Name: Stymulacja plasterków mózgu za pomocą sieci mikroprzepływowej i standardowej komory perfuzyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 58 s
Description: Poznaj metodę stymulacji plasterków mózgu za pomocą mikroprzepływowego urządzenia PDMS zintegrowanego ze standardową komorą perfuzyjną. To rozwiązanie umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową aplikacji neuroprzekaźników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez NIH MH-64611 oraz NARSAD Young Investigator Award. Autorzy chcieliby również podziękować Adamowi Beagleyowi, Markowi Dikopfowi i Benowi Smithowi za pomoc techniczną.

Wytwarzanie formy z SU-8
Przygotowanie roztworu wzorcowego
<ol>
<li>Matryca SU-8 na podłożu z wafla krzemowego jest przygotowywana przy użyciu standardowego dwuetapowego procesu litografii z wykorzystaniem rezystu negatywowego.</li>
<li>Znaki wyrównawcze na waflu krzemowym są usuwane za pomocą żyletki, ponieważ wysokość tych struktur (znajdujących się wzdłuż zewnętrznej krawędzi wafla) jest większa niż wysokość rzeczywistych struktur urządzenia.</li>
<li>Wafer krzemowy jest następnie czyszczony izopropanolem i suszony w strumieniu N2. Filary wspierające wykonane z taśmy o grubości mniejszej niż najwyższa struktura urządzenia zastępują znaki wyrównawcze po czterech stronach wafla. Uwaga: Jeśli wysokość filarów wspierających jest większa niż najwyższe struktury urządzenia, otwory przelotowe nie zostaną utworzone w formie z PDMS. </li>
<li>Matryca z wafla krzemowego zostaje umieszczona na płycie grzejnej w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Przygotowanie roztworu PDMS
<ol>
<li>Cztery gramy roztworu polidimetylosiloksanu (PDMS) przygotowuje się poprzez dokładne wymieszanie 10 części elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza. Uwaga: Należy upewnić się, że oba roztwory zostały wymieszane jednorodnie, aby uzyskać zbliżone właściwości fizyczne w całej formie z PDMS. </li>
<li>Pęcherzyki powietrza powstałe w roztworze PDMS podczas procesu mieszania usuwa się za pomocą desykatora próżniowego.</li>
</ol>
Powlekanie i utwardzanie PDMS
<ol>
<li>Pozbawiony pęcherzyków powietrza roztwór PDMS jest powoli dozowany na matrycę SU-8, dbając o to, aby podczas procesu dozowania nie powstały pęcherzyki.</li>
<li>Jeden koniec folii przezroczystej do pisania jest następnie kładziony na płycie grzewczej i powoli opuszczany na roztwór PDMS, aby równomiernie rozprowadzić PDMS na matrycy SU-8. Wszelkie pęcherzyki powstałe podczas tego procesu należy usunąć za pomocą sondy. [Uwaga: Nie należy podnosić folii, aby zapobiec powstawaniu kolejnych pęcherzyków.] </li>
<li>Na arkuszu folii kładzie się płytkę borofloat, aby zastosować jednolity nacisk. Delikatnie naciska się górną powierzchnię najwyższych struktur okrągłych (znajdujących się w połowie długości kanałów i wycentrowanych wzdłuż ich szerokości) w taki sposób, aby między folią a powierzchnią SU-8 struktur okrągłych znajdowała się minimalna ilość PDMS lub nie było go wcale.</li>
<li>Trzy kolejne płytki borofloat są kładzione na zestaw składający się z wafla krzemowego i płytki borofloat, aby zastosować stały nacisk na górną powierzchnię struktur z okrągłymi otworami przed i w trakcie procesu sieciowania.</li>
<li>Temperaturę płyty grzewczej zwiększa się następnie do 75°C i PDMS jest sieciowany w tej temperaturze przez 1 godzinę. Następnie temperaturę płyty grzewczej obniża się do 50°C.</li>
<li>Płytki są usuwane, a folię przezroczystą ostrożnie zdejmuje się, pozostawiając matrycę oraz pokrywającą ją cienką warstwę PDMS.</li>
</ol>
Konstrukcja urządzenia mikrofluidycznego
Usuwanie arkusza PDMS z matrycy
<ol>
<li>Zewnętrzna granica komory perfuzyjnej zostaje wycięta w arkuszu PDMS za pomocą żyletki, po uprzednim dopasowaniu portów komory perfuzyjnej do portów na matrycy SU-8.</li>
<li>Następnie arkusz PDMS jest ostrożnie oddzielany od matrycy, poprzez odciąganie wzdłuż kanałów, aby zapobiec rozdarciu PDMS. Arkusz PDMS zostaje umieszczony na folii przezroczystej powierzchnią sieci mikrofluidycznej skierowaną do góry.</li>
<li>Następnie za pomocą wycinaka do korków wykonuje się porty wlotowe i wylotowe.</li>
</ol>
Przyklejanie arkusza PDMS do szkiełka przedmiotowego
<ol>
<li>Powierzchnię wiązania arkusza PDMS (powierzchnię zawierającą sieć mikroprzepływową) oraz szklaną lamelkę należy delikatnie oczyścić za pomocą taśmy klejącej 3M, położyć na folii przezroczystej, a następnie umieścić w komorze z plazmą O2.</li>
<li>Powierzchnie wiązania poddaje się działaniu plazmy o mocy 165 W przez 10 s. Powierzchnię szklanej lamelki potraktowaną plazmą należy niezwłocznie połączyć z powierzchnią arkusza PDMS potraktowaną plazmą. Uwaga: Należy lekko docisnąć powierzchnię szkła, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między powierzchniami wiązania. </li>
