Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek może dostarczyć ogromnej wiedzy na temat biologii molekularnej w skali atomowej, umożliwiając manipulowanie pojedynczymi cząsteczkami za pomocą siły. W niniejszym materiale demonstrujemy pomiar przy stałej prędkości z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych. Uzyskane dane możemy ostatecznie wykorzystać do określenia stabilności białka, szybkości rozfałdowania oraz ścieżki rozfałdowania.

Aby rozpocząć procedurę, przyklej nieprzewodzącą zakładkę adhezyjną do czystego, żelaznego dysku o szerokości 15 milimetrów. Usuń arkusz zabezpieczający i mocno dociśnij czystą, niepowlekaną lub powlekaną złotem szkiełko przedmiotowe do odsłoniętego kleju. Przechowuj szkiełko w czystej, przykrytej szalce Petriego.

Następnie zagęszcz oczyszczone poliproteinę za pomocą filtra wirowego, po czym odwróć kolumnę i eluej białko do buforu, który zostanie wykorzystany w eksperymencie. Określ odpowiednie stężenie białka na podstawie absorbancji przy 280 nanometrach, a następnie przygotuj 100 µL roztworu białka o stężeniu 100 µg/mL. Nanieś kroplę 60 µL roztworu białka na środek szkiełka.

Należy uważać, aby ciecz nie przedostała się między szkiełkiem a żelaznym dyskiem, ponieważ spowoduje to niekontrolowane ruchy próbki podczas eksperymentu. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut. Następnie ostrożnie chwycić wspornik za koniec i umieścić go w komorze mocującej sondę.

Upewnij się, że wspornik jest mocno osadzony. Następnie umieść komorę trzymającą w głowicy AFM. Ustaw głowicę na stole mikroskopu odwróconego i podłącz pakiet baterii do głowicy AFM, aby zasilić laser.

Przygotuj kamerę dla detektora mikroskopu, aby wizualizować światło lasera na monitorze lub ekranie telewizora. Kierując się obrazem z mikroskopu, ustaw laser tak, aby był skierowany na wierzchołek dźwigni. Po przygotowaniu próbki wlej 10 µL buforu eksperymentalnego do każdego portu komory mocującej sondę.

Odlej około 40 µL cieczy z preparatu na szkiełku i dodaj 40 µL buforu. W międzyczasie rozpocznij przygotowanie mikroskopu sił atomowych do pomiaru. Najpierw umieść szkiełko na magnesie znajdującym się nad silnikiem piezoelektrycznym.

Upewnij się, że stolik AFM znajduje się w pozycji podniesionej, a następnie umieść głowicę AFM na stoliku tak, aby wspornik znajdował się nad kroplą próbki. Następnie umieść mały kawałek papieru przed fotodiodą AFM. Reguluj laser, aż plamka na papierze będzie jasna i skupiona, a następnie usuń papier.

Uruchom oprogramowanie AFM, aby wyświetlić sygnał z fotodiody. Wyreguluj lustro głowicy AFM w taki sposób, aby sygnał lasera był zmaksymalizowany we wszystkich czterech kwadrantach fotodiody, a różnica sygnałów między górną a dolną parą kwadrantów wynosiła zero. Aby rozpocząć kalibrację AFM, ustaw filtr sygnału głowicy AFM na pełną szerokość pasma i upewnij się, że piezo jest wyłączone.

W oprogramowaniu AFM zmierz średnią z 512 obliczeń widma mocy, przy 1 024 punktach danych na każde obliczenie. Zintegruj gęstość widmową mocy w obrębie pierwszego piku, który odpowiada głównej modzie drgań wspornika. Następnie włącz kontroler piezoelektryczny i ustaw filtr na 500 Hertz.

Szybko przesuń głowicę AFM w dół o kilkaset mikrometrów, monitorując sygnał różnicowy. Kontynuuj przesuwanie głowicy w dół o kilkaset mikrometrów za razem, obserwując występowanie spójnych skoków sygnału różnicowego. Gdy amplituda skoków sygnału zacznie rosnąć, oznacza to, że końcówka znajduje się bardzo blisko powierzchni próbki.

Gdy sygnał odchylenia nasyci się w momencie kontaktu końcówki z powierzchnią, lekko unieś głowicę, a następnie dostosuj napięcie piezoelektryczne, aby przemieścić głowicę AFM w górę lub w dół o 100 do 5 000 nanometrów w celu zlokalizowania powierzchni próbki. Następnie przeprowadź eksperyment rozciągania z rozmiarem skanowania wynoszącym około 500 nanometrów, aby końcówka dotknęła powierzchni, lub przy przemieszczeniu silnika piezoelektrycznego o około 100 nanometrów. Wykorzystaj uzyskane wyniki do obliczenia stałej sprężystości oraz czułości.

W oprogramowaniu ustaw rozmiar skanowania na 40% większy niż całkowity teoretyczny rozmiar rozwijającego się poliproteiny. Ustaw dźwignię tak, aby znajdowała się w odległości 80% rozmiaru skanowania od powierzchni. Ustaw prędkość skanowania na 300 nanometrów na sekundę.

Przeprowadź eksperyment rozciągania i zmierz wynikową pozycję piezo oraz sygnał fotodiody. W trakcie pomiaru co godzinę dodawaj bufor eksperymentalny do celi przepływowej, aby zapobiec wysychaniu próbki. Zdarzenia rozfałdowania zarejestrowane dla poliproteiny I91 oraz poliproteiny, w której trzy domeny I91 flankowały cząsteczkę NI10C z każdej strony, dopasowano do modelu łańcucha typu worm-like chain.

Oba pomiary wykazują charakterystyczne przyrosty siły i długości konturowej I91, co wskazuje na pomyślną kalibrację AFM. Pomiary poliproteiny zawierającej cząsteczkę N110C wykazały wystarczającą liczbę zdarzeń I91, aby potwierdzić, że nowe zdarzenia wynikały z rozfałdowania badanego białka. Średnia długość konturowa powtórzenia ankyryny wynosiła około 10,5 nanometra, a siły rozfałdowania mieściły się w przedziale od 8 do 25 piconewtonów.

Konieczne jest zastosowanie poliproteiny, ponieważ zdarzenia rozfałdowania białek flankujących stanowią kontrolę pozytywną pozwalającą na identyfikację zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Bez tego dane mogą zostać błędnie zinterpretowane.