Name: Fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna charakterystyka neuronów modulowanych przez ruch (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę rejestracji odpowiedzi fizjologicznej pojedynczych neuronów ssaków podczas ruchu. Technika łączy elektrofizjologię, immunochemię i analizę morfologiczną, zachowując naturalne połączenia synaptyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję Anthony'emu Taylorowi za wstępne szkolenie z zakresu rejestracji wewnątrzkomórkowej in vivo oraz A. Brown i Davidowi Maxwellowi za pomoc w początkowym opracowaniu techniki barwienia wewnątrzkomórkowego. Dziękuję M. Silver za pomoc w przygotowaniu makra do kolokalizacji. Wiele osób, z którymi współpracowałem, przyczyniło się do rozwoju tej techniki, w tym R. Donga, M. Moritani, P. Luo oraz R. Ambalavanar. Technika ta została opracowana przy znacznym wsparciu z grantów NIH DE10132, DE15386 oraz RR017971.

1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
<li>Zanurzyć szczura w znieczuleniu za pomocą pentobarbitalu sodu (50mg/kg IP) i umieścić na podkładce grzewczej. Wygolić skórę nad tylną częścią czaszki za pomocą maszynki do strzyżenia zwierząt. Sprawdzić, czy zwierzę osiągnęło poziom znieczulenia chirurgicznego, testując brak odruchu wycofania i wokalizacji przy ucisku palców stopy, a także brak odruchu powiekowego. Kontrolować poziom znieczulenia co 15 minut i utrzymywać poziom chirurgiczny poprzez wstrzykiwanie pentobarbitalu sodu w dawce 15mg/kg co 45 minut.</li>
<li>Stosując technikę aseptyczną, wykonać nacięcie w regionie pachwinowym, tuż za fałdem utworzonym przez brzuch i wewnętrzną stronę uda, a następnie wprowadzić kaniulę (średnica 1mm, Clay Adams) do żyły udowej oraz tętnicy udowej. Wykonać nacięcie w linii pośrodkowej w regionie podżuchwowym i odsunąć mięśnie podjęzykowe. Wykonać małe nacięcie w tchawicy i wprowadzić kaniulę (średnica 2mm), aby umożliwić wentylację. Przywiązać szew wokół kaniuli tchawiczej, aby zabezpieczyć ją na miejscu. Monitorować systemowe ciśnienie skurczowe i rozkurczowe krwi za pomocą kaniuli tętniczej. Oprócz monitorowania odruchu wycofania i powiekowego, monitorować teraz ciśnienie krwi w celu oceny poziomu znieczulenia. W razie potrzeby podawać dodatkowe środki znieczulające za pomocą kaniuli żylnej.</li> 
<li>Umieścić szczura w aparacie stereotaktycznym i przeprowadzić kraniotomię w celu odsłonięcia móżdżku. Podłączyć kaniulę tchawiczą do wentylatora dla gryzoni. Wentylować zwierzę objętością 2 cm3 z częstotliwością 100/min wilgotnym powietrzem. Należy utrzymać dodatnie ciśnienie końcowowydechowe 1 cm H2O, aby zapobiec zapadnięciu się płuc. Co 15 minut przeprowadzać hiperwentylację płuc, aby zapobiec niedodmie. Następnie pokryć powierzchnię mózgu ogrzanym olejem mineralnym (30°C). Należy uważać, aby nie uszkodzić dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.</li>
<li>Nanieść klej cyjanoakrylanowy na pręt połączony z wibratorem elektromagnetycznym i przymocować pręt w diastemie żuchwy. Poruszać żuchwą, przesyłając sygnały sterujące do wibratora z wyjścia komputera A/D lub generatora sygnałowego.</li>
<li>Umieścić srebrno-chlorkową elektrodę uziemiającą pod skórą w sąsiedztwie miejsca kraniotomii.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrod
<ol>
<li>Wytworzyć mikroelektrody z kwarcu lub szkła glino-krzemianowego, używając poziomego wyciągacza mikroelektrod.</li>
<li>Napełnić mikroelektrodę 5-10% biotynamidą rozpuszczoną w 0,25M KCl i buforze 0,5M Tris HCl (pH 7,6) lub 2% tetrametylorodaminą w soli fizjologicznej (pH 6). Sprawdzić impedancję elektrody za pomocą testera elektrod. Do rejestracji z aksonów o dużej średnicy wykonać elektrody o impedancji 60-80M Ω, a dla małych aksonów i interneuronów elektrody o impedancji 80-150MΩ.</li>
