Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Ogólnym celem tej techniki obrazowania i analizy jest wyizolowanie określonych informacji ze złożonego sygnału. W szczególności protokół ten opisuje, jak wizualizować i określać ilościowo mitochondria specyficzne dla nerwów z innymi mitochondriami w naskórku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurologii, takie jak porównanie mitochondriów w śródnaskórkowych włóknach nerwowych zdrowych osób z mitochondriami specyficznymi dla nerwów u pacjentów z powikłaniami neurologicznymi.

Główną zaletą tej techniki jest to, że bierzemy złożony sygnał i wydobywamy z niego określone informacje. Protokół ten pomaga nam odizolować określony sygnał, taki jak sygnał w tych słomkach, od sygnałów wokół nich. Przygotuj się do barwienia immunohistochemicznego fluorescencyjnego biopsji skóry, najpierw oznaczając 96-dołkową płytkę zgodnie z tym schematem.

Następnie odpipetować 150 mikrolitrów podstawowego roztworu wzmacniacza sygnału, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał drugorzędowych w każdym dołku górnego rzędu. Przygotuj studzienki do płukania, dodając 150 mikrolitrów 1x buforowanej soli fizjologicznej z fosforanem do każdej studzienki w rzędach drugim i trzecim płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 5% roztworu blokującego BSA do studzienek w rzędzie czwartym.

Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała PGP9,5 i PDH w 1 500 mikrolitrach 1% roztworu płuczącego BSA i dodać 150 mikrolitrów do każdej studzienki w rzędzie piątym. Użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść sekcje do roztworu wzmacniacza sygnału w pierwszym rzędzie. Gdy skrawki znajdą się w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w rzędzie piątym, owiń płytkę szczelnie folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu, a następnie mieszaj próbki na płaskim wahaczu w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Inkubować z kołysaniem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocznij drugi dzień procedury od odpipetowania 150 mikrolitrów 1% roztworu płuczącego BSA do studzienek w rzędach szóstym, siódmym i ósmym płytki 96-dołkowej. Dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem do 1 500 mikrolitrów 1% BSA.

Następnie odpipetować 150 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki w rzędzie dziewiątym. Przepłucz sekcje, przechodząc przez studzienki szóstą, siódmą i ósmą. Gdy skrawki znajdą się w roztworze przeciwciała drugorzędowego w rzędzie dziewiątym, owiń płytkę w parafilm i przykryj folią aluminiową, aby chronić sygnały fluorescencyjne.

Inkubuj z kołysaniem jak poprzednio. Trzeciego dnia odpipetuj 150 mikrolitrów sterylnego przefiltrowanego 1x PBS w rzędach 10, 11 i 12. Przenieś próbki do rzędu 10, a następnie przykryj płytkę folią aluminiową.

Płukać przez godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe do montażu sekcji, pipetując 50 mikrolitrów przefiltrowanego 1x PBS na szkiełko. Po zakończeniu płukania przenieś fragment z rzędu 12 na szkiełko, a następnie dodaj jedną lub dwie krople odczynnika montażowego zawierającego DAPI bezpośrednio na wierzch sekcji.

Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe mikroskopu o wymiarach 1,5 milimetra o wymiarach 50 milimetrów na 24 milimetry na przekroju. Umieść szkiełka w ciemności na noc w temperaturze pokojowej, aby utwardzić podłoże montażowe przed przechowywaniem lub obrazowaniem szkiełek. Wybierz obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w olejku w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.

Wybierz odpowiednie lasery i detektory do obrazowania jąder, włókien nerwowych i mitochondriów. Wprowadź następujące parametry skanowania do oprogramowania mikroskopu: 12-bitowa rozdzielczość intensywności, częstotliwość skanowania 500 Hz z uśrednianiem dwóch klatek i zoom 2,2. Ustaw oprogramowanie mikroskopu w celu uzyskania zoptymalizowanej rozdzielczości bocznej, wybierając rozdzielczość skanowania 1024 na 1024.

Zoptymalizuj rozdzielczość osiową i przekrój optyczny, wybierając aperturę konfokalną jednej jednostki powietrznej z krokiem Z wynoszącym 210 nanometrów. Zeskanuj każdy sygnał osobno i dostosuj napięcie i przesunięcie detektora, aby usunąć wszelkie nadmiernie i niedostatecznie nasycone piksele. Aktywuj skanowanie na żywo dla sygnału nerwowego i dostosuj regulator ostrości Z, aby znaleźć i ustawić górną i dolną płaszczyznę ogniskową w oprogramowaniu mikroskopu, które obejmują sygnał nerwowy w sekcji tkanki.

