Name: Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Odkryj integrację mikroelektrod z mikrofluidyką do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych. Ta metoda umożliwia analizę potencjałów czynnościowych w kontrolowanym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Fundusze Regionalne poprzez COMPETE 2020 - Operacyjny Program na rzecz Konkurencyjności i Internacjonalizacji (POCI), Portugalia 2020, oraz przez fundusze portugalskie za pośrednictwem FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior w ramach projektu PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus był wspierany przez FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar był wspierany przez Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - Promocja Zatrudnienia Naukowego, ESF i MCTES oraz program Investigador FCT, POPH i Fundo Social Europeu. Urządzenia mikroprzepływowe zostały wyprodukowane w INESC - Microsystems and Nanotechnologies w Portugalii pod nadzorem João Pedro Conde i Virginii Chu.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej (UE) 2010/63/UE (transponowaną do ustawodawstwa portugalskiego przez Decreto-Lei 113/2013). Protokół eksperymentalny (0421/000/000/2017) został zatwierdzony przez komisję etyczną zarówno portugalskiego organu urzędowego ds. dobrostanu zwierząt i doświadczeń (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV), jak i instytucji przyjmującej.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i innych roztworów
UWAGA: Świeżo przygotuj roztwory do powlekania w dniu ich użycia. Niewykorzystane roztwory powlekające i pożywki hodowlane mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub 4 °C, jak opisano poniżej.
<ol>
	<li> Przygotować 10 ml 0,05% (v/v) roztworu roboczego z poli(etylenoiminy) (PEI).
	<ol>
		<li>Przygotować 20 ml 0,25% (w/v) roztworu podstawowego PEI, rozpuszczając oczyszczony PEI (patrz tabela materiałów) w sterylnej wodzie.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2 ml 0,25% (w/v) roztworu podstawowego PEI w 8 ml sterylnej wody destylowanej. Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu lamininy o stężeniu 5 μg/ml.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 5 μl roztworu podstawowego lamininy o stężeniu 1 mg/ml w 995 μl podłoża podstawowego (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20°C do 1-2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1 l zbilansowanego roztworu soli Hanka buforowanego przez HEPES (H-HBSS).
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M roztwór HEPES, rozpuszczając 11,9 g proszku HEPES w 50 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 7,2.</li>
		<li>Przygotować roztwór H-HBSS (bez wapnia i magnezu), rozpuszczając 5,33 mM chlorku potasu, 0,44 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 138 mM chlorku sodu, 0,3 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 5,6 mM glukozy w 800 ml ultraczystej wody.</li>
		<li>Dodać 15 ml 1 M roztworu HEPES (końcowe stężenie 15 mM).</li>
		<li>Dostosuj pH do 0,2-0,3 jednostki poniżej pożądanego pH 7,4 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH. Dodaj ultraczystą wodę, aby uzupełnić końcową objętość roztworu. 
		UWAGA: pH ma tendencję do wzrostu podczas filtracji.</li>
		<li>Sterylizuj przez filtrację przy użyciu membrany poli(sulfonu eterowego) (PES) o porowatości 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10 ml H-HBSS zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (hiFBS).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1 ml hiFBS w 9 ml H-HBSS. Dobrze wymieszaj i użyj. Niewykorzystany roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 5 ml roztworu trypsyny o stężeniu 1,5 mg/ml.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem rozpuść 7,5 mg trypsyny w 5 ml H-HBSS. Sterylizuj przez filtrację przy użyciu membrany PES o porowatości 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 50 ml uzupełnionej pożywki.
	<ol>
		<li>W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 48,5 ml podłoża podstawowego (patrz tabela materiałów), 2% (v/v) suplementu B-27, 0,5 mM L-glutaminy i 1% Pen/Strep (10 000 U/ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny). Uzupełnione podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie urządzeń mikroprzepływowych i MEA
UWAGA: Wykonaj kroki 2.1-2.11 w dniu poprzedzającym zasiewanie komórek.
<ol>
	<li>Wyczyść urządzenia mikroprzepływowe, aby usunąć materiał produkcyjny i inne zanieczyszczenia za pomocą taśmy winylowej. Delikatnie dociśnij taśmę do urządzenia, aby dotrzeć do wszystkich obszarów urządzenia.</li>
	<li>Plazma powietrzna czyści MEA przez 3 minuty (0,3 mbar), aby oczyścić powierzchnię i uczynić ją bardziej hydrofilową.</li>
	<li>Na krótko zanurz urządzenia mikroprzepływowe w 70% etanolu i pozwól im wyschnąć na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Umieść każdy MEA na sterylnej szalce Petriego o średnicy 90 mm i wysterylizuj je przez 15 minut ekspozycji na światło ultrafioletowe (UV).</li>
	<li>Pokryj centralną powierzchnię MEA przez inkubację z 500 μl 0,05% (v/v) roztworu PEI przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Zgodnie z opisem other17, powlekanie MEA PEI powoduje mniejsze grupowanie komórek niż przy użyciu powłoki poli(lizyny).</li>
	<li>Odessać roztwór powlekający PEI z powierzchni MEA i przemyć MEA 4x 1 ml sterylnej wody destylowanej. Uważaj, aby nie dotykać powierzchni MEA podczas etapów mycia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod.</li>
	<li>Kierując się mikroskopem stereoskopowym wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, wyśrodkuj chip MEA i dodaj 1 ml sterylnej wody do centralnego obszaru MEA.</li>
	<li>Umieść urządzenie mikroprzepływowe na powierzchni MEA.</li>
	<li>Ostrożnie wyrównaj mikrorowki urządzenia mikroprzepływowego z siatką mikroelektrod MEA.</li>
	<li>Po prawidłowym ustawieniu ostrożnie zassaj nadmiar wody, nie dotykając MEA ani urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Inkubować μEF przez noc w temperaturze 37 °C do wyschnięcia i całkowitego zmocowania. Aby ułatwić mocowanie, delikatnie dociśnij urządzenie mikroprzepływowe do MEA. 
	UWAGA: Wykonaj krok 2.12 w dniu wysiewu komórek.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu μEF załadować studzienki mikroprzepływowe 150 μl 5 μg/ml roztworu powlekającego lamininę i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny przed wysiewem komórek. 
	UWAGA: Podczas ładowania μEF roztworem lamininy należy upewnić się, że roztwór wypełnia mikrorowki. Użyj odkurzacza, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się w mikrorowkach.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie kory przedczołowej
<ol>
	<li>Przygotuj obszar sekcji do usunięcia zarodków.
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj powierzchnię roboczą i narzędzia chirurgiczne 70% etanolem. 
		UWAGA: Chociaż ta sekcja nie jest procedurą sterylną, dezynfekcja pomaga zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.</li>
		<li>Użyj czystej jednorazowej pieluszki, aby ograniczyć obszar sekcji i ułożyć narzędzia chirurgiczne do usunięcia zarodków.</li>
		<li>Przygotować 4 szalki Petriego o średnicy 90 mm wypełnione zimnym H-HBSS i umieścić je na tacy z lodem w pobliżu obszaru sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj eutanazji szczura rasy Wistar w ciąży z E-18 przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ).</li>
	<li>Po zakończeniu procedury należy wyjąć zwierzę z komory CO2 i potwierdzić zgon za pomocą wtórnej metody eutanazji, takiej jak wykrwawienie.</li>
	<li>Połóż zwierzę brzuszną stroną do góry na jednorazowej pieluszce, spryskaj dolną część brzucha 70% etanolem i za pomocą kleszczy i nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery U przez skórę, aby odsłonić macicę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń zarodki z macicy, odcinając tkankę łączną i umieść je na jednej z szalek Petriego z zimnym H-HBSS.</li>
	<li>Usuń każdy zarodek z worka embrionalnego i za pomocą kleszczy i nożyczek odetnij głowę zarodkowi.</li>
	<li>Przenieś głowę zarodka na drugą szalkę Petriego wypełnioną zimnym H-HBSS.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.6 - 3.7 dla każdego zarodka.</li>
	<li>Przeanalizuj korę przedczołową.
	<ol>
		<li>Przenieś głowę zarodka na trzecią szalkę Petriego.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby odsłonić mózg.</li>
		<li>Wyjmij mózg z jamy i przykryj go zimnym H-HBSS.</li>
		<li>Jeśli są obecne, usuń i wyrzuć opuszki węchowe. Wypreparuj korę przedczołową i usuń opony mózgowe.</li>
		<li>Przenieś fragmenty kory przedczołowej na czwartą szalkę Petriego wypełnioną zimnym H-HBSS.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.9.1 - 3.9.5 dla każdego zarodka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dysocjacja i kultura neuronów korowych na μEF
