu z konfiguracją zapisów wewnątrzkomórkowych. Sprzęt określony w załączonym artykule zasysa trzecią drogę, która unerwia powierzchowny mięsień zginacza do elektrody ssącej.

Możesz teraz zacząć rejestrować potencjały czynnościowe. Ta trasa ma pięć neuronów ruchowych wzbudnicy i jeden neuron ruchowy inhibitora. Po zarejestrowaniu podstawowej aktywności stymuluj naskórek szczoteczką, aby obserwować zmianę generowanych potencjałów czynnościowych.

Następnie zastąp roztwór do kąpieli neuromodulatorami, takimi jak serotonina, tak jak w poprzednim eksperymencie, i zapisz wszelkie zmiany w odpowiedzi. Dodatkowe ćwiczenia znajdują się w załączonym tekście. Zapis ten pokazuje potencjały czynnościowe zarejestrowane z trzeciej trasy przed i w trakcie stymulacji naskórka szczoteczką, porównaj częstotliwość potencjałów czynnościowych przed szczotkowaniem z ich częstotliwością podczas stymulacji.

Zapis ten pokazuje potencjały czynnościowe zarejestrowane z trzeciej drogi w roztworze soli fizjologicznej i w roztworze serotoniny. Porównaj częstotliwość potencjałów czynnościowych w normalnej soli fizjologicznej z ich częstotliwością i serotoniną, jak właśnie pokazano. Szczotkowanie zwiększa częstotliwość wypalania w stosunku do linii bazowej.

Wykazano również, że serotonina zwiększa częstotliwość wypalania w porównaniu z normalną solą fizjologiczną. Rysunek ten pokazuje, że gdy szczotkowanie i serotonina są połączone, następuje jeszcze większy wzrost częstotliwości wypalania. Porównanie zewnętrznie i teoretycznie wyprowadzonych skutków zewnętrznego stężenia potasu na spoczynkowy potencjał błonowy wskazuje na wpływ jonów na potencjał błonowy.

Pokazaliśmy również, jak rejestrować reakcje nityczne w połączeniach nerwowo-mięśniowych zarówno mięśni fazowych, jak i tonicznych. Techniki te mogą być wykorzystywane w studenckich laboratoriach śledczych do nauczania podstawowych pojęć i fizjologii. Techniki uzyskane w tym ćwiczeniu laboratoryjnym mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na pytania związane z innymi preparatami laboratoryjnymi, a także zastosowaniami fizjologicznymi związanymi z medycyną i zdrowiem.