Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka
29 września 2017
Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.
Ogólnym celem tej techniki obrazowania i analizy jest wyizolowanie określonych informacji ze złożonego sygnału. W szczególności protokół ten opisuje, jak wizualizować i określać ilościowo mitochondria specyficzne dla nerwów z innymi mitochondriami w naskórku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurologii, takie jak porównanie mitochondriów w śródnaskórkowych włóknach nerwowych zdrowych osób z mitochondriami specyficznymi dla nerwów u pacjentów z powikłaniami neurologicznymi.
Główną zaletą tej techniki jest to, że bierzemy złożony sygnał i wydobywamy z niego określone informacje. Protokół ten pomaga nam odizolować określony sygnał, taki jak sygnał w tych słomkach, od sygnałów wokół nich. Przygotuj się do barwienia immunohistochemicznego fluorescencyjnego biopsji skóry, najpierw oznaczając 96-dołkową płytkę zgodnie z tym schematem.
Następnie odpipetować 150 mikrolitrów podstawowego roztworu wzmacniacza sygnału, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał drugorzędowych w każdym dołku górnego rzędu. Przygotuj studzienki do płukania, dodając 150 mikrolitrów 1x buforowanej soli fizjologicznej z fosforanem do każdej studzienki w rzędach drugim i trzecim płytki 96-dołkowej. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 5% roztworu blokującego BSA do studzienek w rzędzie czwartym.
Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała PGP9,5 i PDH w 1 500 mikrolitrach 1% roztworu płuczącego BSA i dodać 150 mikrolitrów do każdej studzienki w rzędzie piątym. Użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść sekcje do roztworu wzmacniacza sygnału w pierwszym rzędzie. Gdy skrawki znajdą się w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego w rzędzie piątym, owiń płytkę szczelnie folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu, a następnie mieszaj próbki na płaskim wahaczu w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
Inkubować z kołysaniem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocznij drugi dzień procedury od odpipetowania 150 mikrolitrów 1% roztworu płuczącego BSA do studzienek w rzędach szóstym, siódmym i ósmym płytki 96-dołkowej. Dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem do 1 500 mikrolitrów 1% BSA.
Następnie odpipetować 150 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki w rzędzie dziewiątym. Przepłucz sekcje, przechodząc przez studzienki szóstą, siódmą i ósmą. Gdy skrawki znajdą się w roztworze przeciwciała drugorzędowego w rzędzie dziewiątym, owiń płytkę w parafilm i przykryj folią aluminiową, aby chronić sygnały fluorescencyjne.
Inkubuj z kołysaniem jak poprzednio. Trzeciego dnia odpipetuj 150 mikrolitrów sterylnego przefiltrowanego 1x PBS w rzędach 10, 11 i 12. Przenieś próbki do rzędu 10, a następnie przykryj płytkę folią aluminiową.
Płukać przez godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe do montażu sekcji, pipetując 50 mikrolitrów przefiltrowanego 1x PBS na szkiełko. Po zakończeniu płukania przenieś fragment z rzędu 12 na szkiełko, a następnie dodaj jedną lub dwie krople odczynnika montażowego zawierającego DAPI bezpośrednio na wierzch sekcji.
Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe mikroskopu o wymiarach 1,5 milimetra o wymiarach 50 milimetrów na 24 milimetry na przekroju. Umieść szkiełka w ciemności na noc w temperaturze pokojowej, aby utwardzić podłoże montażowe przed przechowywaniem lub obrazowaniem szkiełek. Wybierz obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w olejku w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.
Wybierz odpowiednie lasery i detektory do obrazowania jąder, włókien nerwowych i mitochondriów. Wprowadź następujące parametry skanowania do oprogramowania mikroskopu: 12-bitowa rozdzielczość intensywności, częstotliwość skanowania 500 Hz z uśrednianiem dwóch klatek i zoom 2,2. Ustaw oprogramowanie mikroskopu w celu uzyskania zoptymalizowanej rozdzielczości bocznej, wybierając rozdzielczość skanowania 1024 na 1024.
Zoptymalizuj rozdzielczość osiową i przekrój optyczny, wybierając aperturę konfokalną jednej jednostki powietrznej z krokiem Z wynoszącym 210 nanometrów. Zeskanuj każdy sygnał osobno i dostosuj napięcie i przesunięcie detektora, aby usunąć wszelkie nadmiernie i niedostatecznie nasycone piksele. Aktywuj skanowanie na żywo dla sygnału nerwowego i dostosuj regulator ostrości Z, aby znaleźć i ustawić górną i dolną płaszczyznę ogniskową w oprogramowaniu mikroskopu, które obejmują sygnał nerwowy w sekcji tkanki.