<li>Umieścić mikroelektrodę w głowicy wzmacniacza elektrometru. Wizualizować elektrodę za pomocą małego teleskopu (20X z wbudowanym siatkowym celownikiem), który jest zamocowany za głową zwierzęcia. Użycie teleskopu jest istotne, ponieważ umożliwia stereotaktyczne pozycjonowanie elektrod z dużą precyzją.</li>
</ol>
3. Rejestracja elektrofizjologiczna i barwienie wewnątrzkomórkowe
<ol>
<li>Wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej i zastosuj nadkompensację sprzężenia pojemnościowego, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Pozwala to na precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu.</li>
<li>Wykonywanie powtarzalnych przemieszczeń żuchwy i wprowadzanie elektrody do mózgu za pomocą silnika krokowego.</li>
<li>Rozpoznawanie przebicia neuronów po nagłych spadkach potencjału DC oraz identyfikacja przebić wewnątrzsomatycznych po trwającej aktywności synaptycznej. „Buczenie” elektrody przy nadkompensacji pojemności lub opukiwanie rzadko prowadzą do skutecznej penetracji komórki. Ze względu na wysoką impedancję elektrod, odpowiedzi neuronowe są rzadko obserwowane przed penetracją.</li>
<li>Po przebiciu neuronu i uznaniu penetracji za stabilną, scharakteryzuj odpowiedź neuronową, stosując ruchy żuchwy typu ramp and hold oraz sinusoidalne.5 Zmapuj pole recepcyjne neuronu, badając skórę wokół głowy i jamę ustną za pomocą nieprzewodzącej sondy, np. drewnianego patyczka. Jeśli jest to istotne dla badania, sprawdź odpowiedź neuronu na inne funkcjonalnie istotne bodźce, takie jak skurcz mięśni i bodźce nocycepcyjne.6 Pierwotne nocyceptywne receptory neuronowe reagują na bodźce nocycepcyjne. Środki znieczulające ogólne, takie jak pentobarbital sodu, nie blokują przewodzenia aksonalnego w pierwotnych neuronach aferentnych, lecz hamują przekaźnictwo synaptyczne. W związku z tym przewodzenie aksonalne w aksonie pierwotnego neuronu aferentnego zostaje zachowane.</li>
<li>Wstrzyknij prąd (DC, 1-4nA) przez całkowity czas wstrzykiwania wynoszący 15-70nA minut. Monitoruj penetrację elektrody podczas wstrzykiwania prądu i przerwij proces, jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż -30mV.</li>
</ol>
4. Obróbka tkanek
<ol>
<li>Uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie pentobarbitalu (140mg/kg IV) i przeprowadź perfuzję przy użyciu płynu płuczącego naczynia (0,9% NaCl 38°C zawierający 500 jednostek heparyny i 1ml 2% ksylokainy), a następnie 4% paraformaldehydu w 0,1M buforze fosforanowym (pH 7,4).</li>
<li>Wyjmij mózg i wykonaj przekroje o grubości 50-100μm za pomocą wibratomu w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej. Przekroje zbiera się metodą wolnopływającą w PBS 25°C.</li>
<li>Przygotuj mózg do barwienia DAB, inkubując go w 1-2% normalnym surowicy koziej i 1% Triton X-100 w 0,01M PBS, a następnie inkubując w kompleksie awidyna-biotyna (1:50 Elite Vectastain). Przebarw przekroje za pomocą nikiel-DAB z H2O2. Aby przygotować próbki do barwienia Texas Red, inkubuj przekroje w kompleksie awidyna-biotyna (1:50) w PBS przez noc w 4°C, a następnie inkubuj w 4% Texas Red avidin DCS w PBST przez noc w 4°C. Przebarw przekroje fluorescencyjnym barwnikiem Nissla (NeuroTrace) przez 20min w 23°C.</li>
<li>Jeśli neuron został wstrzyknięty rodaminą, zwizualizuj wstrzyknięty neuron bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Ex 545nm).</li>
</ol>
5. Połączenie metody z markowaniem retrogradnym, immunocytochemią, obrazowaniem konfokalnym oraz ilościową analizą kolokalizacji
Sukces połączenia tej techniki z innymi metodami zależy w dużej mierze od prawidłowego znakowania wewnątrzkomórkowego.
