Stymulacja plasterków mózgu za pomocą sieci mikroprzepływowej i standardowej komory perfuzyjnej

Głównym celem projektu, który zamierzamy Wam dzisiaj pokazać, jest możliwość przestrzennego i czasowego kontrolowania stymulacji cięcia mózgu. Kolejną ważną kwestią jest to, że za pomocą prostej modyfikacji w i tak już skomplikowanej konfiguracji elektrofizjologicznej, możemy rozpowszechnić to urządzenie mikroprzepływowe wśród różnych laboratoriów, które faktycznie używają tej stymulacji życia mózgu. Cześć, nazywam się Java Chek Mohammad i pracuję w laboratorium Edington na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu Illinois w Chicago.

Dzisiaj pokażę wam, w jaki sposób zamierzamy zastosować proste, mikroprzepływowe urządzenie do stymulacji wycinków mózgu. Urządzenie do wycinania mózgu, które zamierzamy dzisiaj zademonstrować, jest bardzo przydatne z kilku powodów, a głównym powodem jest to, że jest tak modułowe, że może pasować do istniejącego układu elektrofizjologicznego bez żadnych nowych dalszych modyfikacji. Pozwala to uniknąć stosowania rurek i pompek, co komplikuje działanie każdego urządzenia mikroprzepływowego.

A ponieważ korzystamy z metody pompowania pasywnego, nie potrzebujemy żadnych rurek ani pomp. Trzecią rzeczą jest to, że jest to po prostu cienki arkusz membrany PDMS, który znajduje się pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a standardową komorą profuzyjną, która jest używana w standardowej konfiguracji elektrofizjologicznej. Procedura, którą zamierzam dzisiaj zademonstrować, zaczyna się od wzorca C ósemka, który jest wytwarzany przy użyciu standardowego procesu litografii SV ósemki.

A wzorzec, który mamy dzisiaj, to dwupoziomowy wzorzec, z którego jeden ma konstrukcję kanałów, mikrokanałów, a drugi projekt otworów VR, które znajdują się na górze tych kanałów, tak aby rozwiązania przepływające przez kanały mogły wychodzić z otworów przelotowych. Więc robimy ten wzorzec, który znajduje się na płytce silikonowej, a następnie używamy silikonu lub PDMS, aby wylać na wierzch tego urządzenia i uformować struktury, które są na wierzchu tej płytki, na PDMS. Zamierzamy więc sprawić, że PDMS wyleje się na wierzch tego urządzenia.

Następnie weźmiemy membranę PDMS, która powstaje po utwardzeniu i jest połączona z szkiełkiem nakrywkowym. A potem mamy nasze urządzenie mikroprzepływowe. A następnie zamierzamy zmodyfikować standardową komorę profuzyjną, cytując cienką warstwę PDMS na dnie komory perfuzyjnej.

A kiedy już będziemy mieli tę zmodyfikowaną komorę perfuzyjną, weźmiemy urządzenie mikroprzepływowe, które wyprodukowaliśmy wcześniej i połączymy je z komorą perfuzyjną. Istnieją dwa krytyczne punkty w produkcji urządzenia mikroprzepływowego. Jednym z nich jest to, że zanim położymy PDMS, płyta grzejna powinna być wyłączona, aby PDMS nie ustawiał się natychmiast w kolejce, gdy wylejemy go na wafel.

Kolejnym krytycznym punktem jest to, że przekładki, których używamy w czterech rogach płytki krzemowej, powinny mieć wysokość mniejszą niż najwyższa struktura na płytce krzemowej. Ma to na celu upewnienie się, że otwory VR można uzyskać, gdy wykonujemy proces utwardzania PDMS. Oto jesteśmy w tym modułowym pomieszczeniu czystym z miękkimi ścianami i jest to mistrz, który wyprodukowaliśmy przy użyciu standardowego procesu litografii C ósemki.

I jest to dwupoziomowy wzorzec, przy czym pierwszy poziom ma konstrukcję kanałów z czterema wlotami i jednym wylotem. A w środkowym obszarze wszystkich czterech kanałów znajdują się przelotki lub przejścia, które stoją na górze kanałów. A to są znaki wyrównania, które powstały podczas procesu produkcyjnego.