Zeskanuj ostateczną serię Z za pomocą skanowania sekwencyjnego, aby wyeliminować przesłuchy sygnału fluorescencji. Odizoluj naskórek od warstwy rogowej naskórka i skóry właściwej, rysując obszar wokół naskórka za pomocą narzędzia do zaznaczania na zduplikowanym obrazie oryginalnego obrazu. Następnie przytnij obraz do zaznaczenia.
Oblicz funkcje rozproszenia punktów dla sygnałów konfokalnych zielonej i czerwonej fluorescencji za pomocą funkcji obliczania funkcji rozproszenia. Następnie ustaw parametry średniego współczynnika załamania światła dla oleju na 1,515 i aperturę numeryczną dla obiektywu olejowego 40X na 1,25. Ustaw otwór detektora na jednej jednostce powietrznej i wybierz długość fali wzbudzenia laserowego.
Użyj przywracania iteracyjnego ustawionego na 100% ufności, limit iteracji wynoszący 10 cykli oraz zielone i czerwone PSF do dekonwulacji zielonych i czerwonych sygnałów fluorescencyjnych. Użyj narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zdekonwoluowanych sygnałów nerwowych, wybierając odznacz funkcję gładkości, bezwzględną intensywność progowania, dolny próg 3 000 i górny próg 65 535. Utrzymuj powierzchnie powyżej 10 wokseli.
Usuń powierzchnie nienerwowe za pomocą karty edycji na powierzchni nerwu, aby wybrać pojedyncze powierzchnie nienerwowe lub przytrzymaj Control, aby wybrać wiele powierzchni nienerwowych. Usuń wybrane powierzchnie nienerwowe, naciskając przycisk Usuń. Użyj zakładki edycji w powierzchni nerwu i naciśnij przycisk maskuj wszystko we właściwościach maski.
W nowym oknie wybierz kanał piąty mitochondria zdekonwolucjonowane pod wyborem kanału, a następnie sprawdź zduplikowany kanał przed nałożeniem maski. Naciśnij przycisk radiowy dla stałej wewnątrz/na zewnątrz i sprawdź ustawioną powierzchnię zewnętrzną wokseli na 0.0 i naciśnij przycisk OK. Na koniec utwórz powierzchnie specyficzne dla mitochondriów za pomocą narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zamaskowanych, zdekonwoluowanych sygnałów mitochondrialnych, wybierając opcję odznacz funkcję wygładzania i używając odejmowania tła do progowania.
Ustaw średnicę największej kuli na 1,50 mikrometra, dolny próg na 2 000, a górny próg na maksimum 65 535. Upewnij się, że powierzchnie powinny znajdować się powyżej 1,0 wokseli. Ten reprezentatywny obraz z mikroskopii konfokalnej 3D ilustruje specyficzny dla nerwów sygnał zielonej fluorescencji.
Powierzchnia 3D pokazana w kolorze turkusowym jest tworzona dla sygnału nerwowego. Następnie specyficzny dla nerwu sygnał mitochondrialny jest izolowany od reszty sygnałów mitochondrialnych naskórka poprzez wykorzystanie powierzchni nerwu jako narzędzia maskującego. Uzyskany specyficzny dla nerwów mitochondrialny sygnał czerwonej fluorescencji jest wykorzystywany do tworzenia powierzchni pokazanych jako purpurowe wokół mitochondriów na powierzchni nerwu, która jest pokazana w kolorze cyjanu.
Dzięki temu mitochondria we włóknach nerwowych są szczegółowo widoczne. W tym przypadku dane dotyczące powierzchni mitochondriów są prezentowane jako histogram częstotliwości wielkości, aby zobrazować procent mitochondriów, które są obecne w każdym z różnych zagięć w zależności od ich objętości. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dbać o tkankę podczas procesu barwienia, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworach, aby zapewnić równomierne i spójne barwienie na wszystkich odcinkach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i określać ilościowo mitochondria w ludzkich śródnaskórkowych włóknach nerwowych. Nasz szczegółowy protokół został zaprojektowany, aby nauczyć innych badaczy, jak barwić, obrazować, przetwarzać i analizować biopsje ludzkiej skóry w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy mitochondrialnych chorób neurologicznych, takich jak neuropatia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę wizualizacji i kwantyfikacji mitochondriów specyficznych dla nerwów, wykorzystując trójwymiarowe obrazowanie i analizę. Umożliwia badaczom wyodrębnianie specyficznych sygnałów mitochondrialnych z złożłego tła, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia schorzeń neurologicznych.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Komórkowa
- Obrazowanie Fluorescencyjne
Wprowadzenie
- Mitochondria odgrywają kluczową rolę w komórkowym metabolizmie energetycznym.
- Zrozumienie funkcji mitochondriów w włóknach nerwowych może dostarczyć informacji na temat chorób neurologicznych.
