Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie. Tradycyjne modele in vitro opierają się na hodowli jednowarstwowej. Jednak serce, a konkretnie mięsień sercowy lub mięsień sercowy, jest złożone pod względem anizotropii 3D i składu komórkowego.

Dlatego tak ważne jest zwiększenie złożoności składu tkanek w modelach in vitro, aby lepiej naśladować zarówno składniki komórkowe, jak i strukturę mięśnia sercowego. W tej pracy demonstrujemy protokół rozwoju 3D dojrzałej tkanki serca ludzkiego serca pochodzącej z komórek macierzystych w nowatorskim urządzeniu mikroprzepływowym. To urządzenie zawiera główny kanał tkankowy 3D z wrodzonymi eliptycznymi mikrosłupkami, które indukują wysoki stopień wyrównania otaczających komórek serca otoczonych hydrożelem.

Główny kanał jest otoczony kanałami pożywki z portami iniekcyjnymi, które umożliwiają dyfuzję składników odżywczych w tkance. Ze względu na ostrożność wymaganą przy obchodzeniu się z urządzeniami mikroprzepływowymi, wizualna reprezentacja tego protokołu jest pomocna w prawidłowym ustaleniu tkanki serca 3D w urządzeniu mikroprzepływowym z wbudowanymi mikrosłupkami w celu lepszego wyrównania tkanek. Aby oddzielić ludzki fibroblast serca, najpierw wyjmij kolbę z inkubatora.

Umieścić w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozpocząć odsysanie zużytej pożywki z kolby. Następnie weź trzy ml PBS 1X, aby umyć kolbę. Zamknąć nakrętkę i zakręcić kolbą tak, aby dno było odpowiednio pokryte PBS.

Zassać PBS. Weź trzy ml trypsyny o temperaturze 37 stopni i dodaj do kolby. Następnie przechylić kolbę i zakręcić tak, aby dno było całkowicie pokryte.

Następnie umieść w inkubatorze na cztery do sześciu minut. Zneutralizuj trypsynę za pomocą FGM3, biorąc trzy ML i dodając je do kolby. Pipetować roztwór w górę i w dół, aby usunąć wszelkie komórki, które pozostały na tylnej stronie kolby.

Zawiesinę komórkową należy zebrać w probówce Falcon o pojemności 15 ml. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i dozuj do hemocytometru, aby policzyć komórki pod mikroskopem. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 250 G przez cztery minuty.

Po odwirowaniu odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy ze świeżym FGM3, aby uzyskać pożądane 75 milionów komórek na zawiesinę ML. Ponownie zawieś ogniwa, a następnie odłóż rurkę z luźno dopasowaną nasadką.

Aby oddzielić kardiomiocyty, wyjmij płytkę z inkubatora i odessaj pożywkę. Weź sześć ml PBS i umyj studzienki tak, aby w każdej studzience znajdowała się jedna ML PBS. Zassać PBS, uważając, aby nie naruszyć komórek przyczepionych do płytki.

Dodaj sześć ml podgrzanego trypLE Express, tak aby w każdym dołku sześciodołkowej płytki znajdował się jeden ML. Inkubować komórki z trypLE przez 10 minut. Po 10 minutach zneutralizuj trypLE za pomocą sześciu ML RPMI plus B27 plus insulina, tak aby dodawać jeden ML RMPI do każdej studzienki.

Użyj jednej pipety ML, aby zebrać roztwór i uderzyć nim w tylną część studzienek, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały podniesione. Zbierz zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 300 G przez trzy minuty.

Po odwirowaniu odessać pożywkę i trypLE. Ten krok jest ważny, aby umyć wrażliwe kardiomiocyty. Ten krok zapewnia, że wszystkie trypLE znikają w tworzeniu tkanki serca 3D.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu ML RPMI plus B27 plus insulina. Użyj pipety o pojemności jednego ml, aby pipetować roztwór w górę iw dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do liczenia za pomocą hemocytometru.

Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Zassać pożywkę po odwirowaniu po raz drugi. Dodaj odpowiednią ilość RPMI plus B27 plus insulina, aby uzyskać zawiesinę 75 milionów komórek na ML, a następnie ponownie zawiesić.

