Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek może dostarczyć ogromnych informacji na temat biologii molekularnej w skali atomowej, umożliwiając nam manipulowanie pojedynczymi cząsteczkami za pomocą siły. Tutaj demonstrujemy pomiar stałej prędkości za pomocą mikroskopu sił atomowych. Ostatecznie możemy wykorzystać dane do określenia stabilności białka, szybkości rozwijania i szlaku rozwijania.

Aby rozpocząć procedurę, przymocuj nieprzewodzącą zakładkę samoprzylepną do czystego żelaznego dysku o szerokości 15 milimetrów. Zdejmij arkusz pokrywy i mocno dociśnij czysty, niepowlekany lub pokryty złotem szkiełko do odsłoniętego kleju. Przechowywać szkiełko na czystej, przykrytej szalce Petriego.

Następnie należy skoncentrować oczyszczoną poliproteinę w filtrze odśrodkowym, a następnie odwrócić kolumnę i wymyć białko do buforu, który ma być użyty w eksperymencie. Określ odpowiednie stężenie białka na podstawie absorbancji przy 280 nanometrach, a następnie przygotuj 100 mikrolitrów 100 mikrogramów na mililitr roztworu białka. Nałóż 60 mikrolitrów kropli roztworu białka na środek szkiełka.

Uważaj, aby płyn nie prześlizgnął się między szkiełkiem a żelaznym dyskiem, ponieważ doprowadzi to do niekontrolowanych ruchów próbki podczas eksperymentu. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 minut. Najpierw ostrożnie podnieś wspornik do końca i umieść go w celi przytrzymującej sondę.

Upewnij się, że wspornik jest mocno osadzony. Następnie umieść komórkę przytrzymującą w głowicy AFM. Ustaw głowicę na odwróconym stoliku mikroskopu i podłącz akumulator do głowicy AFM, aby zasilić laser.

Skonfiguruj kamerę do detektora mikroskopu, aby wizualizować światło lasera na monitorze lub ekranie telewizora. Prowadzony przez mikroskop ustaw laser tak, aby był skierowany na końcówkę wspornika. Gdy próbka jest gotowa, przepłukać 10 mikrolitrów buforu eksperymentalnego do każdego portu celi przytrzymującej sondę.

Zdekantować około 40 mikrolitrów płynu ze szkiełka do próbki i dodać 40 mikrolitrów buforu. W międzyczasie zacznij przygotowywać mikroskop sił atomowych do pomiaru. Najpierw umieść suwak na magnesie nad silnikiem piezoelektrycznym.

Upewnij się, że stolik AFM znajduje się w pozycji uniesionej, a następnie umieść głowicę AFM na stoliku z wspornikiem nad kroplą próbki. Następnie umieść małą kartkę papieru przed fotodiodą AFM. Ustaw laser tak, aż plamka na papierze będzie jasna i ostrona, a następnie wyjmij papier.

Uruchom oprogramowanie AFM, aby view sygnał z fotodiody. Wyreguluj lusterko czołowe AFM tak, aby sygnał laserowy był maksymalizowany we wszystkich czterech kwadrantach fotodiody, a inny sygnał między parami górnego i dolnego kwadrantu wynosił zero. Aby rozpocząć kalibrację AFM, ustaw ustawienie filtra sygnału głowicy AFM na pełną szerokość pasma i upewnij się, że piezo jest wyłączone.

W oprogramowaniu AFM zmierz średnią z 512 obliczeń widma mocy, z 1 024 punktami danych na obliczenie. Zintegruj widmową gęstość mocy na pierwszym piku, który odpowiada głównemu trybowi drgań wspornika. Następnie włącz kontroler piezoelektryczny i ustaw filtr na 500 Hz.

Szybko przesuń głowicę AFM o kilkaset mikrometrów w dół, jednocześnie monitorując inny sygnał. Kontynuuj przesuwanie głowy w dół o kilkaset mikrometrów na raz, obserwując stałe skoki w innym sygnale. Kiedy skoki sygnału zaczynają zwiększać wysokość, końcówka znajduje się bardzo blisko powierzchni próbki.

Gdy sygnał odchylenia nasyci się po kontakcie końcówki z powierzchnią, lekko podnieś głowicę, a następnie wyreguluj napięcie piezoelektryczne, aby przesunąć głowicę AFM w górę lub w dół o 100 do 5 000 nanometrów, aby znaleźć powierzchnię próbki. Następnie przeprowadź eksperyment ciągnięcia z rozmiarem skanu około 500 nanometrów, tak aby końcówka stykała się z powierzchnią, czyli około 100 nanometrów ruchu silnika piezoelektrycznego. Skorzystaj z wyników, aby obliczyć stałą sprężystości i czułość.

W oprogramowaniu ustaw rozmiar skanu na 40% większy niż całkowity teoretyczny rozmiar rozwijającej się poliproteiny. Ustaw wspornik tak, aby znajdował się w odległości 80% rozmiaru skanowania od powierzchni. Ustaw prędkość skanowania na 300 nanometrów na sekundę.

Wykonaj eksperyment ciągnięcia i zmierz wynikową pozycję piezoelektryczną i sygnał fotodiody. Dodawaj bufor eksperymentalny do celi płynu co godzinę przez cały czas trwania pomiaru, aby zapobiec wyschnięciu próbki. Rozwijające się zdarzenia w nagraniach poliproteiny I91 i poliproteiny, w których trzy domeny I91 otaczały cząsteczkę NI10C z każdej strony, zostały wyposażone w model łańcucha przypominający robaka.

Oba nagrania pokazują charakterystyczne przyrosty siły i długości konturu I91, co wskazuje, że kalibracja AFM zakończyła się sukcesem. Zapisy poliproteiny zawierającej cząsteczkę N110C wykazały wystarczającą liczbę zdarzeń I91, aby potwierdzić, że nowe zdarzenia pochodziły z rozwijającego się białka będącego przedmiotem zainteresowania. Średnia długość konturu dla powtórzeń ankyryny wynosiła około 10,5 nanometra, a siły rozwijające się wynosiły od 8 do 25 pikonewtonów.

Niezbędne jest użycie poliproteiny, ponieważ zdarzenia rozwijające się białek flankujących zapewniają pozytywną kontrolę w celu zidentyfikowania zdarzenia pojedynczej cząsteczki. W przeciwnym razie dane mogą zostać błędnie zinterpretowane.