Zastosowanie mikrofluidyki w elektrofizjologii
1 października 2007
Nazywam się Dave Edington. Jestem adiunktem na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu Illinois w Chicago. Obszarem, nad którym pracujemy, jest przede wszystkim zastosowanie mikrotechnologii w zastosowaniach biomedycznych, a konkretnie z wykorzystaniem urządzeń mikroprzepływowych.
A dzisiaj pokażemy Wam jeden z naszych projektów, który polega na użyciu urządzenia mikroprzepływowego, które dostosowuje się do standardowej komory perfuzyjnej wycinka mózgu, aby zapewnić przestrzenną stymulację czasową wycinka mózgu. Tak więc obecnie w preparatach elektrofizjologicznych główne zastosowania neuroprzekaźników do wycinka są albo globalnie w całym wycinku mózgu. Stymulujemy cały wycinek mózgu za jednym razem lub używamy mikropipety do zaciągania się neuroprzekaźnikami w różnych punktach czasowych.
Wycinek mózgu jest bardzo złożoną strukturą, a kiedy globalnie stosujesz neuroprzekaźniki lub używasz mikropipety, nie możesz odtworzyć wzorców stymulacji in vivo. Natomiast dzięki naszej platformie jesteśmy w stanie kontrolować stymulację do bardzo określonych regionów w splocie mózgu i osiągnąć stymulację bardziej podobną do in vivo. Tak więc obecne systemy perfuzyjne są pokazane tutaj, gdzie dokują do standardowego szkiełka nakrywkowego.
A te pozwalają na perfuzję nośnika na całym wycinku. Nie możesz jednak przestrzennie kontrolować rozdzielczości tego neuroprzekaźnika, z którym współpracuje twoje urządzenie stymulujące. Opracowaliśmy więc urządzenie micro flic, które dokuje do tej standardowej komory obfitości.
Można więc zastosować wszystkie standardowe testy elektrofizjologiczne. Jedyną różnicą jest to, że zamiast szklanego dna pokrywy, składa się to z urządzenia A-P-D-M-S, które ma kilka otworów przelotowych, które łączą się z kanałami mikroprzepływowymi, które łączą się z otworami w tej górnej komorze profuzyjnej, które możemy następnie stymulować neuroprzekaźniki przez te otwory, przez kanały, na zewnątrz przelotek i do wycinka mózgu. Używamy techniki zwanej pompowaniem pasywnym, aby dostarczyć płyny.
Nie potrzebujemy więc żadnych skomplikowanych rurek, aby wychodzić z tego urządzenia, ponieważ elektrofizjologia jest już bardzo złożoną procedurą. Upraszczając konstrukcję urządzenia i stosując pompowanie pasywne, upraszczamy eksperymentalny protokół stosowania tego urządzenia mikroprzepływowego. Struktura urządzenia to dwuwarstwowa sieć mikroprzepływowa.
Pierwsza warstwa to kanały prowadzące, które łączą się z portami wylotowymi, a druga warstwa składa się z tych otworów przelotowych, które łączą te kanały ze studnią. Tak więc ta produkcja odbywa się przy użyciu standardowych dwuwarstwowych etapów mikrofabrykacji U, w których mamy pewne znaki wyrównania, które upewniają się, że te przelotki są umieszczone bezpośrednio w środku tych czterech kanałów. Tak więc to urządzenie jest zaprojektowane do dokowania ze standardową komorą profuzji, dzięki czemu można użyć tych samych testów elektrofizjologicznych.
Możemy więc umieścić to na platformie elektrofizjologicznej, wprowadzić w to nasz cel, zapewnić lokalną stymulację przez nasze kanały mikroprzepływowe i nie komplikować niepotrzebnie konfiguracji eksperymentalnej ponad to, czego potrzebuje. Tak więc, utrzymując konstrukcję urządzenia tak prostą, jak to tylko możliwe, możemy znacznie łatwiej rozpowszechniać tę platformę. W tej chwili mamy te cztery litery V w środku naszych mikro kanałów przepływowych, ale można je dostosować do różnych potrzeb laboratoriów, w zależności od tego, który obszar mózgu badają.