UWAGA: Następujące procedury zostały wykonane wewnątrz okapu z przepływem laminarnym po 15 minutowym cyklu sterylizacji UV. Powierzchnia robocza jak również wszystkie materiały umieszczone wewnątrz okapu powinny być wcześniej zdezynfekowane 70% etanolem.
<ol>
	<li>Jak opisano w kroku 1.5, rozpuść wcześniej zważoną trypsynę w 5 ml H-HBSS i przefiltruj roztwór.</li>
	<li>Zbierz fragmenty kory mózgowej wcześniej wypreparowane w sumie 5 ml H-HBSS. Przenieś je do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 2,3 ml świeżo przygotowanego roztworu trypsyny o stężeniu 1,5 mg/ml do probówki zawierającej fragmenty kory mózgowej.</li>
	<li>Wymieszać zawiesinę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (krótko mieszać co 5 minut).</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie tkanek i wypłucz trypsynę.
	<ol>
		<li>Odrzucić sklarowany osad zawierający trypsynę. Dodaj 5 ml H-HBSS zawierającego 10% hiFBS, aby dezaktywować pozostałą trypsynę; delikatnie poruszyć.</li>
		<li>Pozwól fragmentom kory osiąść, a następnie odrzuć supernatant.</li>
		<li>Dodaj 5 ml H-HBSS, aby usunąć pozostałości hiFBS. Pozwól fragmentom kory osiąść i odrzuć supernatant.</li>
		<li>Ponownie umyj fragmenty kory mózgowej 5 ml H-HBSS.</li>
		<li>Pozwól fragmentom kory osiąść i odrzuć supernatant. Dodać 5 ml uzupełnionej pożywki neuronalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mechanicznie dysocjuj fragmenty kory mózgowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, powoli pipetując w górę iw dół przez 10-15 razy. W razie potrzeby powtórz procedurę za pomocą pipety małego kalibru, aż zawiesina komórek stanie się jednorodna.</li>
	<li>Pozostałe niezdysocjowane tkanki należy odrzucić, filtrując zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Policz żywe komórki i określ gęstość komórek.
	<ol>
		<li>W mikroprobówce dodać 20 μl 0,4% (w/v) błękitu trypanowego do zawiesiny komórek o objętości 20 μl. Dobrze wymieszać w celu homogenizacji roztworu i przenieść 10 μl do komory liczącej Neubauera.</li>
		<li>Policz żywotne komórki i określ gęstość komórek żywotnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj gęstość komórek do 3,6 x 107 komórek/ml (w razie potrzeby odwirować zawiesinę komórek).</li>
	<li>Bezpośrednio przed wysiewem komórek należy usunąć powłokę lamininy ze wszystkich studzienek μEF. Odpipetować 50 μl uzupełnionej pożywki do każdego dołka komory aksonalnej μEF.</li>
	<li>Wysiew: 5 μl zawiesiny komórkowej w komplencie somalnym μEF. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie komórek do substratu.</li>
	<li>Delikatnie napełnij każdą studzienkę μEF podgrzanym dodatkowym podłożem. Przenieś μEF do inkubatora nawilżacza w temperaturze 37 °C zasilanego 5% CO2, 
	UWAGA: Aby uniknąć szybkiego odparowania pożywki hodowlanej, umieść otwartą mikroprobówkę wypełnioną wodą wewnątrz szalki Petriego przenoszącej μEF.</li>
	<li>Utrzymuj kultury przez wymagany okres, wymieniając 50% pożywki co drugi do trzeciego dnia hodowli. 
	UWAGA: Po eksperymentach mikrofluidyki można odłączyć od MEA, zanurzając μEF w wodzie na noc. W razie potrzeby delikatnie oderwij mikrofluidykę za pomocą kleszczy. MEA można czyścić przez nocną inkubację z dostępnym w handlu detergentem enzymatycznym o stężeniu 1% (v/v) (patrz Tabela Materiałów).</li>
</ol>
5. Rejestrowanie spontanicznej aktywności neuronalnej
UWAGA: Embrionalne hodowle neuronów korowych na MEA zazwyczaj wykazują spontaniczną aktywność już po 7 dniach in vitro (DIV), ale potrzebują 2-3 tygodni (14-21 DIV), aby dojrzeć i wykazać stabilną aktywność. To od eksperymentatora zależy, kiedy rozpocząć pomiary elektrofizjologiczne w oparciu o cele badania. W tym protokole rejestrowanie aktywności neuronalnej z μEF jest demonstrowane za pomocą komercyjnego systemu rejestracji (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów), z wbudowanym modułem grzewczym. Do realizacji nagrań korzystaliśmy z ogólnodostępnego oprogramowania (szczegóły w Tabeli Materiałów).
<ol>
	<li>Włącz system nagrywania MEA i regulator temperatury i pozwól, aby podgrzewana płyta podstawy przedwzmacniacza osiągnęła 37 °C. 
	UWAGA: W przypadku nagrań długotrwałych (jednorazowo >30 minut) należy również posiadać system utrzymujący atmosferęCO2</li>.
	<li>Umieść μEF na przedwzmacniaczu (scena główna). 
	UWAGA: Upewnij się, że chip MEA jest prawidłowo wyrównany z numerem referencyjnym w lewym górnym rogu. Używany przez nas układ MEA jest symetryczny obrotowo, ale to wyrównanie jest zgodne z prawidłową orientacją układu pinów elektrod i identyfikatorów sprzętu.</li>
	<li>Zamknij i zatrzaśnij przedwzmacniacz pokrywa</li>.
	<li>Aby nagrywać, otwórz oprogramowanie do nagrywania i zdefiniuj parametry nagrywania oraz ścieżkę nagrywanych strumieni danych (szczegółowe informacje na temat konfiguracji schematu nagrywania znajdują się w instrukcji oprogramowania). 
	UWAGA: Akwizycja z częstotliwością próbkowania 20 kHz jest zazwyczaj wystarczająca dla większości zastosowań. Wyższa częstotliwość próbkowania jest zalecana, jeśli wymagana jest większa precyzja w czasie skoków. Jeśli ktoś zamierza nagrywać tylko skoki, powinien ustawić filtr górnoprzepustowy na 300 Hz, który wytłumi składowe sygnału o niższej częstotliwości. Jeśli nieprzetworzone i przefiltrowane dane są rejestrowane jednocześnie, znacznie zwiększy to rozmiar pliku danych. Zawsze można filtrować nieprzetworzone dane w trybie offline. Aby zmniejszyć rozmiar pliku danych, można również ograniczyć liczbę mikroelektrod, z których można nagrywać (np. tylko mikroelektrody w mikrorowkach).</li>
	<li>Kliknij przycisk Rozpocznij DAQ, aby rozpocząć pobieranie danych. Sprawdź, czy na wyświetlaczu pojawiają się ślady aktywności i rozpocznij nagrywanie. 
	UWAGA: Poziom hałasu jest zwykle nieco wyższy w mikroelektrodach odpowiadających mikrorowkom. Jeśli poziom hałasu jest zbyt wysoki (amplituda międzyszczytowa >50 μV) lub niestabilny w kilku mikroelektrodach, może to być spowodowane brudem utrudniającym dobry kontakt pin-pad. Problem ten jest zwykle rozwiązywany poprzez delikatne czyszczenie styków MEA i pinów przedwzmacniacza za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego 70% etanolem.</li>
	<li>Otwórz nagrany plik w oprogramowaniu analitycznym (patrz tabela materiałów), aby szybko eksplorować dane.</li>
</ol>
6. Analiza danych
UWAGA: Poniższe kroki pokazują, jak korzystać z oprogramowania μSpikeHunter, narzędzia obliczeniowego opracowanego w laboratorium Aguiara (dostępnego bezpłatnie na prośbę e-mailową do pauloaguiar@ineb.up.pt), do analizy danych zarejestrowanych za pomocą μEF. Graficzny interfejs użytkownika (Rysunek 2) służy do wczytywania danych, identyfikowania rozchodzących się fal szczytowych, określania ich kierunku (następczego lub wstecznego) i szacowania prędkości rozchodzenia się. μSpikeHunter jest kompatybilny z plikami HDF5 generowanymi na podstawie nagrań uzyskanych przy użyciu systemów z rodziny MEA2100, które mogą być używane w połączeniu z 60-, 120- i 256-elektrodowymi MEA. Nagrania uzyskane za pomocą eksperymentatora wielokanałowego można łatwo przekonwertować do plików HDF5 za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania (patrz Spis Materiałów).
<ol>
	<li>Kliknij przycisk Przeglądaj, aby wybrać plik nagrania. Następnie kliknij przycisk Informacje o pliku, aby wyświetlić częstotliwość próbkowania, czas trwania nagrywania, a także listę zarejestrowanych strumieni danych (np. dane surowe, przefiltrowane dane). 
	UWAGA: W celu oszacowania rzeczywistej prędkości propagacji zaleca się wybranie strumienia danych surowych do analizy.</li>
	<li>Wybierz mikroelektrody (jednorzędowe lub kolumnowe powiązane z mikrorowkiem) do analizy i ustaw wartość progową wykrywania skoków (faza dodatnia lub ujemna) na 6-krotność odchylenia standardowego (SD) szumu sygnału. Kliknij przycisk Read Data (Odczyt danych), aby zastosować detektor zdarzeń i uzyskać zidentyfikowane sekwencje propagacji. 
	UWAGA: Jeśli kryteria zostaną spełnione, w panelu analizy zostanie wypełniona lista wykrytych sekwencji propagacji. Użytkownik może następnie przeglądać i wchodzić w interakcje z kilkoma narzędziami do analizy sekwencji propagacji, w tym śladami napięcia, korelacjami krzyżowymi między mikroelektrodami, prędkościami propagacji pojedynczej sekwencji, kimografem i narzędziem do odtwarzania dźwięku. Chociaż oszacowanie prędkości propagacji można uzyskać dla dowolnej pary mikroelektrod lub jako średnią oszacowań dla wszystkich par, oszacowanie to jest bardziej wiarygodne, jeśli wybrana zostanie najdalsza para.</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok dla interesujących nas zestawów mikroelektrod. Za każdym razem kliknij Zapisz wszystkie zdarzenia, aby zapisać czas i amplitudę skoków (na każdej z mikroelektrod) dla wszystkich zidentyfikowanych sekwencji propagacji do pliku CSV.</li>
	<li>Zaimportuj pliki CSV do środowisk analizy danych w celu dalszej analizy wzorców aktywności kultury (np. szybkość wypalania, interwały między skokami).</li>
</ol>

