Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Ogólnym celem tej techniki obrazowania i analizy jest wyizolowanie specyficznych informacji ze złożonego sygnału. W szczególności niniejszy protokół opisuje sposób wizualizacji i kwantyfikacji mitochondriów specyficznych dla nerwów oraz pozostałych mitochondriów w obrębie naskórka. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neurologii, takie jak porównanie mitochondriów wewnątrz zn. włókien nerwowych naskórka u zdrowych osób z mitochondriami specyficznymi dla nerwów u pacjentów z powikłaniami neurologicznymi.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość pobrania złożonego sygnału i wyekstrahowania z niego konkretnych informacji. Niniejszy protokół pomaga wyizolować określony sygnał, taki jak sygnał w tych słomkach, z sygnałów otaczających. Przygotuj się do barwienia immunofluorescencyjnego biopsji skóry, najpierw opisując płytkę 96-dołkową zgodnie z tym schematem.

Następnie do każdej studni w górnym rzędzie pipetuj 150 µL roztworu wzmacniacza sygnału z zapasu, aby zredukować niespecyficzne wiązanie przeciwciał wtórnych. Przygotuj studnie do płukania, dodając 150 µL 1x solanki fosforanowej (PBS) do każdej studni w drugim i trzecim rzędzie płytki 96-dołkowej. Następnie do studni w czwartym rzędzie dodaj 150 µL 5% roztworu blokującego BSA.

Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe PGP9.5 i PDH w 1 500 µL roztworu płuczącego 1% BSA i dodać 150 µL do każdej studzienki w piątym rzędzie. Użyć pętlą do szczepień, aby przenieść skrawki do roztworu wzmacniającego sygnał w pierwszym rzędzie. Gdy skrawki znajdą się w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych w piątym rzędzie, szczelnie owinąć płytkę folią laboratoryjną, aby zapobiec odparowaniu, a następnie inkubować próbki na płaskim wytrząsalniku w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Drugi dzień procedury rozpocząć od pipetowania 150 µL roztworu płuczącego 1% BSA do studzienek w rzędach szóstym, siódmym i ósmym płytki 96-dołkowej. Dodać przeciwciała wtórne sprzężone z fluorochromem do 1 500 µL 1% BSA.

Następnie pipetujemy 150 µL roztworu przeciwciała wtórnego do każdej studzienki w dziewiątym rzędzie. Płuczemy preparaty, przepuszczając je przez studzienki szóstą, siódmą i ósmą. Gdy preparaty znajdą się w roztworze przeciwciała wtórnego w dziewiątym rzędzie, owijamy płytkę parafilmem i przykrywamy folią aluminiową, aby chronić sygnały fluorescencyjne.

Inkubować z kołysaniem, podobnie jak poprzednio. Trzeciego dnia do rzędów 10, 11 i 12 pipetować 150 µL sterylnego filtrowanego 1x PBS. Przenieść próbki do rzędu 10, a następnie przykryć płytkę folią aluminiową.

Płukać przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy stałym kołysaniu. Następnie przygotować szkiełko mikroskopowe do montażu przekrojów, pipetując 50 µL przefiltrowanego 1x PBS na szkiełko. Po zakończeniu płukania przenieść przekrój z rzędu 12 na szkiełko, a następnie dodać jedną lub dwie krople medium montażowego zawierającego DAPI bezpośrednio na przekrój.

Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywcze o wymiarach 50 mm na 24 mm i grubości 1,5 na skrawku. Pozostaw preparaty w ciemności przez noc w temperaturze pokojowej, aby medium montażowe utwardziło się przed przechowywaniem lub obrazowaniem preparatów. Wybierz obiektyw imersyjny 40X w odwróconym konfokalnym mikroskopie laserowym.

Wybierz odpowiednie lasery i detektory do obrazowania jąder komórkowych, włókien nerwowych oraz mitochondriów. Wprowadź do oprogramowania mikroskopu następujące parametry skanowania: rozdzielczość intensywności 12-bit, częstotliwość skanowania 500 Hertz z uśrednianiem dwóch klatek oraz powiększenie (zoom) 2,2. W celu optymalizacji rozdzielczości bocznej ustaw w oprogramowaniu mikroskopu rozdzielczość skanowania 1024 na 1024.

Zoptymalizuj rozdzielczość osiową i sekcjonowanie optyczne, wybierając aperturę konfokalną o wartości jednej jednostki powietrznej (air unit) przy rozmiarze kroku Z wynoszącym 210 nanometrów. Skanuj każdy sygnał osobno i dostosuj napięcie oraz offset detektora, aby usunąć wszelkie nadmiernie lub niedostatecznie nasycone piksele. Aktywuj skanowanie na żywo dla sygnału nerwu i dostosuj kontrolę ostrości Z, aby znaleźć i ustawić w oprogramowaniu mikroskopu górną i dolną płaszczyznę ogniskowania, które obejmują sygnał nerwu w obrębie przekroju tkanki.