<li>Należy odczekać 5 minut, aby uzyskać trwałe połączenie między PDMS a szkłem. Po upływie 5 minut należy delikatnie usunąć folię przezroczystą, na której umieszczono arkusz PDMS w procesie wiązania.</li>
<li>Urządzenie mikroprzepływowe umieszcza się w systemie plazmy tlenowej, aby uczynić kanały hydrofilowymi. Obróbka plazmowa jest przeprowadzana przy mocy 165 W przez 1 minutę.</li>
</ol>
Integracja urządzenia mikrofluidycznego z komorą perfuzyjną
Przygotowanie komory perfuzyjnej
<ol>
<li>Zamówiono gotową komorę perfuzyjną, a następnie nawiercono otwory wlotowe i wylotowe w taki sposób, aby po połączeniu urządzenia mikroprzepływowego z komorą porty obu elementów były ze sobą zrównane. Dolną powierzchnię komory perfuzyjnej powleczono PDMS w celu uzyskania szczelnego połączenia między komorą a urządzeniem mikroprzepływowym.</li>
<li>Arkusz folii przezroczystej do pisania naniesiono na płytkę grzejną w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przygotowano jeden gram roztworu PDMS w procesie analogicznym do opisanego wcześniej. Roztwór PDMS pozbawiony pęcherzyków powietrza powoli naniesiono na arkusz folii, unikając tworzenia pęcherzyków.</li>
<li>Na roztwór PDMS położono komorę perfuzyjną.</li>
<li>Na wierzchu komory umieszczono płytkę z borofloat, aby przyłożyć równomierny nacisk i uzyskać cienką warstwę PDMS na dolnej powierzchni komory.</li>
<li>Następnie zwiększono temperaturę płytki grzejnej do 75°C i utwardzano PDMS w tej temperaturze przez 1 godzinę.</li>
</ol>
Łączenie urządzenia mikroprzepływowego i komory perfuzyjnej
<ol>
<li>Płytę usuwa się, a następnie delikatnie zdejmuje folię transparentną, pozostawiając komorę perfuzyjną oraz cienką warstwę PDMS pokrywającą jej dolną powierzchnię. Nadmiar PDMS usuwa się za pomocą żyletki, a z portów dostępowych przy użyciu ostrej sondy.</li>
<li>Powierzchnia PDMS urządzenia mikroprzepływowego oraz dolna powierzchnia PDMS komory są następnie delikatnie oczyszczane za pomocą taśmy 3M, kładzione na arkusz folii transparentnej, a na koniec umieszczane w komorze plazmy tlenowej.</li>
<li>Powierzchnie poddaje się działaniu plazmy o mocy 165 W przez 10 s. Powierzchnia komory pokryta PDMS jest niezwłocznie łączona z powierzchnią PDMS urządzenia mikroprzepływowego. Uwaga: Należy delikatnie nacisnąć powierzchnię szklaną, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między łączonymi powierzchniami. </li>
<li>Bezpośrednio przed użyciem urządzenie umieszcza się w systemie plazmy tlenowej, aby uczynić kanały hydrofilowymi. Traktowanie plazmą wykonuje się przy mocy 165 W przez 1 minutę.</li>
</ol>
Ekspozycja przekrojów mózgu na mikrośrodowisko neurochemiczne przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego
<ol>
<li>Hydrofilowe mikrokanały zestawu (microfluidic device)-(perfusion chamber) wypełnia się standardowym roztworem ACSF (sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego).</li>
<li>W portach wlotowych nanosi się małe krople roztworu ACSF, pozwalając na wciągnięcie płynu do kanałów. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza usuwa się za pomocą strzykawki z portu wylotowego. W porcie wylotowym nanosi się dużą kroplę roztworu ACSF, aby umożliwić pasywne pompowanie płynów z portów wlotowych do wylotowych urządzenia mikroprzepływowego. Uwaga: Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza z kanałów, aby umożliwić przepływ płynów metodą pasywnego pompowania. </li>
<li>Zestaw (microfluidic device)-(perfusion chamber) mocuje się na płaskiej platformie, a platformę mocuje się w adapterze mikroskopu.</li>
<li>Standardowe przewody wlotowe i wylotowe (ssące) podłącza się do komory perfuzyjnej w celu ciągłej perfuzji skrawka mózgu standardowym roztworem ACSF. Roztwór ACSF jest stale napowietrzany mieszanką 95% O2-5% CO2. Uwaga: Należy dostosować położenie przewodu ssącego, aby utrzymać stały poziom ACSF w kąpieli komory perfuzyjnej. </li>
<li>Po wypełnieniu komory perfuzyjnej roztworem ACSF, za pomocą zakraplacza umieszcza się w niej skrawka mózgu. Używając sondy, pozycjonuje się skrawek mózgu nad okrągłymi otworami w urządzeniu mikroprzepływowym. Gdy skrawek mózgu znajdzie się w pożądanej pozycji nad otworami, należy go unieruchomić za pomocą kotwicy do skrawków.</li>
<li>Urządzenie mikroprzepływowe może teraz zostać użyte do poddawania skrawków mózgu (umieszczonych w komorze perfuzyjnej na górze sieci mikroprzepływowej) działaniu różnych neuroprzekaźników poprzez pasywne pompowanie płynów.</li>
</ol>