<ol><li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2014).</li>
<li>Blau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+promotion+strategies+for+signal+transduction+enhancement+in+microelectrode+array+in+vitro+electrophysiology%3A+An+introductory+overview+and+critical+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).</li>
<li>Jones, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+microelectrode+arrays+and+microelectronics+for+biomedical+research+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).</li>
<li>Bakkum, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+axonal+action+potential+propagation+on+a+high-density+microelectrode+array+across+hundreds+of+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites.</a> Nature Communications. 4, 2181(2013).</li>
<li>Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+recording+of+extracellular+potentials+produced+by+microchannel-confined+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchannels+as+axonal+amplifiers%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microchannels as axonal amplifiers.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).</li>
<li>Dworak, B. J., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+MEA+platform+with+PDMS+microtunnels+enables+the+detection+of+action+potential+propagation+from+isolated+axons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture.</a> Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).</li>
<li>Morin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraining+the+connectivity+of+neuronal+networks+cultured+on+microelectrode+arrays+with+microfluidic+techniques%3A+a+step+towards+neuron-based+functional+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips.</a> Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).</li>
<li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+extracellular+spikes+recordable+from+axons+in+microtunnels%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).</li>
<li>Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+large+extracellular+spikes+in+microchannels+along+many+axonal+sites+from+individual+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons.</a> PLoS One. 10 (3), e0118514(2015).</li>
<li>Narula, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+microtunnel+technology+for+the+isolation+and+precise+identification+of+axonal+communication+among+distinct+hippocampal+subregion+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks.</a> PLoS One. 12 (5), e0176868(2017).</li>
<li>Forro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microstructure+design+to+build+neuronal+networks+of+defined+functional+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity.</a> Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).</li>
<li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).</li>
<li>Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+neuronal+models+for+in+vitro+neurotoxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment.</a> Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).</li>
<li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+culture%2C+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+micro-electrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs).</a> Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neuroscience. 7, 11(2006).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+surface+wettability+of+poly%28dimethyl%29+siloxane+%28PDMS%29+and+glass+under+oxygen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Heiney, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeiney%2C+K+%22%CE%BCSpikeHunter%3A+An+advanced+computational+tool+for+the+analysis+of+neuronal+communication+and+action+potential+propagation+in+microfluidic+platforms%22">μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms</a>. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak złożyć μEF, składający się z urządzenia mikroprzepływowego i MEA ze standardowymi konstrukcjami dostępnymi na rynku, oraz jak analizować zarejestrowane dane.
Projektując eksperyment, naukowcy muszą wziąć pod uwagę, że model in vitro jest ograniczony przez stałą siatkę MEA, która ogranicza układy mikrorowków. Zastosowanie konkretnego projektu mikroprzepływowego lub MEA będzie zależało od konkretnych potrzeb eksperymentalnych, ale ogólnie rzecz...

