Statyczna mikroskopia sił atomowych w celu wizualizacji i scharakteryzowania złożonych nukleosomów

Nukleosomy, podstawowa powtarzająca się jednostka chromatyny eukariotycznej, składają się ze zwojów DNA owiniętych wokół rdzenia białek histonowych.

Aby uwidocznić złożone nukleosomy za pomocą statycznej mikroskopii sił atomowych, AFM, zacznij od cienkiego paska miki, funkcjonalizowanego w celu odtworzenia powierzchni naładowanej dodatnio. Pokrój pasek na małe kwadraty. Odpipetować zmontowaną zawiesinę nukleosomów.

Ujemnie naładowany DNA w nukleosomie wiąże się z dodatnio naładowaną grupą funkcjonalizowanego paska miki poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Przemyć buforem, aby zapobiec przepełnieniu nukleosomów.

Zamocuj pasek miki na dysku podtrzymującym próbkę. Zamontuj go na stoliku instrumentalnym AFM.

Przymocuj uchwyt sondy do głowicy optycznej przyrządu. Uchwyt zawiera wstępnie zamontowany wspornik AFM z końcówką na jego wierzchołku.

Ustaw wiązkę laserową na tylnym wsporniku, aby uzyskać dokładny pomiar ugięcia. Umieść końcówkę w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią zawierającą nukleosomy.

Podczas obrazowania w trybie kontaktowym, gdy końcówka wspornika skanuje powierzchnię nukleosomu, siły odpychające powstają w wyniku interakcji między atomami końcówki a próbką. Powoduje to wygięcie wspornika. Wiązka lasera odbija się w inny sposób i jest kierowana do fotodetektora czułego na położenie.

Pętla sprzężenia zwrotnego utrzymuje stałe ugięcie wspornika przez pionowy ruch skanera podczas skanowania. Ten sygnał sprzężenia zwrotnego jest dalej wykorzystywany do generowania topograficznych obrazów nukleosomów. Jądro nukleosomu wygląda jak jasne plamy, z cienkimi ramionami reprezentującymi flankujące DNA.

Przygotuj powierzchnię miki do statycznego obrazowania AFM. Aby to zrobić, najpierw przygotuj 50-milimolowy roztwór podstawowy APS w wodzie dejonizowanej. Przechowywać 1 mililitr porcji roztworu w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Z roztworu podstawowego przygotuj działający roztwór APS do modyfikacji miki, rozpuszczając 50 mikrolitrów 50-milimolowego zapasu APS w 15 mililitrach destylowanej wody dejonizowanej. Wymieszaj roztwór, a następnie napełnij nim kuwetę.

Następnie wytnij paski miki o wymiarach 1 na 3 centymetry z wysokiej jakości arkuszy miki. Sprawdź, czy element pasuje po umieszczeniu po przekątnej w kuwecie. Następnie rozłupuj warstwy miki, aż obie strony zostaną świeżo rozcięte, a kawałek będzie cienki jak 0,1 milimetra.

Natychmiast umieść kawałek miki w kuwecie wypełnionej APS i inkubuj mikę przez 30 minut. Przenieś kawałek miki do kuwety wypełnionej destylowaną wodą dejonizowaną i moczyć go przez 30 sekund. Następnie użyj argonu, aby całkowicie wysuszyć obie strony paska APS-mica.

Nałóż dwustronną taśmę klejącą na kilka krążków magnetycznych i umieść je z boku. Następnie przytnij podłoże z miki APS na 1 centymetr kwadratowy na 1 centymetr kwadratowy i przykryj je czystą szalką Petriego. Następnie przygotuj trzy rozcieńczenia połączonych nukleosomów za pomocą 0,22-mikronowego przefiltrowanego buforu zawierającego 10-milimolowy HEPES i 4-milimolowy chlorek magnezu o pH 7,5.

Aby ograniczyć utratę nukleosomów przy niskim stężeniu końcowym, rozcieńczanie należy wykonywać pojedynczo, bezpośrednio przed osadzaniem na mice APS.

Umieść od 5 do 10 mikrolitrów każdej próbki nukleosomu w środku kawałka miki APS i pozwól im inkubować przez 2 minuty. Następnie delikatnie przepłucz próbkę 2 do 3 mililitrami destylowanej wody dejonizowanej w celu usunięcia składników buforowych i wysusz zdeponowaną próbkę pod lekkim strumieniem argonu.

Aby rozpocząć, zamontuj końcówkę na uchwycie końcówki zestawu AFM. Następnie zamontuj pierwszą próbkę na stoliku AFM, uważając, aby nie zetknąć się z powierzchnią próbki. Ustaw laser nad wspornikiem, aż jego suma osiągnie maksimum i dostosuj wartości odchylenia pionowego i bocznego na bliskie 0. Następnie dostrój sondę AFM, aby znaleźć jej częstotliwość rezonansową. Dostosuj amplitudę dysku i ustaw rozmiar obrazu na 100 na 100 nanometrów. Po skonfigurowaniu kliknij przycisk Zaangażuj, aby rozpocząć podejście.

Po zakończeniu podejścia stopniowo optymalizuj nastawę amplitudy, aż powierzchnia próbki będzie wyraźnie widoczna. Następnie zwiększ rozmiar skanu do 1 mikrona na 1 mikron i rozdzielczość do 512 na 512 pikseli. Na koniec kliknij przycisk Przechwyć, aby rozpocząć pobieranie obrazu.