<ol><li>Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+PDMS+microfluidic+chamber+for+controlling+brain+slice+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment.</a> Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).</li>
<li>Walker, G. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+pumping+method+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A passive pumping method for microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).</li>
</ol>

Autorzy są otwarci na współpracę w zakresie zastosowania zaprezentowanej technologii mikroprzepływowej w różnych dziedzinach biologii.

Istniejące komory do perfuzji skrawków mózgu w skali makro i mikro są ograniczone pod względem rozdzielczości przestrzennej podczas podawania neuroprzekaźników na skrawki mózgu. Przedstawiona tutaj technologia urządzeń mikroprzepływowych pozwala pokonać to ograniczenie dzięki zastosowaniu prostych technik bioMEMS. Przewiduje się, że prostota wykonania urządzenia mikroprzepływowego oraz łatwość jego integracji z istniejącymi zestawami do elektrofizjologii umożliwią szerokie zastosowanie zaprezentowanej technologii. Dzięki...

<table><tbody><tr><td>RC-26GPL</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0236</td><td>Komora rejestracyjna RC-26GLP z niskim profilem i dużą kąpielą</td></tr><tr><td>SHD-26GH/10</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0253</td><td>Stalowy przycisk do skrawków dla RC-26G, odstęp między gwintami 1,0 mm</td></tr><tr><td>PDMS (polidimetylosiloksan)</td><td>Odczynnik</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Zestaw do elastomeru silikonowego</td></tr><tr><td>Plasma Preen-II 862</td><td>Narzędzie</td><td>Plasmatic Systems, Inc.</td><td></td><td>Mikrofalowy system plazmowy</td></tr><tr><td>Model P-1</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0277</td><td>Zwykła platforma z serii 20, Model P-1</td></tr><tr><td>SA-NIK</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0291</td><td>Adapter dla Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK</td></tr><tr><td>Natleniony, podgrzany ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy)</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Dokładny skład będzie się różnić w zależności od zastosowania</td></tr></tbody></table>

stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

Wykazaliśmy możliwość wykonania dwupoziomowego urządzenia mikrofluidycznego, które można łatwo zintegrować z istniejącymi układami do elektrofizjologii. Dwupoziomowe urządzenie mikrofluidyczne jest wytwarzane przy użyciu standardowego dwuetapowego procesu litografii z wykorzystaniem rezystu negatywowego 1. Pierwszy poziom zawiera mikrokanały z portami wlotowymi i wylotowymi na obu końcach. Drugi poziom zawiera mikroskalowe otwory okrągłe, rozmieszczone w połowie długości kanału i wycentrowane względem jego szerokości. Do pompowania płynów z portu wlotowego do portu wylotowego stosowana jest metoda pompowania pasywnego 2. Urządzenie mikrofluidyczne jest zintegrowane z gotowymi komorami perfuzyjnymi, co pozwala na bezproblemowe połączenie z układem elektrofizjologicznym. Płyny wprowadzone przez porty wlotowe przepływają przez mikrokanały w kierunku portów wylotowych, a także wydostają się przez okrągłe otwory znajdujące się nad mikrokanałami do kąpieli perfuzyjnej. W ten sposób dolna powierzchnia skrawka mózgu umieszczonego w kąpieli komory perfuzyjnej nad urządzeniem mikrofluidycznym może być eksponowana na działanie różnych neurotransmiterów. Mikroskalowa grubość urządzenia mikrofluidycznego oraz transparentność materiałów [szklana lamella i PDMS (polydimethylsiloxane)] użytych do jego wykonania umożliwiają mikroskopię skrawka mózgu. Urządzenie mikrofluidyczne pozwala na modulację (zarówno przestrzenną, jak i czasową) bodźców chemicznych wprowadzanych do mikrośrodowiska skrawka mózgu.

Prezentujemy sposób wykonania prostego urządzenia mikroprzepływowego, które można zintegrować ze standardowymi zestawami do elektrofizjologii, aby w kontrolowany sposób eksponować mikroskalowe powierzchnie skrawka mózgu na działanie różnych neuroprzekaźników.

Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Wykazaliśmy sposobność wykonania dwupoziomowego urządzenia mikroprzepływowego, które można łatwo zintegrować z istniejącymi układami do elektrofizjologii. ...

