Charakterystyka fizjologiczna, morfologiczna i neurochemiczna neuronów modulowanych przez ruch

Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odpowiedzi fizjologicznej pojedynczych neuronów podczas ruchu oraz dalsza charakterystyka morfologii i neurochemii tych neuronów. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie i chirurgiczne przygotowanie zwierzęcia. Kolejnym krokiem jest elektrofizjologiczna rejestracja odpowiedzi wewnątrzkomórkowej pojedynczych neuronów podczas ruchu.

Po perfuzji zwierzęcia i opracowaniu mózgu ostatnim krokiem jest wizualizacja oraz analiza odpowiedzi fizjologicznej i morfologii neuronów. Ostatecznie techniki wewnątrzkomórkowych rejestracji neuronalnych, immunochemii i analizy łączą się, aby wykazać modulacje potencjału błonowego pojedynczych neuronów podczas ruchu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak hodowle komórkowe, jest zachowanie połączeń neuronalnych i wejść synaptycznych, a neurony nie są autotomizowane ani umieszczane w sztucznych mediach. Dzień przed eksperymentem należy wstrzyknąć znacznik neuronalny, taki jak peroksydaza chrzanowa, do obwodowych obszarów docelowych w celu retrogradnego znakowania neuronów ruchowych.

Następnego dnia znieczul szczura i umieść go na podkładce grzewczej, a następnie przy użyciu maszynki do strzyżenia zwierząt i z zachowaniem zasad aseptyki ogól trzeba ogolić skórę nad tylną częścią czaszki. Wykonaj nacięcie wzdłuż wewnętrznej strony uda i wprowadź kaniulę do żyły udowej w celu podawania dodatkowej anestezji. Wprowadź kolejną kaniulę do tętnicy udowej, aby monitorować ciśnienie krwi.

Na koniec wprowadź kaniulę do tchawicy. Następnie umieść szczura w uchwycie stereotaktycznym. Wykonaj kraniotomię, aby odsłonić móżdżek, uważając, by nie uszkodzić dużego zatoki żylnej znajdującej się bezpośrednio pod połączeniem kości ciemieniowych i kości międzyciemieniowej.

Następnie powierzchnię mózgu należy pokryć podgrzanym olejem mineralnym. Teraz przykleja się żuchwę do pręta połączonego z elektromagnetycznym wibratorem. Ruch żuchwy jest kontrolowany za pomocą sygnałów sterujących przesyłanych do wibratora z generatora sygnałów.

Następnie umieść elektrodę uziemiającą pod skórą w sąsiedztwie kraniotomii. Aby przygotować elektrody wewnątrzkomórkowe, napełnij mikroelektrody roztworem barwnika IDE lub tetraetylodiaminy. Impedancja elektrod wynosi od 60 do 80 MΩ dla aksonów o dużej średnicy oraz od 80 do 150 MΩ dla małych aksonów doprowadzających i interneuronów.

Następnie wprowadź mikroelektrodę do głowicy elektrometru, korzystając z małego teleskopu zamocowanego w stałej pozycji za głową zwierzęcia. Obserwuj mikroelektrodę przez okular 20 x teleskopu. Obszar docelowy znajduje się około 0,5 mm bocznie od dolnej krawędzi wzgórza dolnego.

Następnie wykonaj niewielki otwór w oponie miękkiej, aby umożliwić precyzyjne zlokalizowanie powierzchni mózgu. Zwiększ czułość sprzężenia pojemnościowego w taki sposób, aby w momencie dotknięcia mózgu przez elektrodę wygenerowany został sygnał zwrotny. Przesuwaj elektrodę do momentu wprowadzenia jej do tkanki mózgowej.

Kolejnym krokiem jest aktywacja powtarzalnego przemieszczania żuchwy. Następnie, przy użyciu silnika krokowego, należy wprowadzić elektrodę do mózgu. Gdy nagły spadek potencjału dc oraz trwająca aktywność synaptyczna wskażą na przebicie neuronu, należy przerwać wprowadzanie elektrody.

Gdy penetracja zostanie uznana za stabilną, należy rozpocząć ruchy szczęk w trybie ramp-and-hold oraz sinusoidalne. Należy zarejestrować odpowiedź neuronalną i scharakteryzować neuron na podstawie tej odpowiedzi. Następnie, w celu zmapowania pola recepcyjnego neuronu, należy użyć tępego zgłębnika do zbadania skóry wokół głowy oraz jamy ustnej.

Zbadaj odpowiedź neuronu na inne bodźce, takie jak skurcz mięśnia lub bodźce nocyceptywne. Po zakończeniu rejestracji wstrzyknij prąd stały (DC) o natężeniu od 1 do 4 nA, aby uzyskać całkowity ładunek od 15 do 70 nA·min. Monitoruj penetrację elektrody i przerwij wstrzykiwanie prądu.

Jeśli potencjał błonowy stanie się bardziej dodatni niż minus 30 miliwoltów, następnym krokiem jest wykonanie przekrojów tkanki mózgowej. Po eutanazji i perfuzji zwierzęcia należy wyjąć mózg. Następnie należy wykonać przekroje o grubości od 50 do 100 mikronów w płaszczyźnie czołowej, strzałkowej lub poziomej.

Aby zwizualizować relację między znakowanym neuronem sensorycznym a różnymi neuronami ruchowymi, należy poddać tkankę procesowaniu metodą H-R-P-D-A-B lub Texas red, w zależności od rodzaju tkanki; dodatkowe analizy można przeprowadzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego lub przy użyciu oprogramowania do ilościowej analizy kolokalizacji. W razie potrzeby można przeprowadzić procesowanie immunochemiczne na synaptofizynę, aby precyzyjnie zlokalizować synapsy w obrębie znakowanych neuronów. Na tej rycinie przedstawiono neuron pnia mózgu, w który wstrzyknięto IDE po przeprowadzeniu charakterystyki elektrofizjologicznej.

Na podstawie odpowiedzi neuronalnej podczas ruchu, neuron ten można zidentyfikować jako wtórny neuron aferentny wrzecionka mięśniowego. Brązowa obrysia wskazuje lokalizację jądra ruchowego nerwu trójdzielnego. Rysunek ten przedstawia odpowiedź fizjologiczną neuronu czuciowego podczas przemieszczenia żuchwy.

Odpowiedź neuronu przedstawiono jako chwilową częstotliwość wyładowań. Należy zauważyć, że odpowiedź ta ściśle naśladuje przemieszczenie żuchwy, co wskazuje, że ten konkretny neuron dostarcza sprzężenia zwrotnego sensorycznego związanego z pozycją żuchwy. Rysunek przedstawia neuron sensoryczny, który zareagował podczas badania mięśni.

Neuron został zabarwiony metodą ide po obróbce immunochemicznej. Batony synaptyczne, widoczne jako czerwone zgrubienia, są współlokalizowane z żółtą synaptofizyną. Kolor zielony oznacza fluorescencyjne barwienie missile.

Rysunek ten jest animacją aksonu pierwszorzędowego neuronu aferentnego wrzecionka mięśniowego. Do wygenerowania animacji wykorzystano wiele przekrojów optycznych znakowanego neuronu. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak elektromikroskopia, mikroskopia konfokalna oraz znakowanie neuronów w kierunku przednim lub wstecznym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki ultrastrukturalnej neuronu, kolokalizacji neuroprzekaźników z pączkami synaptycznymi oraz łączności neuronalnej.