Zeskanuj końcową serię Z za pomocą skanowania sekwencyjnego, aby wyeliminować przechył sygnału fluorescencji. Odizoluj naskórek od warstwy rogowej oraz skóry właściwej, obrysowując obszar naskórka za pomocą narzędzia zaznaczania na kopii oryginalnego obrazu. Następnie przytnij obraz do zaznaczonego obszaru.

Oblicz funkcje rozproszonego punktu (PSF) dla konfokalnych sygnałów fluorescencji zielonej i czerwonej, korzystając z funkcji obliczania funkcji rozproszenia. Następnie ustaw parametry współczynnika załamania światła ośrodka dla oleju na 1,515 oraz aperturę numeryczną dla obiektywu olejowego 40X na 1,25. Ustaw otwór detektora (pinhole) na jedną jednostkę powietrzną i wybierz długość fali wzbudzenia laserem.

Użyj iteracyjnej rekonstrukcji ustawionej na 100% confidence, limitu 10 cykli oraz zielonych i czerwonych PSF do dekonwolucji zielonych i czerwonych sygnałów fluorescencji. Użyj narzędzia create surface, aby utworzyć powierzchnię wokół zdekonwolwowanych sygnałów nerwowych, odznaczając opcję smooth feature, wybierając absolute intensity dla progowania, próg dolny wynoszący 3 000 oraz próg górny wynoszący 65 535. Zachowaj powierzchnie powyżej 10 voxels.

Usuń powierzchnie niebędące nerwami, korzystając z karty edycji w sekcji powierzchni nerwowych, aby wybrać pojedyncze powierzchnie niebędące nerwami, lub przytrzymaj klawisz Control, aby zaznaczyć wiele takich powierzchni. Usuń wybrane powierzchnie niebędące nerwami, naciskając przycisk Delete. Skorzystaj z karty edycji w sekcji powierzchni nerwowych i naciśnij przycisk mask all w ustawieniach maski.

W nowym oknie, w sekcji wyboru kanałów, wybierz kanał pięć dla odszumionych obrazów mitochondriów (mitochondria deconvolved), a następnie zaznacz opcję duplikuj kanał (duplicate channel) przed nałożeniem maski. Wybierz przycisk radiowy dla stałej wartości wewnątrz/na zewnątrz (constant inside/outside), ustaw wartość wokseli poza powierzchnią (set voxels outside surface) na 0.0 i naciśnij przycisk OK. Na koniec, za pomocą narzędzia tworzenia powierzchni (create surface tool), utwórz powierzchnie specyficzne dla mitochondriów wokół zamaskowanych, odszumionych sygnałów mitochondrialnych, odznaczając opcję wygładzania cech (smooth feature) i stosując odejmowanie tła (background subtraction) do ustalenia progu.

Ustaw średnicę największej sfery na 1.50 micrometers, próg dolny na 2, 000 oraz próg górny na maksimum 65, 535. Należy upewnić się, że powierzchnie przekraczają 1.0 voxels. Ten reprezentatywny obraz z mikroskopii konfokalnej 3D przedstawia specyficzny dla nerwów zielony sygnał fluorescencyjny.

Dla sygnału nerwowego utworzono trójwymiarową powierzchnię przedstawioną kolorem cyjanowym. Następnie, wykorzystując powierzchnię nerwu jako maskę, wyizolowano sygnał mitochondrialny specyficzny dla nerwu z pozostałych sygnałów mitochondrialnych naskórka. Wynikowy czerwony sygnał fluorescencji mitochondriów specyficzny dla nerwu posłużył do stworzenia powierzchni przedstawionych kolorem purpurowym wokół mitochondriów w obrębie powierzchni nerwu ukazanej w kolorze cyjanowym.

Pozwala to na szczegółowe uwidocznienie mitochondriów w włóknach nerwowych. Przedstawiono tutaj dane dotyczące powierzchni mitochondriów w formie histogramu częstości rozmiarów, aby zwizualizować procentowy udział mitochondriów obecnych w poszczególnych przedziałach w zależności od ich objętości. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest odpowiednie traktowanie tkanki podczas procesu barwienia, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworach, co zapewni równomierne i spójne barwienie wszystkich przekrojów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat wizualizacji i kwantyfikacji mitochondriów w ludzkich wewnątrzepidermalnych włóknach nerwowych. Nasz szczegółowy protokół został opracowany, aby nauczyć innych badaczy, jak barwić, obrazować, przetwarzać i analizować biopsje ludzkiej skóry w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy chorób neurologicznych o podłożu mitochondrialnym, takich jak neuropatia.