Głównym celem projektu, który zaprezentujemy dzisiaj, jest uzyskanie możliwości przestrzennej i czasowej kontroli stymulacji mózgu. Kolejnym kluczowym aspektem jest to, że dzięki zastosowaniu prostej modyfikacji w już i tak skomplikowanym układzie elektrofizjologicznym, możemy udostępnić to urządzenie mikroprzepływowe różnym laboratoriom, które faktycznie wykorzystują stymulację mózgu. Witam, nazywam się Java Chek Mohammad z laboratorium Edingtona w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois w Chicago.Dzisiaj pokażę Państwu, w jaki sposób zastosujemy prosty, mikrofabrykowany układ mikroprzepływowy do stymulacji skrawków mózgu. Urządzenie do skrawków mózgu, które dzisiaj zaprezentujemy, jest bardzo użyteczne z kilku powodów; głównym z nich jest jego modułowość, dzięki której może ono zostać wkomponowane w istniejącą konfigurację elektrofizjologiczną bez konieczności wprowadzania dodatkowych modyfikacji. Ponadto pozwala ono uniknąć stosowania przewodów i pomp, które komplikują konstrukcję każdego układu mikroprzepływowego.Ponieważ stosujemy metodę pompowania pasywnego, nie potrzebujemy żadnych przewodów ani pomp. Po trzecie, jest to po prostu cienka arkuszowa membrana z PDMS, którą umieszcza się pomiędzy szkiełkiem nakrywką a standardową komorą perfuzyjną, stosowaną w typowym układzie do elektrofizjologii. Procedura, którą zaprezentuję dzisiaj, rozpoczyna się od matrycy SU-8, wykonanej przy użyciu standardowego procesu litografii SU-8.Matryca, którą mamy dzisiaj, jest matrycą dwupoziomową, gdzie jeden poziom zawiera projekt kanałów, czyli mikrokanałów, a drugi projekt otworów przelotowych (via), które znajdują się nad tymi kanałami, tak aby roztwory przepływające przez kanały mogły wypływać przez otwory przelotowe. Tworzymy taką matrycę na waflu krzemowym, a następnie używamy silikonu lub PDMS, który wylewamy na górę tego urządzenia, aby odcisnąć struktury znajdujące się na waflu w PDMS. Zatem wylejemy PDMS na górę tego urządzenia.Następnie pobieramy membranę PDMS, która utworzyła się po utwardzeniu i została przyklejona do szkiełka nakrywkowego. W ten sposób otrzymujemy nasze urządzenie mikroprzepływowe. Następnie zmodyfikujemy standardową komorę perfuzyjną, nanosząc cienką warstwę PDMS na dno komory.Kiedy już dysponujemy zmodyfikowaną komorą perfuzyjną, bierzemy wcześniej wykonane urządzenie mikroprzepływowe i przytwierdzamy je do komory perfuzyjnej. W procesie wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego istnieją dwa krytyczne punkty. Po pierwsze, przed nałożeniem PDMS należy wyłączyć płytkę grzejną, aby PDMS nie utwardził się natychmiast po wylaniu go na podłoże krzemowe.Kolejnym istotnym punktem jest to, że podkładki stosowane w czterech narożnikach wafla krzemowego powinny mieć wysokość mniejszą niż najwyższa struktura na waflu. Ma to zapewnić uzyskanie otworów VR podczas procesu utwardzania PDMS. Znajdujemy się obecnie w modułowej czystej ścianie (soft wall modular clean room), a to jest matryca, którą wykonaliśmy przy użyciu standardowego procesu litografii C8.Jest to dwupoziomowy układ, w którym pierwszy poziom zawiera projekt kanałów z czterema wlotami i jednym wylotem. W środkowej części wszystkich czterech kanałów znajdują się przelotki lub słupki znajdujące się nad kanałami. Są to znaki wyrównawcze utworzone podczas procesu wykonania.A teraz pokażę, w jaki sposób usunę go i przeprowadzę utwardzanie PDMS. Ze względu na efekt krawędziowy (edge bead effect) grubość na zewnętrznym obwodzie wafla jest większa niż w przypadku samych urządzeń w centrum. Dlatego usuniemy te znaczniki wyrównawcze za pomocą żyletki, a następnie, aby zapewnić odpowiednie obciążenie, zastosujemy przekładki o wysokości 140 micron, które umieścimy w czterech narożnikach wafla.Należy upewnić się, że żyletka nie zbliży się do samych urządzeń. Teraz usunę cząsteczki SVA za pomocą sprężonego powietrza, zatem wafer jest już gotowy do przygotowania formy z PDMS. Przed przystąpieniem do tego kroku musimy jednak umieścić dystansory o wysokości 140 micron.Następnie przykleję cztery kawałki taśmy w czterech narożnikach wafla. Potem upewnię się, że taśma odpowiednio przylega do wafla. Powodem, dla którego zastosowano taśmę o grubości 140 micron, jest fakt, że dwupoziomowy wzorzec z kanałami i VS ma wysokość 150 micron.Kładąc obciążnik na PDMS podczas jego utwardzania, chcemy mieć pewność, że arkusz PDMS będzie płaski. W związku z tym w narożnikach stosujemy cztery dystanse o tej samej wysokości. Teraz