<ol>
<li>Metoda tutaj zaprezentowana może zostać łatwo połączona z retrogradowym znakowaniem neuronów.7-10 W tym celu należy znieczulić zwierzę i, stosując technikę aseptyczną, wstrzyknąć znacznik neuronalny, taki jak peroksydazy chrzanowej (20% horseradish peroxidase. Sigma VI, Sigma) oraz 1% aglutynowanej zarodkami pszenicy peroksydazy chrzanowej (Sigma), do obwodowych obszarów docelowych, np. mięśnia żwacza. Znacznik neuronalny zostanie pobrany do aksonów obwodowych i przetransportowany drogą aksonalną do ciał motoneuronów. W przypadku mięśnia żwacza, 15μl znacznika wstrzykuje się do mięśnia za pomocą sterylnej mikrosstrzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie zwierzęta umieszcza się na macie grzewczej i monitoruje do momentu wybudzenia z narkozy, po czym przenosi się je do klatek w celu rekonwalescencji. Po 24h należy znieczulić zwierzęta, przeprowadzić fizjologiczną charakterystykę neuronów i zabarwić je wewnątrzkomórkowo. Następnie perfunduje się zwierzę zgodnie z powyższym opisem i przetwarza skrawki tkankowe w celu wykrycia HRP, używając tetrametylobenzydyny (TMB) jako chromogenu i tungstenu sodu jako stabilizatora, z intensyfikacją kobaltem. Skrawki umieszcza się w 1% tungstanie sodu rozpuszczonym w 0.1M PBS (pH 6.5) oraz 0.0007% TMB rozpuszczonym w absolutnym etanolu i acetonie w temperaturze 15°C przez 20 min. Następnie przeprowadza się reakcję skrawków tkankowych, dodając 1.0 ml 0.3% H2O2 na 100ml roztworu inkubacyjnego przez 60 min. Tkankę płucze się w 0.1M PBS (pH 6.5) i umieszcza w 0.05% diaminobenzydynie (pH 7.4), 0.02% kobalcie i 0.01% H2O2 w 0.1M PBS (pH 7.4) przez 10 min. w 37°C. Tkankę przetwarza się w celu wizualizacji neuronu wstrzykniętego z biotinamidą zgodnie z opisem, a następnie analizuje relacje między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi motoneuronami.</li>
<li>Przedstawiona technika może być również łatwo łączona z immunocytochemią.6 Przykładowo, należy przetworzyć immunocytochemicznie mózg pod kątem obecności synaptofizyny, aby dokładnie zlokalizować synapsy wewnątrz znakowanych neuronów (Ryc. 3). W tym celu skrawki mózgu inkubuje się w przeciwciałach mysich przeciwko synaptofizynie (1:10,000) przez 2 dni w 4°C, a następnie inkubuje się w przeciwciałach antymysich FITC (1:400) przez 1h w 23°C.</li> 
<li>Neurony znakowane markerami fluorescencyjnymi lub przygotowane do obrazowania fluorescencyjnego idealnie nadają się do obrazowania konfokalnego. Rycina 3 przedstawia przykład przekroju optycznego uzyskanego za pomocą mikroskopii konfokalnej przez buton aksonalny (Ryc. 3). Animacje znakowanych neuronów generuje się poprzez wykonanie wielu przekrojów optycznych przez znakowany neuron (Ryc. 4).</li>
<li>Neurony znakowane tą metodą mogą być wykorzystane do ilościowej analizy kolokalizacji. W tym celu należy użyć publicznie dostępnego makra oprogramowania w połączeniu z NIH Image (dostępnym pod adresem http://phy.ucsf.edu/°idl/colocalization.htm). Lokalizację synaptofizyny w pojedynczych terminalach aksonalnych wyznacza się poprzez połączenie znakowania wewnątrzkomórkowego z immunocytochemią synaptofizyny.6</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Przegląd reprezentatywnych wyników, jakie można uzyskać za pomocą tej metody, przedstawiono na Rysunku 1. Ten pojedynczy neuron pnia mózgu był rejestrowany elektrofizjologicznie podczas ruchu żuchwy i, jak wyraźnie widać, odpowiedź tego neuronu (Rysunek 1 dół po lewej, jasnoniebieski) była modulowana podczas ruchu. Po charakterystyce elektrofizjologicznej do neuronu wstrzyknięto biotynamid, a następnie poddano go obróbce w celu wizualizacji. Zrekonstruowany neuron (Rysunek 1 środek, zielony) można odnieść do punktu orientacyjnego w anatomii, w tym przypadku do zaznaczonego jądra ruchowego nerwu trójdzielnego (czerwona obramowanie). Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu oraz rekonstrukcji neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecionka mięśniowego. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny przykład odpowiedzi fizjologicznej neuronu podczas przemieszczania żuchwy. Odpowiedź neuronu jest przedstawiona jako chwilowa częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź neuronalna ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron dostarcza sprzężenia zwrotnego sensorycznego związanego z pozycją żuchwy. Rysunek 3 to obraz w dużym powiększeniu aksonu barwionego wewnątrzkomórkowo, połączony z barwieniem na synaptofizynę oraz barwieniem Nissla. Zwróć uwagę na kolokalizację synaptofizyny (żółty) w obrębie pączka aksonalnego. Rysunek 4 to animacja pojedynczego, scharakteryzowanego fizjologicznie i znakowanego wewnątrzkomórkowo neuronu.
<img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="Schemat sieci neuronowej z wykresem oscylacji, przedstawiający złożone mapowanie i ścieżki sygnałowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przegląd metody. Góra po lewej: przemieszczenie żuchwy. Środek: rejestracja wewnątrzkomórkowa (zielony) z pojedynczego neuronu (żółty). Morfologia tego neuronu została zrekonstruowana po rejestracji wewnątrzkomórkowej i iniekcji. Czerwony obrys wskazuje położenie jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Dół po lewej: odpowiedź fizjologiczna tego neuronu podczas ruchu żuchwy.
<img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="Wykres ruchu żuchwy i częstotliwości impulsów; schemat przedstawiający liczbę impulsów na sekundę w funkcji cykli otwierania żuchwy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Reprezentatywna odpowiedź fizjologiczna pojedynczego neuronu sensorycznego mięśnia zarejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Zwróć uwagę na podobieństwo odpowiedzi neuronalnej do przemieszczenia żuchwy.
<img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; struktury komórkowe w kolorze czerwonym i zielonym; powiększenie; skala 5μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Końcowe rozgałęzienie aksonalne z przysynaptycznymi guzkami (czerwone wybrzuszenia) neuronu sensorycznego barwionego wewnątrzkomórkowo, który zareagował podczas stymulacji mięśnia. Następująca po tym obróbka immunocytochemiczna w kierunku synaptofizyny wykazuje lokalizację synaptofizyny w obrębie guzka aksonalnego (żółty). Kolor zielony oznacza fluorescencyjne barwienie Nissla.
Rysunek 4. Animacja aksonu pierwotnego neuronu aferentnego wrzecionka mięśniowego, którego odpowiedź fizjologiczna była rejestrowana in vivo podczas ruchu żuchwy. Akson został następnie zabarwiony wewnątrzkomórkowo i poddany obróbce w celu wizualizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">Pobierz film w wysokiej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2650/medres.mov">Pobierz film w średniej rozdzielczości do Rysunku 4 tutaj</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
<li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li>
<li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li>
<li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li>
<li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat%3A+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li>
<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (publikacja NIH nr 86-23, wersja z 1985 r.) oraz przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Maryland.

