Name: Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę inżynierii 3D ludzkiej tkanki serca z wykorzystaniem mikroprzepływowych urządzeń z mikrosłupkami. Protokół umożliwia tworzenie anizotropowych modeli mięśnia sercowego do badań biologicznych i testowania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) oraz Flinn Foundation Award za zapewnienie źródeł finansowania dla tego projektu. Linia hiPSC, SCVI20, została uzyskana od dr Josepha C. Wu w Stanford Cardiovascular Institute finansowanego przez NIH R24 HL117756. Linia hiPSC, IMR90-4, została uzyskana z WiCell Research Institute55,56.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Stworzenie modelu ludzkiej tkanki serca in vitro ze wzmocnionymi interakcjami komórka-komórka i biomimetyczną strukturą 3D jest niezbędne dla podstawowych badań sercowo-naczyniowych i odpowiednich zastosowań klinicznych1. Ten nakreślony protokół wyjaśnia rozwój 3D ludzkiej anizotropowej tkanki serca w urządzeniu mikroprzepływowym, przy użyciu wspólnej hodowli CM pochodzących z komórek macierzystych z łącznymi CF zamkniętymi w hydrożelu kolagenowym, służąc do modelowania złożonego składu k...

Podejścia inżynierii tkankowej były szeroko badane w ostatnich latach, aby towarzyszyć wynikom klinicznym in vivo w medycynie regeneracyjnej i modelowaniu chorób1,2. Szczególny nacisk położono na modelowanie tkanek serca in vitro ze względu na nieodłączne trudności w pozyskiwaniu ludzkiej pierwotnej tkanki serca i wytwarzaniu fizjologicznie istotnych substytutów in vitro, co ogranicza podstawowe zrozumienie złożonych mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych (CVD)1,3. Tradycyjne modele często obejmowały testy hodowli jednowarstwowych 2D. Jednak znaczenie hodowli komórek serca w środowisku 3D w celu naśladowania zarówno natywnego krajobrazu mięśnia sercowego, jak i złożonych interakcji komórkowych zostało szeroko scharakteryzowane4,5. Ponadto większość wyprodukowanych do tej pory modeli zawierała monokulturę CM różnicowanych z komórek macierzystych. Jednak serce składa się z wielu typów komórek6 w złożonej architekturze 3D7, co uzasadnia krytyczną potrzebę poprawy złożoności składu tkankowego w modelach 3D in vitro, aby lepiej naśladować składniki komórkowe natywnego mięśnia sercowego.
Do tej pory badano wiele różnych podejść do tworzenia biomimetycznych modeli 3D mięśnia sercowego8. Podejścia te obejmują zarówno konfiguracje eksperymentalne, które pozwalają na obliczanie generowanej siły w czasie rzeczywistym, od monokulturowych CM wysiewanych na cienkich warstwach (zwanych cienkimi warstwami mięśni (MTF))9, po kohodowlę komórek serca w matrycach hydrożelowych 3D zawieszonych wśród wolnostojących wsporników (uważanych za zmodyfikowane tkanki serca (EHT))10. Inne podejścia koncentrowały się na wdrażaniu technik mikroformowania w celu naśladowania anizotropii mięśnia sercowego, od monokulturowych CM w hydrożelu 3D zawieszonych wśród wystających mikropostów w plastrze tkanki11, do monokulturowych CM wysiewanych wśród wciętych mikrorowków12,13. Każda z tych metod ma nieodłączne zalety i wady, dlatego ważne jest, aby wykorzystać technikę, która jest zgodna z zamierzonym zastosowaniem i odpowiadającym mu pytaniem biologicznym.
Zdolność do przyspieszenia dojrzewania CM pochodzących z komórek macierzystych jest niezbędna do udanej inżynierii in vitro tkanki mięśnia sercowego podobnej do dorosłej i przełożenia późniejszych wyników na interpretacje kliniczne. W tym celu szeroko zbadano metody dojrzewania CM, zarówno w 2D, jak i 3D14,15,16. Na przykład stymulacja elektryczna włączona do EHT, wymuszone wyrównanie CM z topografią powierzchni, sygnały sygnalizacyjne, czynniki wzrostu z kohodowli i / lub warunki hydrożelu 3D itp., Wszystko to prowadzi do zmiany na korzyść dojrzewania CM w co najmniej jednym z następujących elementów: morfologia komórki, obchodzenie się z wapniem, struktura sarkomeryczna, ekspresja genów lub siła skurczu.