A teraz pokażę ci, jak zamierzam go usunąć i przeprowadzić utwardzanie PDMS. Ze względu na efekt ściegu krawędziowego, grubość na zewnętrznym obrzeżu płytki jest większa niż rzeczywiste urządzenia w środku papieru. Więc to, co zamierzamy zrobić, to usunąć te znaki wyrównania za pomocą ostrza rezerwowego, a następnie, aby pomieścić ciężary, użyjemy tych przekładek o wysokości 140 mikronów i umieścimy je w czterech rogach płytki.

Musisz więc upewnić się, że żyletka nie sięga w pobliże rzeczywistych urządzeń. Teraz zamierzam usunąć te cząsteczki SVA za pomocą miotełki powietrznej, a wafel jest teraz gotowy do przygotowania formy PDMS. Ale zanim to zrobimy, musimy umieścić te przekładki o wysokości 140 mikronów.

Zamierzam więc umieścić te cztery taśmy w czterech rogach wafla. Następnie upewnię się, że taśma prawidłowo przylega do wafla. Tak więc powodem, dla którego taśma miała 140 mikronów wysokości, jest to, że dwupoziomowy master z kanałami i VS ma 150 mikronów wysokości.

A kiedy kładziemy ciężar na wierzchu PDMS podczas utwardzania PDMS, chcemy mieć pewność, że arkusz PDMS wyjdzie płasko. Używamy więc czterech przekładek na rogach o równych wysokościach. Teraz pokażę, w jaki sposób zamierzamy kodować PDMS i utwardzać go, aby stworzyć urządzenia.

Ale zanim to zrobię, pozwólcie, że pokażę wam, jak przygotowaliśmy rozwiązanie PDMS. Bierzemy więc 10 części bazy i jedną część utwardzacza i dokładnie mieszamy ze względu na proces mieszania. Widzisz, że generujemy dużo pęcherzyków w roztworze PDMS, aby usunąć te pęcherzyki, zamierzamy umieścić PDMS w osuszaczu po włożeniu, po włożeniu PDMS do osuszacza na 10 minut, nie ma pęcherzyków.

A teraz PDMS jest gotowy do użycia do utwardzania. Teraz pokażę wam, w jaki sposób zamierzamy umieścić PDMS na płytce i utwardzić go, aby uzyskać membranę PDMS. Zamierzam więc umieścić PDMS na płytce, a następnie użyć tej przezroczystości do zakrycia PDMS.

Pomoże nam to zdjąć urządzenie, oddzielić je od przezroczystości, a następnie umieszczę ciężarki na wierzchu przezroczystości. A powodem, dla którego używamy odważników, jest uzyskanie jednolitej grubości PDMS. Kolejną krytyczną kwestią jest uzyskanie otworów przelotowych.

Więc wszędzie tam, gdzie są vs, nie chcemy PDMS, a wagi nam w tym pomogą. Jak widać tutaj, płyta grzejna jest wyłączona, a powodem tego jest to, że nie chcemy, aby PDMS utwardzał się natychmiast, więc pozwalamy mu się wyłączyć. Następnie musisz upewnić się, że płytka jest płaska przed przeniesieniem PDMS.

A teraz możemy przenieść PDMS, który przygotowaliśmy wcześniej. Upewnij się, że dozujesz PDMS wystarczająco blisko płytki, aby nie generować bąbelków. A najbardziej krytycznym punktem jest tutaj sposób, w jaki umieszczasz przezroczystość na PDMS.

Musisz upewnić się, że nie generujesz bąbelków z powodu umieszczenia arkusza. A teraz zamierzam umieścić jedno z tych szklanych laboratoriów i pozwolić, aby nadmiar PDMS usunął się z drogi. Umieszczam jeszcze trzy szklane laboratoria i upewniam się, że szklane laboratoria nie ruszą się dla tego konkretnego mistrza.

I dla tych szczególnych cech odkryliśmy, że umieszczenie tych czterech szklanych laboratoriów tworzy VS. I pozwolić, aby nadmiar PDMS zszedł z drogi między przezroczystość a płytkę. Czekamy od jednej do dwóch minut, a następnie możemy uruchomić płytę grzejną dla różnych mistrzów i dla różnych projektów, może być konieczne zwiększenie liczby szklanych laboratoriów lub zmniejszenie szklanych laboratoriów, aby uzyskać otwory przelotowe. Teraz płyta grzejna jest gotowa do włączenia i zamierzam ustawić temperaturę na 75 stopni.