Przedstawiona tutaj metoda jest potężną techniką, która dostarcza istotnych informacji na temat funkcji pojedynczych neuronów oraz tego, w jaki sposób odpowiedź poszczególnych neuronów wpływa na obwody neuronalne.9 Wiedza ta jest fundamentalna dla zrozumienia funkcji sensoryczno-motorycznych. Największą zaletą tej techniki jest możliwość określenia wielu parametrów neuronu, w tym jego fizjologii, morfologii oraz morfologii i rozmieszczenia synaps. W połączeniu z innymi technikami, takimi jak wsteczna znakowani...

<table><tbody><tr><td>wibrator elektromagnetyczny</td><td>Ling Dynamic Systems</td><td>V101</td><td></td></tr><tr><td>generator sygnałów</td><td>Feedback Systems</td><td>PFG605</td><td>zdolny do generowania trapezoidalnego sygnału wyjściowego</td></tr><tr><td>szkło elektrodowe</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>AF100-68-10</td><td>z włóknem</td></tr><tr><td>wyciągacz elektrod</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-2000 lub P-80</td><td></td></tr><tr><td>biotinamid</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1120</td><td>przechowywany w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Texas Red avidin DCS</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>tetrametylorodamina</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D-3308</td><td>masa cząsteczkowa 3000, z możliwością wiązania do lizyny</td></tr><tr><td>przeciwciało mysie anty-synaptofizyna</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5258</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjny barwnik Nissla</td><td>Neurotrace, Life Technologies</td><td>N-21480</td><td></td></tr><tr><td>tester elektrod</td><td>Winston Electronics</td><td>BL-1000-B</td><td>do pomiaru impedancji elektrod</td></tr><tr><td>elektrometr</td><td>Axon Instruments</td><td>Axoprobe 1A, Axoclamp 2B</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Rola poszczególnych neuronów oraz ich funkcja w obwodach neuronalnych są kluczowe dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych funkcji sensorycznych i motorycznych. Większość badań nad mechanizmami sensoromotorycznymi opiera się albo na badaniu neuronów w stanie spoczynku zwierzęcia1,2, albo na rejestracji pozakomórkowej aktywności neuronalnej podczas ruchu.3,4 Choć badania te dostarczyły fundamentalnych podstaw wiedzy o funkcji sensoromotorycznej, nie oceniają one informacji funkcjonalnych pojawiających się podczas ruchu lub mają ograniczone możliwości pełnej charakterystyki anatomii, fizjologii i fenotypu neurochemicznego neuronu. Zaprezentowana tutaj technika umożliwia rozległą charakterystykę poszczególnych neuronów podczas ruchu in vivo. Metoda ta może być wykorzystana nie tylko do badania pierwotnych neuronów doprowadzających, ale także do charakterystyki motoneuronów i sensoromotorycznych interneuronów. Początkowo odpowiedź pojedynczego neuronu jest rejestrowana za pomocą metod elektrofizjologicznych podczas różnych ruchów żuchwy, po czym następuje wyznaczenie pola recepcyjnego danego neuronu. Następnie do neuronu wstrzykuje się wewnątrzkomórkowo marker neuronalny, a mózg jest przetwarzany w taki sposób, aby neuron mógł zostać zwizualizowany za pomocą mikroskopii świetlnej, elektronowej lub konfokalnej (Ryc. 1). Następnie rekonstruowana jest szczegółowa morfologia scharakteryzowanego neuronu, co pozwala na skorelowanie morfologii neuronalnej z odpowiedzią fizjologiczną neuronu (Ryc. 2,3). W niniejszym opracowaniu przedstawiono kluczowe szczegóły i wskazówki niezbędne do skutecznego wdrożenia tej techniki. Dzięki połączeniu tej metody z innymi technikami można uzyskać cenne dodatkowe informacje o badanym neuronie. Markerowanie neuronalne wsteczne może być wykorzystane do zidentyfikowania neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron, co pozwala na szczegółowe określenie obwodów neuronalnych. Metodę tę można połączyć z immunocytochemią w celu zbadania neuroprzekaźników w znakowanym neuronie oraz określenia fenotypów chemicznych neuronów, z którymi synapsuje znakowany neuron. Znakowany neuron może być również przygotowany do mikroskopii elektronowej w celu określenia cech ultrastrukturalnych i mikroobwodów danego neuronu. Podsumowując, technika ta jest potężną metodą dokładnej charakterystyki neuronów podczas ruchu in vivo, co pozwala na uzyskanie istotnych informacji o roli neuronu w funkcji sensoromotorycznej.

