Wspomagana komputerowo wizualizacja na dużą skalę i kwantyfikacja masy wysp trzustkowych, rozkładu wielkości i architektury

Ogólnym celem tej procedury jest zebranie bezstronnych, reprezentatywnych danych w ograniczonej próbce i precyzyjna analiza złożonej trójwymiarowej struktury tkanki. Osiąga się to poprzez uprzednie uchwycenie wirtualnych wycinków immunohisto, chemicznie zabarwionych odcinków trzustki. Następnie wirtualne wycinki są określane ilościowo za pomocą makra wirtualnego wycinka IHC w oprogramowaniu obrazu J, a dane są analizowane za pomocą skryptów napisanych dla Mathematica.

Następnie wykonywana jest rekonstrukcja 3D wirtualnych wycinków za pomocą Image J.Ostatnim krokiem procedury jest przechwycenie stosu pojedynczych obrazów wysepek za pomocą oprogramowania do książki slajdów i ręczne mapowanie stosów obrazów w trzech wymiarach za pomocą stereo investigator. Ostatecznie precyzyjną architekturę oczek ze współrzędnymi 3D dla każdej komórki oczka można uzyskać dzięki połączonej metodzie obrazowania 3D i ręcznego mapowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad otyłością i cukrzycą, takie jak to, jak warunki fizjologiczne i ścieżka fizjologicznych wpływają na trzustkę, masę komórek beta, rozkład oczek i architekturę.

Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę lub terapię otyłości i cukrzycy, ponieważ lepsze zrozumienie zmian w masie komórek beta ułatwi opracowanie i ocenę interwencji terapeutycznych. Chociaż metody opisane w niniejszym badaniu zapewniają wgląd w dynamiczną analizę immunohistochemiczną trzustki, można ją również zastosować do szeregu innych organizmów i tkanek. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy analizy wspomaganej komputerowo są trudne do nauczenia.

Ze względu na złożoność analizowania tak dużych zbiorów danych w dwóch i trzech wymiarach. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia czystego szkiełka przytrzymującego cały wycinek immunologicznej, chemicznie barwionej trzustki w uchwycie mikroskopu fluorescencyjnego. Otwórz oprogramowanie stereo investigator i zwizualizuj próbkę, klikając akwizycję.

A potem obraz na żywo. Określ poziomy ekspozycji dla każdego kanału za pomocą okna histogramu wideo, które wyświetla intensywność fluorescencji. W tym przykładzie kanał drugi jest używany dla DAP, kanał trzeci dla kanału GFP czwarty dla zapytania ofertowego, kanał piąty dla sci pięć i kanał szósty dla SCI siódmy.

Korzystając z okna ustawień aparatu, dostosuj poziom ekspozycji tak, aby intensywność fluorescencji została wyłączona. Na prawym końcu histogramu wideo obraz można ustawić ostrość za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu. Przed utworzeniem wirtualnego przekroju obrysuj próbkę, klikając na ekranie w punkcie oddalonym od próbki, który oznaczy punkt odniesienia.

Następnie kliknij wokół konturu próbki, gdy kontur jest gotowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Zamknij kontur, aby połączyć punkt początkowy i końcowy po zamknięciu konturu, przechwyć wirtualny wycinek dla próbki, wybierając opcję akwizycja, a następnie uzyskaj wirtualny plasterek. Gdy otworzą się opcje okna wirtualnego plasterka, wybierz opcję szybkiego pobierania, a także wyłączanie ręcznego.

Ustawianie ostrości poprzez odznaczenie pola obok opcji ręczny. Zapisz plik. Skalibruj prefo, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając dodaj do listy witryn fokusu.

Ręczne ustawianie ostrości na kilku losowych sekcjach w podglądzie wirtualnego plasterka Gdy kilka witryn zostanie aktywnych, uruchom wirtualny plasterek, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję. Rozpocznij wirtualny plasterek od prefo po zakończeniu wirtualnego wycinka dla pierwszej próbki, przełącz się na następny kanał i odpowiednio dostosuj ekspozycję. Procedura ta jest powtarzana dla każdego kanału w celu przeprowadzenia kwantyfikacji oczek, przetworzenia obrazów za pomocą makra obrazu J o nazwie I-H-C-V-S, które najpierw przygotowuje załadowane obrazy do analizy, a następnie określa ilościowo cechy oczek, takie jak skład komórkowy.