Tak więc jeden region może badać hipokamp, a drugi może badać korę zewnętrzną. Mogliśmy stymulować te regiony w zależności od tego, jak zaprojektujemy to urządzenie mikroprzepływowe. A ponieważ urządzenie nie wymaga do działania żadnych elementów zewnętrznych, wystarczy mikropipeter do pipetowania do tych otworów za pomocą techniki pompowania pasywnego.
Nie ma żadnego dodatkowego sprzętu poza tym dolnym podłożem, który standardowe laboratorium elektrofizjologii musi nabyć, aby korzystać z tego urządzenia. Do tej pory skupialiśmy się na tym, aby kanały mikroprzepływowe były zadokowane do standardowych komór profuzyjnych. A teraz kolejną częścią projektu jest przetestowanie tego urządzenia w rzeczywistych badaniach opartych na hipotezach przy użyciu tych preparatów w postaci plastrów.
Wykazaliśmy, że za pomocą barwnika fluorescencyjnego możemy przestrzennie stymulować różne regiony, wstrzykując te fluorescencyjne analogi do kanałów. Następnym krokiem jest przeprowadzenie prawdziwych eksperymentów biologicznych. Tak więc dziedzina mikrofluidyki zbliża się do punktu przejściowego.
Odchodzimy od nowatorskich demonstracji typu proof of concept i naprawdę używamy tych urządzeń do odkrywania nowych i ekscytujących rzeczy, które wcześniej były niemożliwe do zrobienia. Tak więc dziedzina ta odchodzi od technik, w których zastosowaliśmy zasady dostępne w mikroskali, takie jak szybka dyfuzja, przepływ laminarny oraz duże proporcje usług do objętości i integracja procesów. A teraz zamierzamy ich użyć i zastosować do rozwiązywania niezaspokojonych potrzeb w laboratorium i klinice.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie urządzeń mikroprzepływowych w neuronauce, a konkretnie do czasowo-przestrzennej stymulacji skrawków mózgu. Metoda ta zwiększa precyzję aplikacji neuroprzekaźników w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Bioinżynieria
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Przygotowania skrawków do badań elektrofizjologicznych są powszechnie stosowane w neuronauce.
- Obecne metody aplikacji neuroprzekaźników są ograniczone pod względem precyzji.
- Urządzenia mikroprzepływowe oferują nowatorskie podejście do usprawnienia technik stymulacji.
- Standardowe komory perfuzyjne do skrawków mózgu mogą zostać zmodyfikowane w celu poprawy ich funkcjonalności.
Cel badania
- Zaprezentowanie urządzenia mikrofluidycznego umożliwiającego przestrzennie i czasowo kontrolowaną stymulację skrawków mózgu.
- Udoskonalenie sposobu aplikacji neuroprzekaźników w badaniach elektrofizjologicznych.
- Zapewnienie bardziej kontrolowanego środowiska dla eksperymentów na skrawkach mózgu.
Zastosowane metody
- Opracowanie urządzenia mikrofluidycznego kompatybilnego z komorami perfuzyjnymi do skrawków mózgu.
- Aplikacja neuroprzekaźników z wykorzystaniem systemu mikrofluidycznego.
- Porównanie technik stymulacji: globalnej i zlokalizowanej.
- Pomiary elektrofizjologiczne w celu oceny skuteczności stymulacji.
Główne wyniki
- Urządzenie mikroprzepływowe umożliwia precyzyjną kontrolę dostarczania neuroprzekaźników.
- Stymulacja przestrzenno-czasowa wykazuje lepsze wyniki w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Ulepszone wyniki eksperymentalne w preparatach skrawków mózgu.
- Potencjał do szerszych zastosowań w badaniach nad neuronauką.
Wnioski
- Urządzenia mikrofluidyczne znacząco usprawniają aplikację neuroprzekaźników w skrawkach mózgu.