Opisano technikę pozwalającą na ilościowe określenie odpowiedzi fizjologicznej neuronów ssaków in vivo podczas ruchu oraz korelację fizjologii neuronu z jego morfologią, fenotypem neurochemicznym i mikroobwodami synaptycznymi.

Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Rola poszczególnych neuronów oraz ich funkcja w obwodach neuronalnych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych procesów sensorycznych i motorycznych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi fizjologicznej pojedynczych neuronów podczas ruchu oraz dalsza charakterystyka morfologii i neurochemii tych neuronów. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie i chirurgiczne przygotowanie zwierzęcia. Kolejnym krokiem jest elektrofizjologiczna rejestracja odpowiedzi wewnątrzkomórkowej pojedynczych neuronów podczas ruchu.Po perfuzji zwierzęcia i opracowaniu mózgu ostatnim krokiem jest wizualizacja i analiza odpowiedzi fizjologicznej oraz morfologii neuronów. Ostatecznie techniki wewnątrzkomórkowej rejestracji neuronalnej, immunochemii i analizy łączą się, aby wykazać modulacje potencjału błonowego pojedynczych neuronów podczas ruchu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak hodowle komórkowe, jest zachowanie połączeń neuronalnych i wkładów synaptycznych, a neurony nie są autotomizowane ani umieszczane w sztucznych mediach. Dzień przed eksperymentem w obwodowe obszary docelowe wstrzykuje się znacznik neuronalny, taki jak peroksydaza chrzanowa, w celu retrogradnego znakowania neuronów ruchowych.Następnego dnia znieczul szczura i umieść go na podgrzewaczce, a następnie za pomocą strzygaczki do zwierząt i stosując technikę aseptyczną, ogol skórę nad tylną częścią czaszki. Wykonaj nacięcie wzdłuż wewnętrznej strony uda i wprowadź kaniulę do żyły udowej w celu podawania dodatkowej anestezji. Wprowadź drugą kaniulę do tętnicy udowej, aby monitorować ciśnienie krwi.Na koniec wprowadź kaniulę do tchawicy. Następnie umieść szczura w aparacie stereotaksycznym. Wykonaj kraniotomię, aby odsłonić móżdżek, uważając, by nie uszkodzić dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.Następnie pokryj powierzchnię mózgu podgrzanym olejem mineralnym. Teraz przyklej żuchwę do pręta połączonego z wibratorem elektromagnetycznym. Ruch żuchwy jest kontrolowany za pomocą sygnałów sterujących przesyłanych do wibratora z generatora sygnałowego.Następnie umieść elektrodę uziemiającą pod skórą w sąsiedztwie kraniotomii. Aby przygotować elektrody wewnątrzkomórkowe, napełnij mikroelektrody roztworem barwnika IDE lub tetraetylowego rodaminy. Impedancja elektrody wynosi od 60 do 80 megaomów dla aksonów o dużym przekroju oraz od 80 do 150 megaomów dla małych aksonów doprowadzających i neuronów pośredniczących.Następnie należy wprowadzić mikroelektrodę do głowicy elektrometru, korzystając z małego teleskopu przymocowanego w stałej pozycji za głową zwierzęcia. Mikroelektrodę należy obserwować przez dołączony okular 20x teleskopu. Obszar docelowy znajduje się około 0,5 milimetra przyśrodkowo od dolnej krawędzi wzgórza dolnego.Następnie wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej, aby umożliwić precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu. Zwiększ czułość sprzężenia zwrotnego pojemnościowego w taki sposób, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Przesuwaj elektrodę, aż wniknie ona w głąb mózgu.Kolejnym krokiem jest aktywacja powtarzalnego przemieszczania żuchwy. Następnie, przy użyciu silnika krokowego, wprowadź elektrodę do mózgu. Gdy nagły spadek potencjału dc oraz trwająca aktywność synaptyczna wskażą na przebicie neuronu, przerwij wprowadzanie elektrody.Gdy penetracja zostanie uznana za stabilną, należy rozpocząć ruchy szczęk w trybie ramp and hold oraz sinusoidalne. Należy zarejestrować odpowiedź neuronalną i scharakteryzować neuron na podstawie tej odpowiedzi. Następnie, aby zmapować pole recepcyjne neuronu, należy użyć tępej sondy do zbadania skóry wokół głowy oraz jamy ustnej.Zbadaj odpowiedź neuronu na inne bodźce, takie jak skurcz mięśnia lub bodźce nocyceptywne. Po zakończeniu rejestracji wstrzyknij prąd stały (DC) o natężeniu od 1 do 4 nA, aby uzyskać całkowitą dawkę ładunku od 15 do 70 nA·min. Monitoruj penetrację elektrody i przerwij wstrzykiwanie prądu.Jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż minus 30 millivolts, następnym krokiem jest wykonanie skrawków tkanki mózgowej. Po uśpieniu i perfuzji zwierzęcia należy wyciąć mózg. Następnie wykonać skrawki o grubości od 50 do 100 micron w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej.Aby zwizualizować relację między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi neuronami ruchowymi, należy poddać tkankę obróbce metodą H-R-P-D-A-B lub Texas red, w zależności od rodzaju tkanki; dodatkowe analizy można przeprowadzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego albo przy użyciu oprogramowania do ilościowej kolokalizacji. W razie potrzeby można przeprowadzić obróbkę immunochemiczną na synaptofizynę, aby dokładnie zlokalizować synapsy w znakowanych neuronach. Na tej rycinie przedstawiono neuron pnia mózgu, do którego wstrzyknięto IDE po charakterystyce elektrofizjologicznej.Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu, neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecionka mięśniowego. Brązowa obrysowka wskazuje położenie jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Rysunek ten przedstawia odpowiedź fizjologiczną neuronu sensorycznego podczas przemieszczania żuchwy.Odpowiedź neuronu przedstawiono jako chwilową częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź ta ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron dostarcza informacji zwrotnych sensorycznych związanych z pozycją żuchwy. Rysunek przedstawia neuron sensoryczny, który reagował podczas sondowania mięśni.Neuron zabarwiono ide po przeprowadzeniu obróbki immunochemicznej. Przystawki synaptyczne, widoczne jako czerwone zgrubienia, współwystępują z żółtą synaptofizyną. Kolor zielony oznacza fluorescencyjne barwienie markerowe.Rysunek ten przedstawia animację aksonu pierwotnego neuronu aferentnego wrzeciona mięśniowego. Do stworzenia animacji wykorzystano wiele przekrojów optycznych znakowanego neuronu. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak elektromikroskopia, mikroskopia konfokalna oraz znakowanie neuronów w kierunku przednim lub wstecznym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki ultrastrukturalnej neuronu, kolokalizacji neuroprzekaźników z pączkami synaptycznymi oraz połączeń neuronalnych.