Zeskanuj ostateczną serię Z za pomocą skanowania sekwencyjnego, aby wyeliminować przesłuchy sygnału fluorescencji. Odizoluj naskórek od warstwy rogowej naskórka i skóry właściwej, rysując obszar wokół naskórka za pomocą narzędzia do zaznaczania na zduplikowanym obrazie oryginalnego obrazu. Następnie przytnij obraz do zaznaczenia.

Oblicz funkcje rozproszenia punktów dla sygnałów konfokalnych zielonej i czerwonej fluorescencji za pomocą funkcji obliczania funkcji rozproszenia. Następnie ustaw parametry średniego współczynnika załamania światła dla oleju na 1,515 i aperturę numeryczną dla obiektywu olejowego 40X na 1,25. Ustaw otwór detektora na jednej jednostce powietrznej i wybierz długość fali wzbudzenia laserowego.

Użyj przywracania iteracyjnego ustawionego na 100% ufności, limit iteracji wynoszący 10 cykli oraz zielone i czerwone PSF do dekonwulacji zielonych i czerwonych sygnałów fluorescencyjnych. Użyj narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zdekonwoluowanych sygnałów nerwowych, wybierając odznacz funkcję gładkości, bezwzględną intensywność progowania, dolny próg 3 000 i górny próg 65 535. Utrzymuj powierzchnie powyżej 10 wokseli.

Usuń powierzchnie nienerwowe za pomocą karty edycji na powierzchni nerwu, aby wybrać pojedyncze powierzchnie nienerwowe lub przytrzymaj Control, aby wybrać wiele powierzchni nienerwowych. Usuń wybrane powierzchnie nienerwowe, naciskając przycisk Usuń. Użyj zakładki edycji w powierzchni nerwu i naciśnij przycisk maskuj wszystko we właściwościach maski.

W nowym oknie wybierz kanał piąty mitochondria zdekonwolucjonowane pod wyborem kanału, a następnie sprawdź zduplikowany kanał przed nałożeniem maski. Naciśnij przycisk radiowy dla stałej wewnątrz/na zewnątrz i sprawdź ustawioną powierzchnię zewnętrzną wokseli na 0.0 i naciśnij przycisk OK. Na koniec utwórz powierzchnie specyficzne dla mitochondriów za pomocą narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zamaskowanych, zdekonwoluowanych sygnałów mitochondrialnych, wybierając opcję odznacz funkcję wygładzania i używając odejmowania tła do progowania.

Ustaw średnicę największej kuli na 1,50 mikrometra, dolny próg na 2 000, a górny próg na maksimum 65 535. Upewnij się, że powierzchnie powinny znajdować się powyżej 1,0 wokseli. Ten reprezentatywny obraz z mikroskopii konfokalnej 3D ilustruje specyficzny dla nerwów sygnał zielonej fluorescencji.

Powierzchnia 3D pokazana w kolorze turkusowym jest tworzona dla sygnału nerwowego. Następnie specyficzny dla nerwu sygnał mitochondrialny jest izolowany od reszty sygnałów mitochondrialnych naskórka poprzez wykorzystanie powierzchni nerwu jako narzędzia maskującego. Uzyskany specyficzny dla nerwów mitochondrialny sygnał czerwonej fluorescencji jest wykorzystywany do tworzenia powierzchni pokazanych jako purpurowe wokół mitochondriów na powierzchni nerwu, która jest pokazana w kolorze cyjanu.

Dzięki temu mitochondria we włóknach nerwowych są szczegółowo widoczne. W tym przypadku dane dotyczące powierzchni mitochondriów są prezentowane jako histogram częstotliwości wielkości, aby zobrazować procent mitochondriów, które są obecne w każdym z różnych zagięć w zależności od ich objętości. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dbać o tkankę podczas procesu barwienia, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworach, aby zapewnić równomierne i spójne barwienie na wszystkich odcinkach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i określać ilościowo mitochondria w ludzkich śródnaskórkowych włóknach nerwowych. Nasz szczegółowy protokół został zaprojektowany, aby nauczyć innych badaczy, jak barwić, obrazować, przetwarzać i analizować biopsje ludzkiej skóry w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy mitochondrialnych chorób neurologicznych, takich jak neuropatia.