- Immunohistochemia fluorescencyjna jest kluczową techniką do wizualizacji struktur komórkowych.
- Ta metoda może rozróżnić zachowanie mitochondriów w stanie zdrowym i patologicznym.
Cel Badania
- Wizualizacja mitochondriów specyficznych dla nerwów w naskórku.
- Porównanie charakterystyk mitochondrialnych u osób zdrowych w porównaniu z pacjentami z powikłaniami neurologicznymi.
- Wzmocnienie zrozumienia roli mitochondriów w funkcjonowaniu nerwów.
Wykorzystane Metody
- Barwienie immunohistochemiczne fluorescencyjne biopsji skóry.
- Techniki trójwymiarowego obrazowania do analizy danych.
- Wyodrębnianie specyficznych sygnałów mitochondrialnych ze złożłego fluorescencyjnego tła.
- Kwantywna analiza dystrybucji i charakterystyk mitochondriów.
Główne Wyniki
- Pomyślna wizualizacja mitochondriów specyficznych dla nerwów w próbkach naskórka.
- Identyfikacja różnic w charakterystykach mitochondrialnych między osobami zdrowymi a dotkniętymi chorobą.
- Demonstracja skuteczności obrazowania 3D w wyodrębnianiu specyficznych sygnałów.
- Wgląd w rolę mitochondriów w zdrowiu i chorobie neurologicznej.
Wnioski
- Ten protokół stanowi cenne narzędzie do badania funkcji mitochondriów we włóknach nerwowych.
- Możliwość wyodrębniania specyficznych sygnałów wzmacnia zrozumienie złożonych systemów biologicznych.
- Przyszłe badania mogą bazować na tych odkryciach, aby zbadać cele terapeutyczne w neurologii.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise isolation and quantification of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers, addressing a critical need in neurology research to de-risk target validation by providing disease-relevant, quantitative mitochondrial phenotypes. The method supports mechanistic de-risking in preclinical models by allowing direct comparison of mitochondrial characteristics between healthy and neurologically affected tissues, thereby improving predictive confidence in target selection for neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating nerve-specific mitochondrial signals from complex epidermal backgrounds, clarifying pathway involvement in mitochondrial dysfunction.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible workflow for functional target validation using disease-altered mitochondrial morphology as a biomarker.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial size frequency distributions, enabling objective assessment of target engagement and biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based readouts (e.g., mitochondrial volume, surface data) suitable for high-content screening platforms assessing compound effects on nerve-specific mitochondria.
- Reproducibility: Defines consistent parameters for staining, acquisition, and analysis, ensuring assay standardization across laboratories and timepoints for reliable compound evaluation.
- Scalability: The 3D imaging and analysis pipeline can be adapted to multi-well formats, supporting scalable screening of therapeutic candidates in disease-relevant human tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly examines mitochondria in human sensory nerve fibers, providing a translationally accurate model for neuropathy and other mitochondrial-based neurologic diseases.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal assessment of mitochondrial alterations in the same tissue system used for target identification.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by linking mitochondrial phenotypes to neurological complications, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically enabling mechanistic de-risking of mitochondrial targets in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating nerve-specific mitochondria to clarify their role in axonal integrity and energy metabolism in sensory neurons.
- Screening: Delivers quantitative, standardized outputs (e.g., mitochondrial size frequency histograms) that allow comparison of compound-treated versus control conditions in human tissue.
- Analytics: Generates 3D surface data and threshold-based measurements that enable statistical analysis of mitochondrial distribution and morphology across experimental groups.
- Translational Research: Uses human skin biopsies to maintain disease relevance, ensuring findings are directly applicable to human neuropathy pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for studying mitochondrial dynamics in various nerve fiber types across multiple neurodegenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial involvement in nerve fiber degeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining, imaging, and analysis parameters, minimizing inter-user variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mitochondrial targets, reducing investment in targets with poor biological validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative mitochondrial phenotypes that inform advancement decisions in neurology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy for proper antibody labeling and signal detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with specific objectives (40X oil immersion) and spectral separation capabilities for green and red fluorophores.
- Necessitates 3D image analysis software capable of deconvolution, surface creation, masking, and threshold-based segmentation.
- Requires consistency in staining, acquisition, and analysis parameters across batches to ensure comparability of mitochondrial measurements.
- Limited to tissue systems where nerve-specific markers (e.g., PGP9.5) and mitochondrial markers (e.g., PDH) can be effectively labeled and distinguished from background signals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 1
9:39
Conclusion
8:41
Results: Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers
2:27
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 2
3:21
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 3
4:22
Confocal Imaging
6:00
Image Processing
7:03
Isolation of Nerve-specific Mitochondrial Signal