Zrozumienie komunikacji elektrycznej w obwodach neuronalnych jest podstawowym krokiem do ujawnienia prawidłowego funkcjonowania i opracowania strategii terapeutycznych w celu rozwiązania problemu. Neurony integrują się, obliczają i przekazują potencjały czynnościowe (AP), które rozchodzą się wzdłuż ich cienkich aksonów. Tradycyjne techniki elektrofizjologiczne (np. Patch Clamp) są potężnymi technikami badania aktywności neuronalnej, ale często ograniczają się do większych struktur komórkowych, takich jak soma lub dendryty. Techniki obrazowania stanowią alternatywę dla badania sygnałów aksonalnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale są technicznie trudne do wykonania i nie pozwalają na długoterminowe pomiary1. W tym kontekście, połączenie układów mikroelektrod (MEA) i mikrofluidyki może w znacznym stopniu przyczynić się do ujawnienia podstawowych właściwości aktywności neuronów i transmisji sygnałów w sieciach neuronalnych in vitro2,3.
Technologia MEA opiera się na zewnątrzkomórkowych zapisach kultur neuronalnych. Głównymi zaletami tej metodologii elektrofizjologicznej jest jej zdolność do wspierania długotrwałej, jednoczesnej stymulacji i rejestracji w wielu miejscach i w sposób nieinwazyjny3. MEA są wykonane z biokompatybilnych, wysoce przewodzących i odpornych na korozję mikroelektrod osadzonych w podłożu z płytki szklanej. Są one kompatybilne z konwencjonalnymi powłokami biologicznymi do hodowli komórkowych, które poprzez promowanie adhezji komórek znacznie zwiększają odporność na uszczelnianie między substratem a komórkami3,4. Co więcej, mają wszechstronną konstrukcję i mogą różnić się rozmiarem, geometrią i gęstością mikroelektrod. Ogólnie rzecz biorąc, MEA działają jak konwencjonalne naczynia do hodowli komórkowych, a ich zaletą jest to, że umożliwiają jednoczesne obrazowanie na żywo i zapisy/stymulację elektrofizjologiczną.
Wykorzystanie technologii MEA przyczyniło się do badania ważnych cech sieci neuronowych5. Istnieją jednak nieodłączne cechy, które ograniczają wydajność MEA w badaniu komunikacji i propagacji AP w obwodzie neuronalnym. MEA umożliwiają zapisy z pojedynczych komórek, a nawet struktur subkomórkowych, takich jak aksony, ale w porównaniu z sygnałami somalnymi, sygnały aksonalne mają bardzo niski stosunek sygnału do szumu (SNR)6. Co więcej, cecha wyczuwania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego ze wszystkich źródeł wokół każdej mikroelektrody utrudnia śledzenie propagacji sygnału w obwodzie neuronalnym.
Ostatnie badania wykazały jednak, że lepsze warunki do rejestracji można osiągnąć poprzez ustawienie mikroelektrod w wąskich mikrokanałach, w które mogą rozwijać się aksony. Ta konfiguracja zapewnia znaczny wzrost SNR, dzięki czemu propagujące sygnały aksonalne mogą być łatwo wykryte7,8,9,10,11,12,13. Strategia polegająca na połączeniu urządzeń mikroprzepływowych z technologią MEA tworzy elektrycznie izolowane mikrośrodowisko odpowiednie do wzmacniania sygnałów aksonalnych11. Co więcej, obecność wielu mikroelektrod detekcyjnych wzdłuż mikrorowka ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania i charakteryzowania propagacji sygnału aksonalnego.
Takie platformy in vitro z wysoce kontrolowaną topografią sieci neuronalnej mogą być dostosowane do wielu pytań badawczych14. Platformy te nadają się do stosowania w kontekście kultur neuronalnych, ale można je rozszerzyć w celu inżynierii konfiguracji współkultur, w których komunikacja między neuronami a innymi typami komórek może być monitorowana i oceniana. Taki układ stwarza zatem bardzo interesujące warunki do zbadania szeregu badań związanych z neuronami, takich jak rozwój neurologiczny, obwody neuronalne, kodowanie informacji, neurodegeneracja i neuroregeneracja. Co więcej, jego połączenie z pojawiającymi się modelami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych15,16 może otworzyć nowe możliwości w rozwoju potencjalnych terapii chorób ludzkich, które wpływają na układ nerwowy.
Nasze laboratorium korzysta z tej platformy łączącej mikroelektrody z mikrofluidyką (μEF), aby zrozumieć procesy neuronalne na poziomie komórkowym i sieciowym oraz ich implikacje w fizjologicznym i patologicznym układzie nerwowym. Biorąc pod uwagę wartość takiej platformy w dziedzinie neuronauki, celem tego protokołu jest pokazanie, jak stworzyć podzieloną kulturę neuronalną na MEA zintegrowanych z substratem, jak hodować neurony na tej platformie oraz jak skutecznie rejestrować, analizować i interpretować wyniki takich eksperymentów. Protokół ten z pewnością wzbogaci eksperymentalny zestaw narzędzi dla kultur neuronalnych w badaniach nad komunikacją neuronalną.