pokażę, w jaki sposób będziemy przygotowywać i utwardzać PDMS, aby wykonać urządzenia.Zanim jednak to zrobię, pokażę Państwu, w jaki sposób przygotowaliśmy roztwór PDMS. Odmierzamy 10 części bazy oraz jedną część utwardzacza i dokładnie je mieszamy. W procesie mieszania w roztworze PDMS powstaje wiele pęcherzyków powietrza; aby je usunąć, umieścimy PDMS w eksykanie. Po pozostawieniu PDMS w eksykanie przez 10 minut pęcherzyki znikają.PDMS jest już gotowy do utwardzania. Teraz pokażę, w jaki sposób nałożymy PDMS na wafer i utwardzimy go, aby uzyskać membranę z PDMS. Nałożę PDMS na wafer, a następnie użyję tej folii przezroczystej, aby go przykryć.Pomoże nam to usunąć wspornik urządzenia, oddzielić urządzenie od folii transparentnej, a następnie położę obciążniki na folii. Powodem zastosowania obciążników jest uzyskanie jednolitej grubości PDMS. Kolejną kluczową kwestią jest uzyskanie otworów przelotowych (via).Zatem w każdym miejscu, w którym znajdują się otwory wentylacyjne (vs), nie chcemy obecności PDMS, a obciążniki pomogą nam tego osiągnąć. Jak widać, płyta grzejna jest wyłączona, ponieważ nie chcemy, aby PDMS utwardził się natychmiast, dlatego pozostawiamy ją wyłączoną. Następnie należy upewnić się, że podłoże krzemowe jest płaskie przed naniesieniem PDMS.Teraz możemy nanieść przygotowany wcześniej PDMS. Należy dozować PDMS wystarczająco blisko wafla, aby nie powstawały pęcherzyki powietrza. Najważniejszym elementem jest tutaj sposób nałożenia folii przezroczystej na PDMS.Należy upewnić się, że podczas nakładania arkusza nie powstaną pęcherzyki powietrza. Teraz położę jeden z tych szkiełek przedmiotowych, aby nadmiar PDMS mógł wypłynąć. Kładę trzy kolejne szkiełka przedmiotowe, aby upewnić się, że nie przesuną się one w przypadku tego konkretnego matryca.W przypadku tych konkretnych elementów ustaliliśmy, że umieszczenie czterech szklanych płytek pozwala na odprowadzenie nadmiaru PDMS ze szczeliny między warstwą transparentną a waflami. Oczekujemy od jednej do dwóch minut, a następnie możemy uruchomić płytę grzewczą. W zależności od zastosowanych matryc i projektów może być konieczne zwiększenie lub zmniejszenie liczby szklanych płytek, aby uzyskać odpowiednie otwory przelotowe. Płyta grzewcza jest teraz gotowa do włączenia i ustawiam temperaturę na 75 °C.Po osiągnięciu temperatury 75°C można ustawić timer na jedną godzinę i pozostawić PDMS do utwardzenia. Po utwardzeniu PDMS przez jedną godzinę należy wyłączyć płytkę grzejną i pozwolić jej ostygnąć do 50°C. Jest to konieczne, aby zapobiec pękaniu SEA.Jeśli natychmiast obniżymy temperaturę z 75 stopni do temperatury pokojowej, możemy teraz wyłączyć urządzenie i poczekać, aż spadnie ona do 50 stopni Celsjusza. Gdy temperatura płyty grzejnej spadnie do 50 stopni Celsjusza, możemy zdjąć obciążniki z folii przezroczystej. Teraz możemy zdjąć wafelek z płyty grzejnej i jest on gotowy do cięcia.Arkusz PDMS jest już gotowy do zdjęcia z matrycy C8 i musimy usunąć folię aluminiową. Następnie należy usunąć folię przezroczystą. Otrzymaliśmy w ten sposób standardową komorę perfuzyjną.Zmodyfikowaliśmy go w taki sposób, aby umożliwić jego wyrównanie. Otwory, porty wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego. Są to cztery porty wlotowe i jeden port wylotowy na membranie z PDMS.Powinny one odpowiadać czterem wlotom i jednemu wylotowi w komorze perfuzyjnej. Teraz wsunę komorę perfuzyjną i wyrównam ją z otworami w membranie PDMS. Po ich wyrównaniu całość jest gotowa do wycięcia.Teraz można wyjąć komorę, używając sondy. Upewnij się, że wszystkie krawędzie membrany PDMS są wolne i można je usunąć. Po wykonaniu tej czynności można użyć zamrażarki, aby usunąć membranę PDMS; podczas zdejmowania PDMS z górnej części urządzenia należy przesuwać go bardzo powoli, aby nie przerwać membrany PDMS.Teraz umieszczę na wierzchu membranę PDMS z wgłębieniami utworzonymi za pomocą matryc SC eight, dbając o to, aby była ona płaska. Robimy to, aby podczas wykonywania otworów – portów wlotowego i wylotowego – powierzchnia PDMS po stronie, która zostanie zlutowana z szkiełkiem nakrywką, nie była chropowata.Musimy upewnić się, że wnęki znajdują się po górnej stronie. Teraz możemy stworzyć otwory wlotowy i wylotowy, aby otwory były wyraźnie widoczne. Wprowadzamy czarne tło.Teraz przygotuję porty wlotowe i wylotowe; należy upewnić się, że w obrębie portów nie pozostał żaden PDMS. Zatem usuwamy wszelkie pozostałości PDMS. Teraz przeniesiemy membranę z PDMS na