Makra I-H-C-V-S dzielą stos na odpowiednie kanały kolorów. Na obrazie J konwertuje każdy obraz na ośmiobitową maskę czarno-białą. Po automatycznej intensywności progowanie i arytmetycznie dodaje obrazy oddzielnych kanałów do maski kompozytowej.

Wbudowana analiza cząstek Image J na obrazie złożonym zidentyfikuje następnie obszary zainteresowania lub ROI, wykluczając cząstki mniejsze niż jedna komórka beta. Kwantyfikacja ROI. Użycie obrazu J powoduje utworzenie arkusza kalkulacyjnego z parametrami komórki.

Zapisz zagregowane wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel. Przechowywanie danych, takich jak okrągłość obwodu obszaru, średnica fer i środek oczka dla każdego oczka, wraz z odpowiadającymi im liczbami oznaczonymi na obrazie. Analizę obliczeniową tych parametrów można przeprowadzić zgodnie z opisem w pisemnym protokole Aby ujawnić informacje, w tym rozkład oczek i analizę częstotliwości, wykonaj rekonstrukcję 3D wirtualnych wycinków, uruchamiając skrypt, który konwertuje wszystkie dwa obrazy JP w katalogu na pliki TIF, które są formatem używanym do budowy i kwantyfikacji trójwymiarowych stosów z wirtualnych wycinków.

W tym przypadku używany jest skrypt o nazwie I MJ two two tiff. Skopiuj skrypt do katalogu, w którym znajdują się dwa obrazy JP. Uruchom skrypt z powłoką systemu Linux, wpisując ukośnik kropkowy I am JP dwa dwa TIFF w konsoli, a następnie naciskając enter.

Gdy wszystkie przechwycone obrazy zostaną przekonwertowane z plików JP two na TIFF, są gotowe do użycia do analizy na obrazie J. Korzystając z obrazu J, otwórz wszystkie obrazy dla pierwszej próbki, które w tym przypadku pochodzą z trzustki ludzkiego płodu i połącz je w jeden, wybierając obraz, kolor, , a następnie scal kanały. Powtórz ten proces dla każdej z próbek, gdy wszystkie próbki zostaną połączone jako pojedyncze obrazy. Wyczyść obrazy, zaznaczając niechciane regiony za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów.

Wypełnij je, wybierając pozycję edytuj, a następnie wypełnij. Przekonwertuj każdy obraz na obraz w kolorze RGB. Na koniec utwórz stos z obrazów, po czym można je jeszcze bardziej wyrównać za pomocą wtyczki stack reg.

Ostatecznie, połączenie kanałów i połączenie obrazów tworzy montaż 3D wszystkich oczek w całej trzustce. Aby zebrać stosy obrazów, umieść całe oczka trzustkowe pod mikroskopem. Zastosuj wodę, jeśli używasz soczewki obiektywu zanurzonego w wodzie.

Otwórz oprogramowanie skoroszytu slajdów, uzyskaj dostęp do sterowania przechwytywaniem i ostrością, naciskając Control plus Shift plus E w oknie sterowania ostrością. Ustaw obiektyw na 20 lub 40 razy w zależności od rozmiaru oczka. Aby użyć okularu mikroskopu do zlokalizowania oczek, ustaw pojemnik na dwa razy i ustaw zestaw filtrów na jeden użytkownika.

W oknie kontroli ostrości wybór emisji powinien być ustawiony na 100%Oczy w neutralnej gęstości powinny być ustawione na GFP ey jednym kliknięciem, a następnie otwórz podłogę, aby wyświetlić próbkę w zeszycie slajdów, wróć do okna kontroli ostrości i przełącz filtr na stały. Następnie kliknij G-F-P-D-S. Użyj joysticka, aby wyśrodkować oczko w aparacie o jedno okno tak dobrze, jak to możliwe.