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Morfogeneza i migracja neuronów są kluczowymi wydarzeniami leżącymi u podstaw prawidłowego rozwoju mózgu. W tym miejscu opisujemy metody genetycznej manipulacji hodowanymi neuronami ziarnistymi móżdżku i rozwijającym się móżdżkiem w celu oceny morfologii i cech migracyjnych neuronów.

Manipulacja genetyczna neuronów ziarnistych móżdżku in vitro i in vivo w celu zbadania morfologii i migracji neuronów

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Ten protokół oferuje digitalizację części tradycyjnych zadań klinicznych, powszechnie używanych do pomiaru funkcji poznawczych i kontroli motorycznej w chorobie Parkinsona. Zadania kliniczne są digitalizowane, a rytmy biofizyczne są rejestrowane na różnych poziomach funkcjonalnych układu nerwowego, od dobrowolnego, spontanicznego, automatycznego do autonomicznego.

Dynamiczne cyfrowe biomarkery funkcji motorycznych i poznawczych w chorobie Parkinsona

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Monitorowanie ruchów gałek ocznych (lub eyetracking) pozwala określić, w których obszarach przestrzeni wzrok zatrzymuje się, kiedy i na jak długo. W niniejszym materiale demonstrujemy, w jaki sposób eyetracking może być wykorzystany do badania sprawności pamięci w wielu grupach uczestników, bez konieczności uzyskiwania raportów werbalnych lub innych form jawnych odpowiedzi.

Monitorowanie ruchów gałek ocznych w badaniach pamięci

Wpływ stanu nieważkości oraz hipergrawitacji na procesy hemodynamiczne i elektrofizjologiczne w mózgu zostanie zbadany podczas lotu parabolicznego z wykorzystaniem technik EEG i NIRS. Jest to studium wykonalności bardziej złożonego eksperymentu, którego przeprowadzenie planowane jest podczas średnio- i długoterminowych lotów kosmicznych.

Koherencja między funkcjami kory mózgowej a wydajnością neuropoznawczą w warunkach zmiennej grawitacji

W niniejszym opracowaniu opisujemy szybką, niezawodną i prostą procedurę określania najniższej temperatury, przy której szczury lub myszy wykazują zachowania nocyfencyjne, t. j. na próg termicznej nocycepcji (TNT). Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny, co pozwala na precyzyjną i powtarzalną ocenę TNT przy minimalnym lub żadnym stresie dla zwierząt.

Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Poznaj metodę rejestracji odpowiedzi fizjologicznej pojedynczych neuronów ssaków podczas ruchu. Technika łączy elektrofizjologię, immunochemię i analizę morfologiczną, zachowując naturalne połączenia synaptyczne.

Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Przeglądaj więcej filmów