Spośród tych modeli, podejścia wykorzystujące platformy mikroprzepływowe zachowują pewne zalety natury, takie jak kontrola gradientów, ograniczony dopływ komórek i minimalna ilość niezbędnych odczynników. Co więcej, wiele replik biologicznych może być generowanych jednocześnie za pomocą platform mikroprzepływowych, co służy do lepszego zbadania interesującego mechanizmu biologicznego i zwiększenia wielkości próby eksperymentalnej na korzyść mocy statystycznej17,18,19. Dodatkowo, wykorzystanie fotolitografii w procesie wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych umożliwia tworzenie precyzyjnych cech (np. topografii) na poziomie mikro- i nano, które służą jako mezoskopowe wskazówki do poprawy otaczającej struktury komórkowej i architektury tkanek na poziomie makro18,20,21,22 do różnych zastosowań w regeneracji tkanek i chorobach Modelowania.
Wcześniej zademonstrowaliśmy rozwój nowego modelu 3D tkanki serca na chipie, który wykorzystuje topografię powierzchni, w postaci wrodzonych eliptycznych mikropostów, aby wyrównać otoczone hydrożelem współhodowane komórki serca w połączoną, anizotropową tkankę20. Po 14 dniach hodowli tkanki utworzone w urządzeniu mikroprzepływowym są bardziej dojrzałe pod względem fenotypu, profilu ekspresji genów, charakterystyki obchodzenia się z wapniem i odpowiedzi farmaceutycznej w porównaniu z jednowarstwowymi i izotropowymi kontrolami 3D23. Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia metodę tworzenia tej 3D, współhodowanej, wyrównanej (tj. anizotropowej) ludzkiej tkanki serca w urządzeniu mikroprzepływowym przy użyciu CM pochodzących z hiPSC. W szczególności wyjaśniamy metody różnicowania i oczyszczania hiPSC w kierunku CM, suplementacji hCF CM w celu wytworzenia ustalonej populacji kohodowli, wprowadzania populacji komórek zamkniętych w hydrożelu kolagenowym do urządzeń mikroprzepływowych, a następnie analiza tkanek skonstruowanych w 3D za pomocą testów kurczliwych i immunofluorescencyjnych. Powstałe w ten sposób mikrotkanki zaprojektowane w 3D nadają się do różnych zastosowań, w tym do podstawowych badań biologicznych, modelowania CVD i testów farmaceutycznych.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 0,65 ml</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Dziurkacz do biopsji</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji 1,5 mm</td><td>VWR</td><td>95039-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki Falcon</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 18x18mm</td><td>VWR</td><td>16004-308</td><td>Szkiełka nakrywkowe powinny mieć numer 1, aby umożliwić obrazowanie</td></tr> <tr><td>w dużym powiększeniu4% paraformaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>101176-014</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płaskie płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR</td><td>82050-844</td><td></td></tr><tr><td>B27 bez insuliny</td><td>LifeTech</td><td>A1895602</td> B27 plus insulina LifeTech 17504001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>VWR</td><td>10188-030</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I, ogon szczura</td><td>Corning</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>ThermoFisher</td><td>A1517001</td><td>mogą być również wykonane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>45001-122</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FGM3</td><td>VWR</td><td>10172-048</td><td></td></tr><tr><td>GFR-Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-718</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898-500G</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>VWR</td><td>10152-212</td><td></td></tr><tr><td>hESC-Matrigel</td><td>Corning</td><td>BD354277</td><td></td></tr><tr><td>IPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Sigma</td><td>I0536-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki nawilżane</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>MTCS</td><td>Sigma</td><td>440299-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Szalka</td> Petriego <td>VWR</td><td>15140122</td><td></td></tr> (<tr><td>150x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td></td></tr> szalka <tr><td>Petriego (60x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma</td><td>P3532-5G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>MT10040CM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez glukozy</td><td>VWR</td><td>45001-110</td><td></td></tr><tr><td>Wafle krzemowe (100mm)</td><td>Wafel uniwersytecki</td><td>1196</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan sodu</td><td>Sigma</td><td>L4263-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8 2075</td><td>Microchem</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Deweloper</td><td>Termosy</td><td>ThermoFisher NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>EVG620 Aligner</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmy PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss AxioObserver Z1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opracowywanie zorganizowanej w 3d ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

Główną przyczyną zgonów na całym świecie jest choroba sercowo-naczyniowa (CVD). Jednak modelowanie fizjologicznej i biologicznej złożoności mięśnia sercowego, mięśnia sercowego, jest niezwykle trudne do osiągnięcia in vitro. Głównie przeszkody polegają na potrzebie ludzkich kardiomiocytów (CM), które są dorosłe lub wykazują fenotypy podobne do dorosłych i mogą z powodzeniem replikować złożoność komórkową mięśnia sercowego i skomplikowaną architekturę 3D. Niestety, ze względu na obawy etyczne i brak dostępnej pierwotnej ludzkiej tkanki serca pochodzącej od pacjenta, w połączeniu z minimalną proliferacją CM, pozyskiwanie żywotnych ludzkich CM było krokiem ograniczającym dla inżynierii tkankowej serca. W tym celu większość badań skupiła się na różnicowaniu serca indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) jako głównego źródła ludzkich CM, co doprowadziło do szerokiego włączenia hiPSC-CM do testów in vitro do modelowania tkanki serca.
Tutaj w tej pracy demonstrujemy protokół tworzenia 3D dojrzałej tkanki serca pochodzącej z ludzkich komórek macierzystych w urządzeniu mikroprzepływowym. W szczególności wyjaśniamy i wizualnie demonstrujemy produkcję 3D anizotropowego modelu tkanki serca na chipie in vitro z CM pochodzących z hiPSC. Opisujemy przede wszystkim protokół oczyszczania w celu selekcji CM, kohodowli komórek o określonym stosunku poprzez mieszanie CM z ludzkimi CF (hCF) oraz zawieszenie tej kokultury w hydrożelu na bazie kolagenu. Następnie demonstrujemy wstrzyknięcie hydrożelu wypełnionego komórkami w naszym dobrze zdefiniowanym urządzeniu mikroprzepływowym, osadzonym w naprzemiennych eliptycznych mikrosłupkach, które służą jako topografia powierzchni w celu wywołania wysokiego stopnia wyrównania otaczających komórek i matrycy hydrożelowej, naśladując architekturę natywnego mięśnia sercowego. Przewidujemy, że proponowany anizotropowy model tkanki serca 3D na chipie nadaje się do podstawowych badań biologicznych, modelowania chorób oraz, dzięki jego zastosowaniu jako narzędzia przesiewowego, do testów farmaceutycznych.

Aby uzyskać wysoce oczyszczoną populację kardiomiocytów (CMs) z hiPSC, stosuje się zmodyfikowaną wersję protokołu łączącą protokół różnicowania Lian33 oraz etapy oczyszczania Tohyama34 (harmonogram eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1A). W momencie rozpoczęcia różnicowania CM (Rysunek 1B), 3-4 dni po pasażowaniu, hiPSC powinny tworzyć kolonie, osiągnąć konfluencję na poziomie ~85% i być równomiernie rozmieszc...