<table><tbody><tr><td>B-27 Suplement (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTI17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Rozgałęziony poli(etylenoimin) (PEI), 25 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Oczyszczaj rozgałęziony PEI przez dializę przy użyciu membrany odcinającej 2,5 kDa przez 3 dni w temperaturze 4& C w stosunku do 5 mM roztworu HCl (odnawianego codziennie). Liofilizuj oczyszczony PEI.</td></tr><tr><td>Sitko do komórek (40 &mikro; m)&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki stożkowe (1,5 ml)</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>Pieluszka jednorazowa, 60x40 cm</td><td>Bastos Viegas SA</td><td>455-019</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5, proste</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5/45</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7, zakrzywione</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca Premium</td><td>Biowest</td><td>S181BH-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z Engelbreth-Holm-Swarm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td>Przygotować roztwór podstawowy lamininy w stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając proszek w odpowiedniej objętości nieuzupełnionej pożywki. Przechowywać roztwór lamininy w temperaturze -20 & stopni; C w małych podwielokrotnościach (20 &mikro; L), aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania.</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTID25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszona komora licząca Neubauer (hemocytometr)</td><td>Marienfeld</td><td>630010</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td>Pożywka bazowa stosowana do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Urządzenia mikroprzepływowe PDMS&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Nie dotyczy Składa się z dwóch komór wysiewających połączonych ze sobą 20 mikrorowkami o długości 450 &mu; m długość i czasy; 10 &mu; m wysokość i czasy; 14 &mu; m szerokości wymiarów i oddzielone od siebie 86 &mikro; m (całkowita przestrzeń 100 &mu; m).</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (P/S) (100X)</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca strzykawka PES (&Oslash; 30 mm), 0,22 &mikro; m&nbsp;</td><td>Frilabo</td><td>1730012</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe z polipropylenu, 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe z polipropylenu, 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne z polistyrenu, 10 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe pipety serologiczne jednorazowe, 5 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa membrana z regenerowanej celulozy (2 kDa)&nbsp; &nbsp;</td><td>Spectrum labs</td><td>132107</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td></td></tr><tr><td>Zintegrowane z podłożem płaskie MEA (256 mikroelektrod)</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>256MEA100/30iR-ITO</td><td>252 elektrody rejestrujące z azotku tytanu (TiN) i 4 wewnętrzne elektrody referencyjne zorganizowane w kwadratową siatkę 16 na 16. Każda elektroda nagrywająca ma 30 &mikro; m średnicy i odstępach co 100 &mikro.</td></tr><tr><td>Końcówka strzykawki typu luer-lock, 10 ml&nbsp;</td><td>Terumo Europe</td><td>5100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka strzykawki luer-lock, 50 ml&nbsp;</td><td>Terumo Europe</td><td>8300006682</td><td></td></tr><tr><td>Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287&nbsp;</td><td>Enzymatyczny detergent w proszku stosowany do czyszczenia MEA</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 35 mm&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 90 mm</td><td>Frilabo</td><td>900095</td><td></td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego (0,4%)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (1:250)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>Taśma winylowa 471</td><td>3M</td><td>B40071909</td><td></td></tr></tbody></table>