A gdy osiągnie temperaturę 75 stopni, możemy ustawić timer na godzinę i pozwolić PDMS się utwardzić. Teraz, gdy pozostawiliśmy PDMS do utwardzenia na godzinę, możemy wyłączyć płytę grzejną i pozwolić jej ostygnąć do 50 stopni Celsjusza. Powodem takiego postępowania jest to, aby SEA nie pękło.

Jeśli natychmiast usuniemy go z 75 stopni do temperatury pokojowej, teraz możemy go wyłączyć i poczekać, aż spadnie do 50 stopni Celsjusza. Teraz, gdy temperatura płyty grzejnej spadła do 50 stopni Celsjusza, możemy usunąć ciężarki z przezroczystości. Teraz możemy wyjąć wafel z gorącego odtwarzacza i jest gotowy do cięcia.

Teraz arkusz PDMS jest gotowy do wyjęcia z ósemki głównej C i musimy usunąć folię aluminiową. Następnie musimy usunąć arkusz przezroczystości. Mamy tutaj standardową komorę perfuzyjną.

Zmodyfikowaliśmy go, abyśmy mogli go wyrównać. Otwory, porty wlotowe i wylotowe urządzenia mikroprzepływowego. Są to więc cztery porty wlotowe i jeden port wylotowy na membranie PDMS.

A te powinny pasować do czterech wlotów i jednego wylotu w komorze perfuzyjnej. Teraz zamierzam przesunąć komorę perfuzyjną, a następnie wyrównać ją z otworami w membranie PDMS. Teraz, gdy są wyrównane, jest gotowy do cięcia.

Teraz możesz wyjąć komorę i użyć sondy. Upewnij się, że wszystkie krawędzie membrany PDMS można swobodnie usunąć. Gdy to zrobimy, możemy użyć zamrażarki, aby usunąć membranę PDMS i upewnić się, że podczas wyjmowania PDMS z górnej części urządzenia przesuwasz PDMS naprawdę powoli, aby nie rozerwać membrany PDMS.

Teraz zamierzam umieścić membranę PDMS z wnękami, które są utworzone za pomocą ośmiu mistrzów SC na górze i upewnić się, że jest płaska. Powodem, dla którego to robimy, jest to, że kiedy robimy otwory, porty wlotowe i wylotowe, PDMS nie jest szorstki z boku. To zostanie połączone ze szkiełkiem nakrywkowym.

Musimy więc upewnić się, że wgłębienia znajdują się na górze. Teraz możemy zrobić porty wlotowe i wylotowe, aby wyraźnie widzieć otwory. Kładziemy czarne tło.

Teraz zamierzam sprawić, że porty wlotowe i wylotowe muszą upewnić się, że w porcie nie ma już PDMS. Więc jest tomy, usuń wszelkie PDMS. Teraz zamierzamy przenieść membranę PDMS na inny arkusz przezroczystości.

Możemy więc potraktować arkusz i szkiełko nakrywkowe plazmą i położyć je tak, aby ponownie ubytki były nadal na górze. Tak więc, gdy ta powierzchnia zostanie potraktowana plazmą, a szkiełko nakrywkowe zostanie potraktowane plazmą, możemy połączyć te dwie powierzchnie, aby utworzyć sieć mikroprzepływową, aby usunąć pęcherzyki powietrza między arkuszem PDMS. A przezroczystość może użyć taśmy klejącej.

Dzięki temu arkusz PDMS będzie płaski, a wiązanie będzie przebiegać znacznie lepiej. A następnie ponownie użyj taśmy klejącej na górnej powierzchni, aby usunąć kurz z membrany PDMS. Teraz możemy nałożyć szkiełko nakrywkowe, które połączymy z membraną PDMS.

A teraz te dwa PDMS i szkło są gotowe do obróbki plazmowej. Zamierzamy poddać plazmie PDMS i szkiełko nakrywkowe za pomocą tego systemu plazmy modyfikowanej mikrofalowo, gdzie można zobaczyć, że ta szklana komora pozwala nam wytworzyć plazmę wewnątrz tej kuchenki mikrofalowej. Pozwólcie, że umieszczę próbki w środku, tworząc próżnię wewnątrz komory.