Ustaw ostrość na głębokość gdzieś w pobliżu środka oczka, gdzie można łatwo dostrzec komórki. W oknie sterowania ostrością wybierz element zab. Użyj elementu sterującego zakresu, aby przewinąć do najwyższej głębokości oczka, w której można wyraźnie dostrzec obiekty, a następnie kliknij przycisk ustaw u góry.

Przewiń do dołu oczka i kliknij przycisk ustaw. U dołu kliknij przejdź. Aby powrócić do punktu odniesienia w oknie przechwytywania, kliknij zaawansowane, a następnie przełącz na tryb kanału.

Ustaw współczynnik kosza na dwa razy, a typ przechwytywania na 3D po prawej stronie okna, kliknij użyj górnej i dolnej pozycji i wróć do środkowej głośności po przechwyceniu. Ustaw rozmiar kroku na trzy. Ustaw zestaw filtrów tak, aby znajdował się poniżej pola zestawu filtrów.

Wybierz DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U i SCI pięć DSU. Dla każdego z nich kliknij przycisk znajdź najlepszy w obszarze Dostosuj ekspozycję. Następnie kliknij przycisk testuj, aby upewnić się, że wybrana ekspozycja jest odpowiednia.

Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć przechwytywanie. Po zakończeniu przechwytywania dostosuj poziomy zgodnie z potrzebami i zmień wyświetlany kolor zapytania ofertowego na biały. Zapisz slajd i przejdź do widoku eksportu serii TIFF.

Wpisz nazwę slajdu z myślnikiem na końcu i zapisz go. Tworzone są dziesiątki pojedynczych plików TIF, więc pomocne może być przechowywanie stosu obrazów każdego oczka w osobnym folderze. Aby zmapować stosy obrazów, otwórz oprogramowanie stereo investigator.

Wizualizuj obraz, otwierając stosy obrazów w menu skalowania obrazu. Ustaw odległość między obrazami na trzy mikrony, aby skorygować dwukrotne zginanie. W skoroszycie slajdów wybierz opcję Zastąp skalowanie X i Y i użyj określonego źródła skalowania x i Y.

Wprowadź 0,65 zarówno dla środka X, jak i Y i powiększ obraz, klikając przycisk powiększenia, a następnie w środku interesujących nas ilis w oknie makro rynek co najmniej jedną komórkę. Używając odpowiedniego markera, komórki beta będą wyglądać na zielone. Komórki alfa będą czerwone, a komórki delta będą białe.

Zaznacz komórki w środku ich jądra, które będą niebieskie, jeśli próbka została wybarwiona DPI, użyj znacznika drugiego, aby oznaczyć komórki beta. Znacznik piąty, aby oznaczyć komórki alfa, i znacznik szósty, aby oznaczyć komórki delta. Po zaznaczeniu co najmniej jednej komórki wyświetl widok ortogonalny za pomocą ikony w górnym menu, zaznacz filtr Z i symetryczny.

Zakres powinien być ustawiony na 15.00. Zaczynając od 0.0 Z.Przewijaj oczka za pomocą kółka myszy i zaznacz każdą komórkę odpowiednim markerem, zaznacz każdą komórkę tylko raz na środku jej głębokości. Po zakończeniu oznaczania każdego z poziomów Z pole wyboru filtra Z można odznaczyć.

Spowoduje to wyświetlenie wszystkich znaczników ze wszystkich poziomów Z. Gdy każda komórka zostanie zaznaczona, zapisz plik jako plik DAT. Następnie przejdź do śledzenia eksportu plików.

Zapisz śledzenie jako plik TXT. Na koniec kliknij nowy plik danych, aby wyczyścić obszar roboczy przed próbą zmapowania nowych oczek. Przygotowanie wirtualnych wycinków z immunohistochemicznie wybarwionej próbki trzustki pozwala na badanie komórek endokrynnych alfa, beta i delta w całej trzustce razem, ponieważ immunohistochemiczne barwienie wysp trzustkowych na insulinę można zobaczyć na zielono, glukagon na czerwono, somatostatynę na biało i dap na niebiesko.