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Matryce mikroelektrod (MEA) są powszechnie używane do badania funkcji neuronów in vitro. Urządzenia te umożliwiają jednoczesne, nieinwazyjne rejestrowanie/stymulację aktywności elektrofizjologicznej przez długi czas. Jednak właściwość wykrywania sygnałów ze wszystkich źródeł wokół każdej mikroelektrody może stać się niekorzystna, gdy próbujemy zrozumieć komunikację i propagację sygnału w obwodach neuronalnych. W sieci neuronalnej kilka neuronów może być jednocześnie aktywowanych i może generować nakładające się potencjały czynnościowe, co utrudnia rozróżnianie i śledzenie propagacji sygnału. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, stworzyliśmy konfigurację in vitro skoncentrowaną na ocenie komunikacji elektrofizjologicznej, która jest w stanie izolować i wzmacniać sygnały aksonalne z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Łącząc urządzenia mikroprzepływowe i MEA, jesteśmy w stanie podzielić kultury neuronalne na segmenty z dobrze kontrolowanym wyrównaniem aksonów i mikroelektrod. Taka konfiguracja pozwala na nagrywanie propagacji impulsów z wysokim stosunkiem sygnału do szumu w ciągu kilku tygodni. W połączeniu ze specjalistycznymi algorytmami analizy danych zapewnia szczegółową kwantyfikację kilku właściwości związanych z komunikacją, takich jak prędkość propagacji, awaria przewodzenia, szybkość wypalania, skoki następcze i mechanizmy kodowania.
Ten protokół pokazuje, jak stworzyć konfigurację kultur neuronalnych na MEA zintegrowanych z substratem, jak hodować neurony w tym układzie oraz jak skutecznie rejestrować, analizować i interpretować wyniki takich eksperymentów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ustalona konfiguracja upraszcza zrozumienie komunikacji neuronalnej i propagacji sygnału aksonalnego. Platformy te torują drogę nowym modelom in vitro z zaprojektowanymi i kontrolowanymi topografiami sieci neuronalnych. Mogą być stosowane w kontekście jednorodnych kultur neuronalnych lub w konfiguracjach współkulturowych, w których na przykład monitorowana i oceniana jest komunikacja między neuronami czuciowymi a innymi typami komórek. Taki układ stwarza bardzo interesujące warunki do badania, na przykład, rozwoju neurologicznego, obwodów neuronalnych, kodowania informacji, neurodegeneracji i neuroregeneracji.