Teraz mogę płynąć w tlenie. Teraz system plazmowy jest gotowy do pracy i zamierzam użyć 10% mocy i 10 sekund dla tego konkretnego systemu, aby pomóc w wizualizacji plazmy. Podczas gdy trwa obróbka plazmowa, kręcimy, podkręcamy moc do stu procent i wyłączamy światła.

A teraz możesz zobaczyć osocze Natychmiast po zabiegu plazmowym. Musisz połączyć obie powierzchnie, poślizg krowy i PDMS, w przeciwnym razie powierzchnia PDMS straci swoją hydrofilowość z powodu obróbki plazmowej. Po umieszczeniu poślizgu krowiego upewnij się, że cała powierzchnia jest ze sobą połączona bez pęcherzyków powietrza.

Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, możesz je usunąć. Teraz odstawiasz go na pięć minut i pozwalasz mu się związać. Tak więc mamy zmodyfikowaną komorę perfuzyjną, w której zmodyfikowaliśmy podstawę komory za pomocą PDMS.

I to już wcześniej. Umieściliśmy więc przezroczystość na płycie grzejnej na płycie grzejnej, która była wyłączona. A następnie wlaliśmy P-D-M-S-P-D-M-S, który był przygotowany w podobny sposób, jak pokazano wcześniej.

Następnie umieściliśmy komorę perfuzyjną na PDMS, a następnie umieściliśmy pojedynczy ciężarek, jak pokazano tutaj, i pozwoliliśmy mu utwardzić się przez 30 minut lub 75 stopni Celsjusza. A teraz pokażę, że czekając na PDMS i klejenie szkiełek nakrywkowych, możemy iść dalej i przygotować komorę. Możemy więc połączyć komorę z urządzeniem mikroprzepływowym.

Musimy więc usunąć nadmiar PDMS z miejsca, w którym go nie potrzebujemy. Usuń przezroczystość, a następnie PDMS, Następnie musimy usunąć PDMS z portów wlotowych i wylotowych. Teraz komora jest gotowa do połączenia z urządzeniem mikroprzepływowym, które przygotowaliśmy wcześniej.

Teraz, gdy czekaliśmy pięć minut, urządzenie mikroprzepływowe jest gotowe do oddzielenia od przezroczystości, ale musisz upewnić się, że usuwasz przezroczystość w wolnym tempie. Tak więc PDMS i szkiełko nakrywkowe nie rozdzielają się. Teraz, gdy komora perfuzyjna jest gotowa, musimy poddać plazmie dolną powierzchnię komory, na której właśnie zacytowaliśmy PDMS, oraz górną powierzchnię urządzenia mikroprzepływowego, na którym znajduje się PDMS.

Więc teraz zamierzamy umieścić oba, oba te kawałki w komorze plazmowej i wykonać obróbkę plazmową z mocą 10% przez 10 sekund. Teraz obie powierzchnie zostały poddane obróbce plazmowej i są gotowe do klejenia. Przed przystąpieniem do klejenia należy upewnić się, że porty wlotowe i wylotowe w komorze są wyrównane z urządzeniem mikroprzepływowym.

A ponieważ obiekty, które wyrównywaliśmy, są wystarczająco duże, nie potrzebujemy żadnego specjalnego sprzętu i możemy to zrobić gołym okiem. Po wyrównaniu i umieszczeniu na górze komory upewnij się, że wszystkie powierzchnie stykają się ze sobą, a następnie możesz pozostawić ją na pięć minut. Tak więc wiązanie jest wystarczająco dobre do eksperymentów po odczekaniu pięciu minut.

Teraz, gdy urządzenie mikroprzepływowe połączyło się z komorą, zamierzamy sprawić, że kanały na powierzchni kanału staną się hydrofilowe. Więc kiedy faktycznie przepływa roztwór A CFS lub jakiekolwiek inne neuroprzekaźniki, roztwory mogą łatwiej przepływać. Więc to co zamierzam zrobić, to umieścić całe to urządzenie w plazmie i plazmie, traktować je przez minutę w temperaturze 10%, aby cała wewnętrzna powierzchnia kanału stała się hydrofilowa.