kolejną folię przezroczystą.Następnie możemy poddać działaniu plazmy arkusz oraz szkiełko nakrywkowe, kładąc je w taki sposób, aby zagłębienia nadal znajdowały się u góry. Gdy powierzchnia arkusza i szkiełko nakrywkowe zostaną potraktowane plazmą, możemy połączyć te dwie powierzchnie w celu utworzenia sieci mikroprzepływowej i usunięcia pęcherzyków powietrza spod arkusza PDMS. Do zapewnienia szczelności można użyć taśmy klejącej.Zapewni to, że arkusz PDMS będzie płaski, a wiązanie przebiegnie znacznie efektywniej. Następnie ponownie użyj taśmy klejącej na górnej powierzchni, aby usunąć wszelki kurz z membrany PDMS. Teraz możemy położyć szkiełko nakrywkowe, które zostanie połączone z membraną PDMS.Teraz obie próbki PDMS oraz szkło są gotowe do obróbki plazmą. Przetraktujemy plazmą PDMS i szkiełko przykrywowe, używając tego zmodyfikowanego mikrofalowego systemu plazmowego, w którym szklana komora umożliwia wytworzenie plazmy wewnątrz mikrofalówki. Umieśćmy próbki wewnątrz, tworząc próżnię w komorze.Teraz mogę wpuścić tlen. System plazmowy jest już gotowy; w celu wizualizacji plazmy w tym konkretnym układzie zastosuję moc 10% i czas 10 sekund. W trakcie trwania obróbki plazmowej zwiększyliśmy moc do 100% i wyłączyliśmy światła.A teraz można zobaczyć plazmę bezpośrednio po obróbce plazmowej. Należy niezwłocznie połączyć obie powierzchnie, szkiełko przykrywowe i PDMS, w przeciwnym razie powierzchnia PDMS utraci hydrofilowość uzyskaną dzięki obróbce plazmowej. Po ułożeniu szkiełka przykrywowego upewnij się, że cała powierzchnia jest ze sobą ściśle połączona, bez pęcherzyków powietrza.Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, można je usunąć. Teraz odstawiamy zestaw na pięć minut, aby nastąpiło związanie. Oto zmodyfikowana komora perfuzyjna, w której zmodyfikowano podstawę komory za pomocą PDMS.Zostało to wykonane wcześniej. Umieściliśmy folię przezroczystą na wyłączonej płycie grzewczej, a następnie wylaliśmy PDMS, który został przygotowany w sposób analogiczny do opisanego wcześniej.Następnie umieściliśmy komorę perfuzyjną na wierzchu PDMS, a potem położyliśmy pojedynczy ciężarek, jak pokazano tutaj, i pozostawiliśmy do utwardzenia przez 30 minut w temperaturze 75 °C. Teraz, podczas gdy czekamy na połączenie PDMS z szkiełkiem nakrywką, pokażę, jak można przygotować komorę. W ten sposób będziemy mogli połączyć komorę z urządzeniem mikroprzepływowym.Należy usunąć nadmiar PDMS z miejsc, w których nie jest on potrzebny. Najpierw zdejmij folię ochronną, a następnie usuń PDMS. Następnie należy usunąć PDMS z portów wlotowego i wylotowego. Teraz komora jest gotowa do połączenia z przygotowanym wcześniej urządzeniem mikroprzepływowym.Po odczekaniu pięciu minut urządzenie mikroprzepływowe jest gotowe do oddzielenia od folii przezroczystej, jednak należy upewnić się, że folia jest usuwana powoli. Dzięki temu PDMS i szkiełko nakrywka nie rozdzielą się. Po przygotowaniu komory perfuzyjnej należy poddać działaniu plazmy dolną powierzchnię komory, w której właśnie naniesiono PDMS, oraz górną powierzchnię urządzenia mikroprzepływowego z nałożonym PDMS.Teraz umieścimy oba te elementy w komorze plazmowej i przeprowadzimy traktowanie plazmą przy mocy 10% przez 10 sekund. Obie powierzchnie zostały teraz poddane działaniu plazmy i są gotowe do połączenia. Przed połączeniem należy upewnić się, że porty wlotowe i wylotowe w komorze są wyrównane z urządzeniem mikrofluidycznym.Ponieważ wyrównywane elementy są wystarczająco duże, nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt i można to wykonać gołym okiem. Po wyrównaniu i umieszczeniu elementu na komorze, należy upewnić się, że wszystkie powierzchnie stykają się, a następnie pozostawić go na pięć minut. Po odczekaniu pięciu minut wiązanie będzie wystarczająco trwałe do przeprowadzenia eksperymentów.Po połączeniu urządzenia mikroprzepływowego z komorą, nadamy powierzchniom kanałów właściwości hydrofilowe. Dzięki temu roztwór A CFS lub inne neuroprzekaźniki będą mogły przepływać przez nie łatwiej. W tym celu umieszczę całe urządzenie w plazmie i poddam je działaniu plazmy przez jedną minutę przy 10%, tak aby wszystkie wewnętrzne powierzchnie kanałów stały się hydrofilowe.Następnie napełnię go wodą i przeniosę do zestawu elektrofizjologicznego, abyśmy mogli przeprowadzić właściwe eksperymenty. Dobrze, teraz jesteśmy gotowi, aby przejść do zestawu elektrofizjologicznego i faktycznie użyć tego urządzenia z przekrojem mózgu. Cześć, nazywam się uo.Współpracuję