- Technologia ta może przyczynić się do rozwoju badań elektrofizjologicznych i pokrewnych kierunków badawczych.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dodatkowe zastosowania tej metody.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta integracja mikroprzepływowości z elektrofizjologią odpowiada na kluczową, niezaspokojoną potrzebę w odkryciach neuronaukowych: osiągnięcie kontrolowanego przestrzennie i czasowo dostarczania neuromodulatorów do skrawków mózgu. Dzięki umożliwieniu regionowo specyficznych wzorców stymulacji, które lepiej naśladują warunki in vivo, platforma ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania leków na OUN. Uproszczona konstrukcja z pasywnym pompowaniem wspiera szerokie zastosowanie w procesach elektrofizjologicznych bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez precyzyjną przestrzenną kontrolę aplikacji neuromodulatorów w określonych obszarach mózgu.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność manipulowania mikropipetą, co zmniejsza zmienność techniczną w eksperymentach dotyczących dostarczania neuroprzekaźników.
- Wartość predykcyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez odtwarzanie wzorców stymulacji bardziej istotnych fizjologicznie niż w przypadku perfuzji globalnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy skrawków mózgu do późniejszego przesiewania związków poprzez ustanowienie powtarzalnych protokołów stymulacji zlokalizowanej.
- Wynik ilościowy: Umożliwia pomiar specyficznych dla regionu odpowiedzi elektrofizjologicznych, co pozwala na analizy zależne od dawki oraz analizy kinetyczne.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Dostosowuje się do różnych regionów mózgu (np. hipokampa, kory) poprzez zmianę projektu kanałów mikroprzepływowych, co wspiera kampanie przesiewowe ukierunkowane na wiele celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywania i badań przedklinicznych, zapewniając system istotny dla danej jednostki chorobowej do testowania efektów neuromodulatorów w ustrukturyzowanej tkance neuronalnej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia specyficzne dla danej ścieżki działanie leków poprzez izolowaną stymulację regionalną, co zmniejsza niejednoznaczność w badaniach nad oddziaływaniem na cel molekularny.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez wczesne ujawnianie zależności skuteczności od regionu oraz sygnałów poza celem w procesie odkrywania leków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając prowadzenie badań mechanistycznych z rozdzielczością przestrzenną, co zwiększa pewność w wyborze celów w OUN oraz w optymalizacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie izolacji zmiennych niezależnych (np. regionalnej ekspozycji na neuromodulatory) w złożonych preparatach neuronalnych.
- Screening: Zwiększa powtarzalność testów i precyzję odczytów ilościowych dzięki standaryzowanemu dostarczaniu płynów przez kanały mikrofluidyczne za pomocą pompy pasywnej.
- Analityka: Generuje specyficzne dla danych warunków pomiary elektrofizjologiczne, które pozwalają zespołom porównywać odpowiedzi regionalne oraz oceniać potencję i selektywność stymulantów.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie skrawków mózgu jako systemu istotnego dla danej choroby do oceny efektów neuromodulatorów w zachowanej architekturze tkankowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowano jako platformę wielokrotnego użytku, kompatybilną ze standardowymi komorami perfuzyjnymi, co minimalizuje potrzebę ponownej walidacji w różnych laboratoriach i projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki stymulacji kontrolowanej przestrzennie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki pompowaniu pasywnemu, eliminując zależność od zewnętrznych pomp lub złożonych układów rurek.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając multipleksowe testowanie regionalne w ramach jednej konfiguracji elektrofizjologicznej, co redukuje konieczność powielania analiz.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wyraźniejszych danych dotyczących zależności struktura-aktywność oraz zaangażowania celu w różnych podregionach mózgu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze urządzeń mikrofluidycznych oraz integracji z układem elektrofizjologicznym.
- Zależne od dostępu do standardowych komór perfuzyjnych do skrawków mózgu i systemów obrazowania mikroskopowego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnego dokowania urządzeń i wyrównania kanałów przez różnych użytkowników.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy celowaniu w różne obszary mózgu poprzez przeprojektowanie mikrofluidyczne układów przelotek i kanałów.
- Ograniczone przez konieczność walidacji fluorescencyjnej lub elektrofizjologicznej w celu potwierdzenia skutecznego dostarczenia neuromodulatora do obszarów docelowych.