A potem napełnię go wodą, a następnie zabiorę do elektrofizjologii, abyśmy mogli przeprowadzić właściwe eksperymenty. Okej, teraz jesteśmy gotowi, aby przejść do ustawień elektrofizjologii i faktycznie używać tego urządzenia z wycinkiem mózgu. Cześć, nazywam się uo.

Współpracuję z dr Arringtonem i dr Fallem z Wydziału Bioinżynierii Uniwersytetu Illinois. A teraz zamierzam pracować z mikro darmowym urządzeniem, które przywiozło i po prostu zjadło tę platformę. Z jednej strony widać rurki obfitości.

Po drugiej stronie widzimy rurkę ssącą. Tak więc urządzenie zostanie perfuzjowane roztworem płynu mózgowo-rdzeniowego, który jest bąbelkowany 95% tlenu i 5% CO2. Teraz, gdy urządzenie micro V jest gotowe, zamierzam uzyskać licencję mózgu, a następnie zamierzam umieścić je na mikrourządzeniu.

Teraz położę wycinek mózgu, ech, na wierzchu okrągłych otworów, a następnie użyję kotwicy, aby unieruchomić wycinek mózgu. Teraz, gdy wycinek mózgu jest unieruchomiony, zamierzam użyć neuroprzekaźników, aby go stymulować. Tutaj mamy cztery wloty, więc zamierzam umieścić neuroprzekaźnik w każdym wlocie, używając pasywnego pompowania z tych czterech wlotów aż do tego wylotu.

A teraz Dr.Fall opowie o tym urządzeniu. Co jest tak ważne dla, dla Nas? Cześć, nazywam się Chris Fall i zajmujemy się fizjologią mózgu.

Powodem, dla którego musimy używać wycinków mózgu, jest dostęp do mikroelektrod i technologii obrazowania. Do tej pory jedynym sposobem, w jaki mogliśmy zmienić środowisko neuroprzekaźników dla tych wycinków mózgu, była zmiana przepływu na całym wycinku lub zaciąganie neuroprzekaźników bezpośrednio za pomocą bardzo małej mikropipety. Jesteśmy więc naprawdę podekscytowani współpracą z Eddington's Group.

Ta nowa technologia pozwoli nam zająć się dużymi obszarami mózgu i zmienić lokalnie, środowisko neuroprzekaźników. A potem jednocześnie możemy wejść z naszymi, z naszymi elektrodami i naszą technologią obrazowania, a być może w końcu zbudować wieloelektrodowe urządzenia rejestrujące w tej samej jednostce. Okej, więc tutaj widzicie, kawałek skręcenia myszy w urządzeniu mikroprzepływowym.

Nawet na oko można zauważyć, że mózg składa się z wielu różnych regionów. Te regiony robią różne rzeczy. U żywego zwierzęcia te różne obszary mózgu miałyby różne tony neuromodulacyjne i neuroprzekaźnikowe.

Chcemy być w stanie odtworzyć to w naszej komorze kropelkowej, podczas gdy robimy zapisy elektrofizjologiczne i obrazowe. To naprawdę wspaniałe, że możemy zająć się tymi różnymi obszarami za pomocą różnych neuroprzekaźników w różnych stężeniach i w różnych przebiegach czasowych. I chociaż nie jesteśmy w stanie wyobrazić sobie neuroprzekaźników, możemy pokazać wam przykład barwnika fluorescencyjnego, który jest pompowany do wycinka mózgu w różnych regionach.

Tutaj widzicie film, w którym przepuszczamy barwnik fluorescencyjny przez kanały urządzenia i po prostu wizualizujemy, jak wychodzi on z porów, które zostały utworzone. I nawet w tym wczesnym prototypie można zobaczyć, jak precyzyjna jest rozdzielczość przestrzenna z przepływem. Kiedy oglądamy film, zobaczycie, jak barwnik wpływa do kanałów, a następnie wypływa z otworów, a następnie wypłukujemy ten barwnik, dając wam pewne wyobrażenie o tym, jaka jest rozdzielczość czasowa przepływu.

Dziękujemy, że dołączyłeś do nas dzisiaj. Myślę, że udało nam się zademonstrować, w jaki sposób mikrofluidyka i mikromaszyny mogą być połączone z tradycyjnymi technikami fizjologicznymi, aby pomóc nam zrozumieć, jak działa mózg. Dzięki.