Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi fizjologicznej pojedynczych neuronów podczas ruchu oraz dalsza charakterystyka morfologii i neurochemii tych neuronów. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie i chirurgiczne przygotowanie zwierzęcia. Kolejnym krokiem jest elektrofizjologiczna rejestracja odpowiedzi wewnątrzkomórkowej pojedynczych neuronów podczas ruchu.

Po perfuzji zwierzęcia i opracowaniu mózgu ostatnim krokiem jest wizualizacja i analiza odpowiedzi fizjologicznej oraz morfologii neuronów. Ostatecznie techniki wewnątrzkomórkowej rejestracji neuronalnej, immunochemii i analizy łączą się, aby wykazać modulacje potencjału błonowego pojedynczych neuronów podczas ruchu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak hodowle komórkowe, jest zachowanie połączeń neuronalnych i wkładów synaptycznych, a neurony nie są autotomizowane ani umieszczane w sztucznych mediach. Dzień przed eksperymentem w obwodowe obszary docelowe wstrzykuje się znacznik neuronalny, taki jak peroksydaza chrzanowa, w celu retrogradnego znakowania neuronów ruchowych.

Następnego dnia znieczul szczura i umieść go na podgrzewaczce, a następnie za pomocą strzygaczki do zwierząt i stosując technikę aseptyczną, ogol skórę nad tylną częścią czaszki. Wykonaj nacięcie wzdłuż wewnętrznej strony uda i wprowadź kaniulę do żyły udowej w celu podawania dodatkowej anestezji. Wprowadź drugą kaniulę do tętnicy udowej, aby monitorować ciśnienie krwi.

Na koniec wprowadź kaniulę do tchawicy. Następnie umieść szczura w aparacie stereotaksycznym. Wykonaj kraniotomię, aby odsłonić móżdżek, uważając, by nie uszkodzić dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.

Następnie pokryj powierzchnię mózgu podgrzanym olejem mineralnym. Teraz przyklej żuchwę do pręta połączonego z wibratorem elektromagnetycznym. Ruch żuchwy jest kontrolowany za pomocą sygnałów sterujących przesyłanych do wibratora z generatora sygnałowego.

Następnie umieść elektrodę uziemiającą pod skórą w sąsiedztwie kraniotomii. Aby przygotować elektrody wewnątrzkomórkowe, napełnij mikroelektrody roztworem barwnika IDE lub tetraetylowego rodaminy. Impedancja elektrody wynosi od 60 do 80 megaomów dla aksonów o dużym przekroju oraz od 80 do 150 megaomów dla małych aksonów doprowadzających i neuronów pośredniczących.

Następnie należy wprowadzić mikroelektrodę do głowicy elektrometru, korzystając z małego teleskopu przymocowanego w stałej pozycji za głową zwierzęcia. Mikroelektrodę należy obserwować przez dołączony okular 20x teleskopu. Obszar docelowy znajduje się około 0,5 milimetra przyśrodkowo od dolnej krawędzi wzgórza dolnego.

Następnie wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej, aby umożliwić precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu. Zwiększ czułość sprzężenia zwrotnego pojemnościowego w taki sposób, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Przesuwaj elektrodę, aż wniknie ona w głąb mózgu.

Kolejnym krokiem jest aktywacja powtarzalnego przemieszczania żuchwy. Następnie, przy użyciu silnika krokowego, wprowadź elektrodę do mózgu. Gdy nagły spadek potencjału dc oraz trwająca aktywność synaptyczna wskażą na przebicie neuronu, przerwij wprowadzanie elektrody.

Gdy penetracja zostanie uznana za stabilną, należy rozpocząć ruchy szczęk w trybie ramp and hold oraz sinusoidalne. Należy zarejestrować odpowiedź neuronalną i scharakteryzować neuron na podstawie tej odpowiedzi. Następnie, aby zmapować pole recepcyjne neuronu, należy użyć tępej sondy do zbadania skóry wokół głowy oraz jamy ustnej.

Zbadaj odpowiedź neuronu na inne bodźce, takie jak skurcz mięśnia lub bodźce nocyceptywne. Po zakończeniu rejestracji wstrzyknij prąd stały (DC) o natężeniu od 1 do 4 nA, aby uzyskać całkowitą dawkę ładunku od 15 do 70 nA·min. Monitoruj penetrację elektrody i przerwij wstrzykiwanie prądu.

Jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż minus 30 millivolts, następnym krokiem jest wykonanie skrawków tkanki mózgowej. Po uśpieniu i perfuzji zwierzęcia należy wyciąć mózg. Następnie wykonać skrawki o grubości od 50 do 100 micron w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej.

Aby zwizualizować relację między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi neuronami ruchowymi, należy poddać tkankę obróbce metodą H-R-P-D-A-B lub Texas red, w zależności od rodzaju tkanki; dodatkowe analizy można przeprowadzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego albo przy użyciu oprogramowania do ilościowej kolokalizacji. W razie potrzeby można przeprowadzić obróbkę immunochemiczną na synaptofizynę, aby dokładnie zlokalizować synapsy w znakowanych neuronach. Na tej rycinie przedstawiono neuron pnia mózgu, do którego wstrzyknięto IDE po charakterystyce elektrofizjologicznej.

Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu, neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecionka mięśniowego. Brązowa obrysowka wskazuje położenie jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Rysunek ten przedstawia odpowiedź fizjologiczną neuronu sensorycznego podczas przemieszczania żuchwy.

Odpowiedź neuronu przedstawiono jako chwilową częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź ta ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron dostarcza informacji zwrotnych sensorycznych związanych z pozycją żuchwy. Rysunek przedstawia neuron sensoryczny, który reagował podczas sondowania mięśni.

Neuron zabarwiono ide po przeprowadzeniu obróbki immunochemicznej. Przystawki synaptyczne, widoczne jako czerwone zgrubienia, współwystępują z żółtą synaptofizyną. Kolor zielony oznacza fluorescencyjne barwienie markerowe.

Rysunek ten przedstawia animację aksonu pierwotnego neuronu aferentnego wrzeciona mięśniowego. Do stworzenia animacji wykorzystano wiele przekrojów optycznych znakowanego neuronu. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak elektromikroskopia, mikroskopia konfokalna oraz znakowanie neuronów w kierunku przednim lub wstecznym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki ultrastrukturalnej neuronu, kolokalizacji neuroprzekaźników z pączkami synaptycznymi oraz połączeń neuronalnych.