Stosując opisany tutaj protokół, neurony korowe szczura z dnia E-18 wysiane na µEF są w stanie rozwijać się i zachować żywotność w tych warunkach hodowli przez ponad miesiąc. Już po 3 do 5 dniach hodowli neurony korowe rozwijają aksony przez mikrowyżłowienia w kierunku komory aksonalnej µEF (Rycina 1). Po 15 dniach hodowli oczekuje się, że neurony korowe hodowane na µEF będą wykazywać stabilne poziomy aktywności oraz propagację potencjałów czynnościowych wzdł...

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób połączyć wykorzystanie mikrofluidyki z układami mikroelektrod w celu wygenerowania platformy odpowiedniej do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnału aksonalnego. Cześć, nazywam się Paulo Aguiar i jestem kierownikiem naukowym Laboratorium Neuroinżynierii i Neuronauki Obliczeniowej w INEB, używanym do kodowania inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie w Porto w Portugalii. Zrozumienie transmisji informacji w obwodach neurologicznych pozostaje jednym z największych wyzwań w neurobiologii.Dzisiaj pokażę wam, w jaki sposób możemy połączyć indywidualne układy mikrosiłowników z mikrofluidyką i narzędziami programowymi opracowanymi w naszym laboratorium, aby wykrywać i charakteryzować propagujące potencjały czynnościowe. Używamy tego układu w różnych badaniach, a mianowicie w kodowaniu i dekodowaniu neuronalnym oraz w komunikacji między neuronami czuciowymi a innymi typami komórek. Uważamy, że wizualna demonstracja tego protokołu ma kluczowe znaczenie.Ponieważ montaż układów mikrofluidycznych i mikroelektrod jest trudny w zarządzaniu i trudny do odtworzenia tylko poprzez odtwarzanie protokołów. Dla rynku sprzedaż kulty