z dr Arrington i dr Fall z Katedry Bioinżynierii na Uniwersytecie Illinois. Teraz będę pracować z urządzeniem micro free, które przyniosłem i umieściłem na tej platformie. Po jednej stronie widzimy przewody perfuzyjne.Z drugiej strony widoczna jest rurka ssąca. Urządzenie zostanie przepłukane roztworem płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), napowietrzonym mieszanką 95% tlenu i 5% CO2. Teraz, gdy urządzenie micro V jest gotowe, pobiorę plasterki mózgu, a następnie umieszczę je na urządzeniu mikro.Teraz umieszczę przekrój mózgu na górze okrągłych otworów, a następnie użyję kotwicy, aby go unieruchomić. Po unieruchomieniu przekroju mózgu zastosuję neuroprzekaźniki w celu jego stymulacji. W tym miejscu znajdują się cztery wloty, więc wprowadzę neuroprzekaźnik do każdego z nich, wykorzystując pompowanie pasywne z tych czterech wlotów do tego wylotu.A teraz dr Fall opowie o tym urządzeniu oraz o tym, dlaczego jest ono dla nas tak ważne. Cześć, jestem Chris Fall i zajmujemy się fizjologią mózgu.Powodem, dla którego musimy stosować przekroje mózgu, jest możliwość dostępu za pomocą mikroelektrod oraz technologii obrazowania. Do tej pory jedynym sposobem zmiany środowiska neuroprzekaźników w tych przekrojach mózgu była zmiana przepływu nad całym przekrojem lub bezpośrednie podawanie neuroprzekaźników za pomocą bardzo małej mikropipety. Dlatego jesteśmy bardzo zadowoleni z możliwości współpracy z grupą Eddingtona.Ta nowa technologia pozwoli nam na oddziaływanie na duże obszary mózgu i lokalną zmianę środowiska neuroprzekaźników. Następnie będziemy mogli jednocześnie zastosować elektrody oraz technologię obrazowania, a w przyszłości być może zintegrować urządzenia do wielokanałowych rejestracji elektrodowych w jednej jednostce. Tutaj widać przekrój mózgu myszy w urządzeniu mikroprzepływowym.Można zauważyć nawet gołym okiem, że mózg składa się z wielu różnych obszarów. Obszary te pełnią odmienne funkcje. W żywym organizmie te różne regiony mózgu charakteryzują się odmiennym poziomem neuromodulacji i stężeniem neuroprzekaźników.Chcemy mieć możliwość powtórzenia tego w naszej komorze do skrawków podczas wykonywania rejestracji elektrofizjologicznych oraz obrazowania. Dlatego niezwykle ważne jest móc oddziaływać na te różne obszary za pomocą różnych neuroprzekaźników, w różnych stężeniach i w różnych ramach czasowych. Ponieważ nie możemy bezpośrednio wizualizować neuroprzekaźników, pokażemy tutaj przykład barwnika fluorescencyjnego, który jest wpompowywany w różne regiony skrawka mózgu.W tym filmie obserwujemy przepływ fluorescencyjnego barwnika przez kanały urządzenia i wizualizację jego wypływu z wykonanych porów. Nawet w tym wczesnym prototypie widać, jak precyzyjna jest rozdzielczość przestrzenna przepływu. Obserwując film, zobaczą Państwo barwnik wpływający do kanałów, a następnie wypływający przez otwory, po czym barwnik zostanie wypłukany, co pozwoli ocenić rozdzielczość czasową przepływu.Dziękujemy za dołączenie do nas. Myślę, że udało nam się zademonstrować, w jaki sposób mikrofluidyka, a wręcz mikro maszyny, mogą zostać połączone z tradycyjnymi technikami fizjologicznymi, aby pomóc nam zrozumieć, jak działa mózg. Dziękuję.

brain-slice-stimulation-using-microfluidic-network-standard-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Stymulacja plastry mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidalnej i standardowej komory perfuzji

Mikrofluidykę można zintegrować ze standardowymi technikami elektrofizjologicznymi, co umożliwia zastosowanie nowych modalności eksperymentalnych. W szczególności motywacją do...

Zastosowanie mikrofluidyki w elektrofizjologii

Niniejszy artykuł przedstawia podejście łączące fotostymulację za pomocą skanowania laserowego z rejestracją z całej komórki u myszy transgenicznych wykazujących ekspresję GFP w ograniczonych populacjach neuronów hamujących. Technika ta umożliwia szerokie mapowanie i analizę ilościową lokalnych obwodów synaptycznych specyficznych hamujących neuronów kory mózgowej.

Mapowanie hamujących obwodów neuronalnych za pomocą fotostymulacji skanującej laserowo

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Poznaj metodę stymulacji plasterków mózgu za pomocą mikroprzepływowego urządzenia PDMS zintegrowanego ze standardową komorą perfuzyjną. To rozwiązanie umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową aplikacji neuroprzekaźników.

Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Przeglądaj więcej filmów