Aby przygotować roztwór kolagenu do kapsułkowania, wszystkie odczynniki należy umieścić w lodówce w kapturze. Następnie weź 75 mikrolitrów kolagenu zapasowego. Kolagen jest bardzo lepki, więc powoli pobieraj go pipetą, a następnie dozuj do probówki mikrowirówkowej na lodzie.

Weź 13,85 mikrolitrów RPMI i dodaj do kolagenu w tubce Falcon. Następnie weź 10 mikrolitrów czerwieni fenolowej i dodaj do mieszaniny na lodzie i ponownie zawiesij. Na koniec weź 1,15 mikrolitra jednego normalnego NaOH i dodaj do zawiesiny w celu zneutralizowania.

Następnie weź końcówkę do pipety o pojemności 200 mikrolitrów i ponownie zawieś zawiesinę. Kolejnym krokiem jest enkapsulacja komórek w obrębie kolagenu metrożel. Następnie weź porcję ośmiu mikrolitrów CM i dodaj do świeżej rurki Falcon na lodzie.

Następnie weź dwa mikrolitry CS i dodaj do tej mieszaniny komórek. Ponownie zawiesić zawiesinę ogniw i chwycić 5,6 mikrolitra zawiesiny ogniw i włożyć do świeżej probówki Falcon. Następnie weź kolagen, który właśnie przygotowałeś, weź cztery mikrolitry kolagenu, a następnie weź 2,4 mikrolitra metrogelu.

Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić jednorodny rozkład zawiesiny hydrożelu komórkowego. Po przygotowaniu wstrzyknięcia żelu można go włożyć do urządzeń. Weź nową końcówkę i ponownie zawiesij.

Weź szalkę Petriego urządzeń, włóż końcówkę do portu iniekcyjnego i powoli i równomiernie wstrzykuj. Zobaczysz, jak kanał urządzenia wypełnia się zawiesiną hydrożelu komórkowego. Po napełnieniu drugiego portu należy przerwać wstrzykiwanie i wyjąć końcówkę.

Po wstrzyknięciu należy obrócić urządzenia pęsetą i umieścić w większej szalce Petriego z wodą w inkubatorze na dziewięć minut. Po dziewięciu minutach wyjmij urządzenia z inkubatora i odwróć je do pozycji pionowej, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze na kolejne dziewięć minut, aby zakończyć polimeryzację hydrożelową. Teraz nadszedł czas, aby dodać media.

Weź więc RMPI plus B27 i włóż końcówkę do portu nośnika i zacznij powoli naciskać. Następnie zrób to na przeciwległym porcie nośnika. Może się okazać, że nośnik nie jest wstrzykiwany, więc możesz umieścić kroplę pożywki na górze portu, a następnie wziąć pipetę i użyć podciśnienia, aby przeciągnąć pożywkę z drugiej strony.

Zobaczysz więc, jak media zaczną być przeciągane przez kanał. Po dodaniu pożywki do wszystkich kanałów medialnych, urządzenia zostaną ponownie umieszczone w inkubatorze pod kątem 37 stopni. Urządzenie mikroprzepływowe jest pokazane w lewym górnym rogu.

Pierwszy, siódmy i czternasty dzień kultury są pokazane na tym obrazie. Po 14 dniach hodowli komórki powinny skondensować się w wysoce wyrównane struktury, które tworzą się wokół mikropostów. Ślady dnia 14 są pokazane tutaj w C spontanicznego skurczu, a także immunofluorescencyjne obrazy tkanek barwionych aktyną i markerami sercowymi.

To, co należy zobaczyć, to wysoce wyrównane włókna aktynowe, które tworzą się po 14 dniach w hodowli, a także równoległe prążkowane dojrzałe sarkomery i zlokalizowane połączenia szczelinowe. Podczas tej procedury bardzo ważne jest, aby wszystkie materiały były utrzymywane w niskich temperaturach na lodzie podczas wstrzykiwania hydrożelu komórkowego, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji. Z urządzeniami mikroprzepływowymi należy obchodzić się ostrożnie, zarówno podczas wytwarzania, wstrzykiwania, jak i rozszerzonej hodowli tkankowej.

Iniekcje komórek powinny być procesem stałym, aby zapewnić, że cały kanał został wypełniony, a jednocześnie wykonywane szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji lub wysychaniu hydrożelu przed dodaniem pożywki.