interfacing-microfluidics-with-microelectrode-arrays-for-studying

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikrofluidykę można zintegrować ze standardowymi technikami elektrofizjologicznymi, co umożliwia zastosowanie nowych modalności eksperymentalnych. W szczególności motywacją do...

Zastosowanie mikrofluidyki w elektrofizjologii

Niniejszy film opisuje wytwarzanie i zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Urządzenie to jest kompatybilne z...

BioMEMS: nawiązywanie nowych współprac pomiędzy biologami a inżynierami

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Źródło: Vanegas, M. I., et al. System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia urządzenie mikroprzepływowe oparte na mikroelektrodach, które dostarcza roztwór leku przez rurkę kapilarną, wykorzystując roztwór markera na bazie oleju do precyzyjnego śledzenia objętości i umożliwiając jednoczesny zapis neuronowy i wlew leku.

System mikroiniekcji mikroprzepływowej do skojarzonego infuzji leków i elektrofizjologii

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Ostatnie prace odkrywają wpływ neuronów na komórki glejaka dziecięcego (pHGG) wysokiego stopnia i ich wzajemne interakcje. Niniejsza praca pokazuje rozwój modelu in vitro kokulturującego komórki pHGG i neurony glutaminergiczne oraz rejestrującego ich interakcje elektrofizjologiczne w celu naśladowania tych interakcji.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości w urządzeniach mikroprzepływowych w celu oceny interakcji elektrycznych

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania urządzenia opartego na tranzystorze polowym z modulacją ładunku organicznego (OCMFET) do łączenia komórkowego in vitro. Urządzenie, zwane macierzą micro OCMFET, jest elastycznym, tanim i niereferencyjnym urządzeniem, które umożliwi monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej elektroaktywnych kultur komórkowych.

In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Odkryj integrację mikroelektrod z mikrofluidyką do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych. Ta metoda umożliwia analizę potencjałów czynnościowych w kontrolowanym środowisku.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Przeglądaj więcej filmów