Obrazy zostały następnie przekonwertowane na maskę ośmiobitową po automatycznym progowaniu. W tym miejscu pokazano scalanie obrazu złożonego. Jednak dystrybucja oczek za pomocą wirtualnego wycinka umożliwia również indywidualną analizę w oddzielnych kanałach.

Tutaj pokazane są widoki każdego kanału, aby ujawnić komórki delta, komórki beta i komórki alfa. Analiza cząstek z przeprowadzoną maską kompozytową pokazującą strukturę każdego oczka ponumerowaną i podświetloną na niebiesko. Analiza cząstek masek kompozytowych jest wyprowadzana jako tabela danych zawierająca takie parametry, jak okrągłość obwodu obszaru Islas i różne średnice dla każdego wykrytego oczka, które mają identyfikatory odpowiadające ponumerowanym znacznikom na masce kompozytowej.

Wielkoskalowa analiza tych obrazów prowadzi do stworzenia histogramów całkowitej liczby oczek i rozkładu wielkości, a także szczegółowych porównań obszarów komórek alfa, beta i delta. Mapowanie oczek i matematyczna analiza składu i architektury komórkowej mogą ujawnić pojedynczą płaszczyznę ogniskową ze zrekonstruowanego w 3D stosu obrazów ludzkich oczek przesłanych do stereo investigator. Tutaj komórki beta są w zielonych komórkach alfa, w czerwonych komórkach delta w kolorze białym, a jądra w kolorze niebieskim.

Po uchwyceniu wyraźnych oczek, komórki alfa, beta i delta są tutaj oznaczane na różnych płaszczyznach morskich, obrazy fluorescencyjne i odpowiednie dane map są wyświetlane dla trzech różnych płaszczyzn ogniskowych w odstępie 10 mikronów. Po oznaczeniu komórek alfa, beta i delta w różnych płaszczyznach, oczko można zwizualizować w 3D. Na zdjęciu przedstawiono rekonstrukcję 3D ćwiartki oczka na podstawie współrzędnych uzyskanych za pomocą mapowania oczkowego.

Co więcej, zautomatyzowana analiza matematyczna zmapowanych oczek może wyświetlić skład i architekturę komórkową. Tutaj pokazano względną częstość odległości komórek komórkowych między dwiema komórkami w pojedynczej populacji komórek. Pokazano również względną częstość odległości komórek między dwiema różnymi populacjami komórek.

Pokazano również skumulowane prawdopodobieństwa rozkładów odległości między komórkami dla komórek alfa do alfa, beta do beta i delta do delta. Na tych prawdopodobieństwach można przeprowadzić test cole OV, smirnov lub KS, aby uzyskać odpowiednie odległości KS. Po opanowaniu obrazowania na dużą skalę i analizy całego wycinka tkanki można wykonać w ciągu czterech godzin.

Rekonstrukcję 3D bloku tkanki można wykonać w 30 minut. Wreszcie, obrazowanie 3D i ręczne mapowanie można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Podejmując się tej procedury, ważne jest, aby zacząć od wysokiej jakości barwienia immunohistochemicznego skrawków.

Dokładność późniejszej analizy będzie zależeć od surowych danych. Upewnij się również, że Twoje komputery mają co najmniej osiem gigabajtów pamięci RAM do przetwarzania analizy na tak dużą skalę po jej opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom, nie tylko w dziedzinie otyłości i cukrzycy, ale szeroko w wielu innych dziedzinach, które wykorzystują standardową analizę patologiczną.

Może to być szczególnie przydatne, gdy dostępność próbek jest ograniczona. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać bezstronne reprezentatywne dane w ograniczonej próbie przy użyciu standardowych technik. Wybór tylko określonego regionu może nie być reprezentatywny dla całego obrazu, jak wykazaliśmy za pomocą naszego badania rozkładu oczek trzustki.