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie. Tradycyjne modele in vitro opierają się na hodowli jednowarstwowej. Jednak serce, a konkretnie mięsień sercowy lub mięsień sercowy, jest złożone pod względem anizotropii 3D i składu komórkowego.Dlatego tak ważne jest zwiększenie złożoności składu tkanek w modelach in vitro, aby lepiej naśladować zarówno składniki komórkowe, jak i strukturę mięśnia sercowego. W tej pracy demonstrujemy protokół rozwoju 3D dojrzałej tkanki serca ludzkiego serca pochodzącej z komórek macierzystych w nowatorskim urządzeniu mikroprzepływowym. To urządzenie zawiera główny kanał tkankowy 3D z wrodzonymi eliptycznymi mikrosłupkami, które indukują wysoki stopień wyrównania otaczających komórek serca otoczonych hydrożelem.Główny kanał jest otoczony kanałami pożywki z portami iniekcyjnymi, które umożliwiają dyfuzję składników odżywczych w tkance. Ze względu na ostrożność wymaganą przy obchodzeniu się z urządzeniami mikroprzepływowymi, wizualna reprezentacja tego protokołu jest pomocna w prawidłowym ustaleniu tkanki serca 3D w urządzeniu mikroprzepływowym z wbudowanymi mikrosłupkami w celu lepszego wyrównania tkanek. Aby oddzielić ludzki fibroblast serca, najpierw wyjmij kolbę z inkubatora.Umieścić w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozpocząć odsysanie zużytej pożywki z kolby. Następnie weź trzy ml PBS 1X, aby umyć kolbę. Zamknąć nakrętkę i zakręcić kolbą tak, aby dno było odpowiednio pokryte PBS.Zassać PBS. Weź trzy ml trypsyny o temperaturze 37 stopni i dodaj do kolby. Następnie przechylić kolbę i zakręcić tak, aby dno było całkowicie pokryte.Następnie umieść w inkubatorze na cztery do sześciu minut. Zneutralizuj trypsynę za pomocą FGM3, biorąc trzy ML i dodając je do kolby. Pipetować roztwór w górę i w dół, aby usunąć wszelkie komórki, które pozostały na tylnej stronie kolby.Zawiesinę komórkową należy zebrać w probówce Falcon o pojemności 15 ml. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i dozuj do hemocytometru, aby policzyć komórki pod mikroskopem. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 250 G przez cztery minuty.Po odwirowaniu odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy ze świeżym FGM3, aby uzyskać pożądane 75 milionów komórek na zawiesinę ML. Ponownie zawieś ogniwa, a następnie odłóż rurkę z luźno dopasowaną nasadką.Aby oddzielić kardiomiocyty, wyjmij płytkę z inkubatora i odessaj pożywkę. Weź sześć ml PBS i umyj studzienki tak, aby w każdej studzience znajdowała się jedna ML PBS. Zassać PBS, uważając, aby nie naruszyć komórek przyczepionych do płytki.Dodaj sześć ml podgrzanego trypLE Express, tak aby w każdym dołku sześciodołkowej płytki znajdował się jeden ML. Inkubować komórki z trypLE przez 10 minut. Po 10 minutach zneutralizuj trypLE za pomocą sześciu ML RPMI plus B27 plus insulina, tak aby dodawać jeden ML RMPI do każdej studzienki.Użyj jednej pipety ML, aby zebrać roztwór i uderzyć nim w tylną część studzienek, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały podniesione. Zbierz zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 300 G przez trzy minuty.Po odwirowaniu odessać pożywkę i trypLE. Ten krok jest ważny, aby umyć wrażliwe kardiomiocyty. Ten krok zapewnia, że wszystkie trypLE znikają w tworzeniu tkanki serca 3D.Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu ML RPMI plus B27 plus insulina. Użyj pipety o pojemności jednego ml, aby pipetować roztwór w górę iw dół, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do liczenia za pomocą hemocytometru.Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Zassać pożywkę po odwirowaniu po raz drugi. Dodaj odpowiednią ilość RPMI plus B27 plus insulina, aby uzyskać zawiesinę 75 milionów komórek na ML, a następnie ponownie zawiesić.Aby przygotować roztwór kolagenu do kapsułkowania, wszystkie odczynniki należy umieścić w lodówce w kapturze. Następnie weź 75 mikrolitrów kolagenu zapasowego. Kolagen jest bardzo lepki, więc powoli pobieraj go pipetą, a następnie dozuj do probówki mikrowirówkowej na lodzie.Weź 13,85 mikrolitrów RPMI i dodaj do kolagenu w tubce Falcon. Następnie weź 10 mikrolitrów czerwieni fenolowej i dodaj do mieszaniny na lodzie i ponownie zawiesij. Na koniec weź 1,15 mikrolitra jednego normalnego NaOH i dodaj do zawiesiny w celu zneutralizowania.Następnie weź końcówkę do pipety o pojemności 200 mikrolitrów i ponownie zawieś zawiesinę. Kolejnym krokiem jest enkapsulacja komórek w obrębie kolagenu metrożel. Następnie weź porcję ośmiu mikrolitrów CM i dodaj do świeżej rurki Falcon na lodzie.Następnie weź dwa mikrolitry CS i dodaj do tej mieszaniny komórek. Ponownie zawiesić zawiesinę ogniw i chwycić 5,6 mikrolitra zawiesiny ogniw i włożyć do świeżej probówki Falcon. Następnie weź kolagen, który właśnie przygotowałeś, weź cztery mikrolitry kolagenu, a następnie weź 2,4 mikrolitra metrogelu.Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić jednorodny rozkład zawiesiny hydrożelu komórkowego. Po przygotowaniu wstrzyknięcia żelu można go włożyć do urządzeń. Weź nową końcówkę i ponownie zawiesij.Weź szalkę Petriego urządzeń, włóż końcówkę do portu iniekcyjnego i powoli i równomiernie wstrzykuj. Zobaczysz, jak kanał urządzenia wypełnia się zawiesiną hydrożelu komórkowego. Po napełnieniu drugiego portu należy przerwać wstrzykiwanie i wyjąć końcówkę.Po wstrzyknięciu należy obrócić urządzenia pęsetą i umieścić w większej szalce Petriego z wodą w inkubatorze na dziewięć minut. Po dziewięciu minutach wyjmij urządzenia z inkubatora i odwróć je do pozycji pionowej, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze na kolejne dziewięć minut, aby zakończyć polimeryzację hydrożelową. Teraz nadszedł czas, aby dodać media.Weź więc RMPI plus B27 i włóż końcówkę do portu nośnika i zacznij powoli naciskać. Następnie zrób to na przeciwległym porcie nośnika. Może się okazać, że nośnik nie jest wstrzykiwany, więc możesz umieścić kroplę pożywki na górze portu, a następnie wziąć pipetę i użyć podciśnienia, aby przeciągnąć pożywkę z drugiej strony.Zobaczysz więc, jak media zaczną być przeciągane przez kanał. Po dodaniu pożywki do wszystkich kanałów medialnych, urządzenia zostaną ponownie umieszczone w inkubatorze pod kątem 37 stopni. Urządzenie mikroprzepływowe jest pokazane w lewym górnym rogu.Pierwszy, siódmy i czternasty dzień kultury są pokazane na tym obrazie. Po 14 dniach hodowli komórki powinny skondensować się w wysoce wyrównane struktury, które tworzą się wokół mikropostów. Ślady dnia 14 są pokazane tutaj w C spontanicznego skurczu, a także immunofluorescencyjne obrazy tkanek barwionych aktyną i markerami sercowymi.To, co należy zobaczyć, to wysoce wyrównane włókna aktynowe, które tworzą się po 14 dniach w hodowli, a także równoległe prążkowane dojrzałe sarkomery i zlokalizowane połączenia szczelinowe. Podczas tej procedury bardzo ważne jest, aby wszystkie materiały były utrzymywane w niskich temperaturach na lodzie podczas wstrzykiwania hydrożelu komórkowego, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji. Z urządzeniami mikroprzepływowymi należy obchodzić się ostrożnie, zarówno podczas wytwarzania, wstrzykiwania, jak i rozszerzonej hodowli tkankowej.Iniekcje komórek powinny być procesem stałym, aby zapewnić, że cały kanał został wypełniony, a jednocześnie wykonywane szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji lub wysychaniu hydrożelu przed dodaniem pożywki.

developing-3d-organized-human-cardiac-tissue-within-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Tutaj opisujemy protokół do efektywnego tworzenia istotnych dla rozwoju organoidów ludzkiego serca (hHO) przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez samoorganizację. Protokół opiera się na sekwencyjnej aktywacji sygnałów rozwojowych i wytwarza wysoce złożone, funkcjonalnie istotne tkanki ludzkiego serca.

Generowanie samoorganizujących się organoidów ludzkiego serca pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę inżynierii 3D ludzkiej tkanki serca z wykorzystaniem mikroprzepływowych urządzeń z mikrosłupkami. Protokół umożliwia tworzenie anizotropowych modeli mięśnia sercowego do badań biologicznych i testowania leków.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów