Fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna charakterystyka neuronów modulowanych przez ruch

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie fizjologicznej odpowiedzi pojedynczych neuronów podczas ruchu oraz dalsze scharakteryzowanie morfologii i neurochemii tych neuronów. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie i chirurgiczne przygotowanie zwierzęcia. Kolejnym krokiem jest elektrofizjologiczny zapis wewnątrzkomórkowej odpowiedzi pojedynczych neuronów podczas ruchu.

Po perfuzji zwierzęcia i przetworzeniu mózgu, ostatnim krokiem jest wizualizacja i analiza reakcji fizjologicznej i morfologii neuronów. Ostatecznie techniki wewnątrzkomórkowego zapisu neuronów, immunochemii i analizy łączą się, aby pokazać modulacje potencjału błonowego pojedynczych neuronów podczas ruchu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla komórkowa, jest to, że połączenia neuronalne i wejścia synaptyczne są zachowane, a neurony nie są eksautotomizowane ani umieszczane w sztucznych pożywkach Dzień wcześniej eksperyment wstrzykuje znacznik neuronalny, taki jak chrzan, peroksydazę do obwodowych regionów docelowych, aby wstecznie oznaczyć neurony ruchowe.

Następnego dnia znieczulij szczura i umieść go na poduszce grzewczej, ogol skórę, pokrywając tylną część czaszki maszynkami do strzyżenia zwierząt przy użyciu techniki aseptycznej. Wykonaj nacięcie wzdłuż wewnętrznej strony uda, włóż kaniulę do żyły udowej w celu dodatkowego znieczulenia. Włóż kolejną kaniulę do tętnicy udowej, aby monitorować ciśnienie krwi.

Na koniec włóż kaniulę do tchawicy. Następnie umieść szczura w stereotaktycznej ramce. Wykonaj kraniotomię, aby odsłonić móżdżek, uważając, aby uniknąć dużej zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowej i międzyciemieniowej.

Następnie przykryj powierzchnię mózgu rozgrzanym olejem mineralnym. Teraz przyklej żuchwę do pręta sprzężonego z wibratorem elektromagnetycznym. Ruch żuchwy jest kontrolowany za pomocą sygnałów sterujących do wibratora z generatora sygnałów.

Następnie umieść elektrodę uziemiającą pod skórą przylegającą do kraniotomii. Aby przygotować się do elektrod wewnątrzkomórkowych, należy napełnić mikroelektrody testami roztworu barwnika IDE lub tetraetylowego pręta Domine. Ta impedancja elektrody wynosi od 60 do 80 megaomów dla aksonów o dużej średnicy i od 80 do 150 megaomów dla małych aksonów doprowadzających i neuronów pośrednich.

Następnie umieść mikroelektrodę w stopniu głowy elektrometru za pomocą małego teleskopu, który jest zamocowany w pozycji za głową zwierzęcia. Wizualizuj mikroelektrodę przez 20-krotną dołączoną redleję teleskopu. Obszar docelowy znajduje się około 0,5 milimetra w odległości od dolnej granicy wzgórka dolnego.

Teraz zrób mały otwór w pia mater, aby umożliwić dokładne zlokalizowanie powierzchni mózgu. Nadmierna kompensacja sprzężenia zwrotnego pojemności, tak aby gdy elektroda dotknie mózgu, wytwarzany jest sygnał sprzężenia zwrotnego. Przesuwaj elektrodę, aż wejdzie do mózgu.

Kolejnym krokiem jest aktywacja powtarzającego się przemieszczenia żuchwy. Następnie, za pomocą silnika krokowego, wsuń elektrodę do mózgu. Gdy przebicie neuronu jest wskazane przez nagły spadek potencjału prądu stałego i trwającą aktywność synaptyczną, należy przerwać przesuwanie elektrody.

Gdy penetracja zostanie uznana za stabilną, zainicjuj ruchy rampy i trzymania oraz sinusoidalne ruchy szczęki. Zapisz odpowiedź neuronalną i scharakteryzuj neuron na podstawie jego odpowiedzi. Następnie, aby zmapować pole recepcyjne neuronu, użyj sondy, aby zbadać skórę wokół głowy i jamy wewnątrzustnej.

Zbadaj reakcję neuronu na inne bodźce, takie jak skurcz mięśni lub szkodliwe bodźce. Po zakończeniu nagrań wstrzyknij od jednego do czterech nano amperów, prąd stały, aby uzyskać łączny wtrysk od 15 do 70 nano amperów. Monitoruj penetrację elektrody i przerwij wstrzykiwanie prądu.

Jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż minus 30 miliwoltów, następnym krokiem jest przecięcie tkanki mózgowej. Po eutanazji i perfuzji zwierzęcia należy usunąć mózg. Następnie wytnij odcinki o grubości od 50 do 100 mikronów w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej.

Aby zobrazować związek między znakowanym neuronem czuciowym a różnymi neuronami ruchowymi, przetworzyć tkankę pod kątem H-R-P-D-A-B lub czerwieni teksańskiej, w zależności od tkanki, dodatkowe analizy można wykonać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego lub za pomocą oprogramowania do kolokalizacji ilościowej. W razie potrzeby można przeprowadzić przetwarzanie immunochemiczne dla synaptofizyny, aby dokładnie zlokalizować synapsy w znakowanych neuronach. Ten rysunek przedstawia neuron pnia mózgu, któremu wstrzyknięto IDE po charakterystyce elektrofizjologicznej.

Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu, neuron ten można zidentyfikować jako neuron doprowadzający wrzeciona mięśniowego. Brązowy kontur wskazuje położenie trójdzielnego jądra ruchowego. Ten rysunek pokazuje fizjologiczną reakcję neuronu czuciowego podczas przemieszczenia szczęki.

Odpowiedź neuronu jest reprezentowana jako chwilowa częstotliwość odpalania. Zauważ, że odpowiedź ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron zapewnia sensoryczne sprzężenie zwrotne związane z pozycją żuchwy. Ten rysunek pokazuje neuron czuciowy, który zareagował podczas sondowania mięśni.

Neuron został przebarwiony ide po przetworzeniu immunochemicznym. Bateczki synaptyczne pojawiające się jako czerwone obrzęki są widoczne w kolokalizacji z żółtą synaptofizyną. Zielony to plama fluorescencyjnego pocisku.

Ten rysunek jest animacją aksonu z wrzeciona mięśniowego pierwotnego neuronu doprowadzającego. Do wygenerowania animacji wykorzystano wiele sekcji optycznych znakowanego neuronu. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektromikroskopia, mikroskopia konfokalna i znakowanie neuronów stopnia przedniego lub wstecznego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ultrastrukturalnych cech neuronalnej kolokalizacji neuroprzekaźników z synaptycznymi BNS i łącznością neuronalną.