Produkcja urządzeń PDMS i modyfikacja powierzchni

Nazywam się Ken Kotz. Jestem stażem podoktorskim w Bio MAs Resource Center powiązanym z Massachusetts General Hospital. Mój główny projekt badawczy polega na izolowaniu neutrofili za pomocą urządzenia do wychwytywania powinowactwa immunologicznego o strukturach mikroprzepływowych.

Używamy tego urządzenia w pięciu różnych szpitalach w całym kraju do izolowania RNA do dalszej analizy genomowej. Zasadniczo to, co masz, to mistrz SU osiem fotorezystorów na wierzchu krzemu. Zamierzamy wylać dwuczęściowy elastomer A-P-D-M-S na ten wzorzec, a ten PDMS utworzy formę.

Wyjmujemy formę wzorcową z etui i umieszczamy ją na szalce Petriego. Mistrz jest zabezpieczony taśmą na dnie szalki Petriego. Na wadze ważymy mieszaninę PDMS, utwardzacza i żywicy bazowej.

Stosunek to jedna część utwardzacza na 10 części żywicy. Zazwyczaj w przypadku naszych urządzeń, które zostały wycięte, ważymy odpowiednio od 20 do 30 gramów żywicy i od dwóch do trzech gramów utwardzacza. Po wlaniu zarówno utwardzacza, jak i żywicy do małej łódeczki serwatkowej, używamy standardowego plastikowego widelca, aby wymieszać je ze sobą.

Chcesz mieć pewność, że energicznie mieszasz i składasz mieszaninę jeden na drugim, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie utwardzacza w żywicy. Zazwyczaj monitorujemy, jak dobrze te dwie rzeczy zostały wymieszane. Patrząc na liczbę pęcherzyków powietrza, staramy się uzyskać równomierny rozkład małych pęcherzyków powietrza w całym elastomerze.

Następnie wylewamy PDMS na wierzch ósemki SU, która znajduje się na szalce Petriego. Umieszczamy mistrza z PDMS na wierzchu w próżniowym słoiku dzwonowym i opróżniamy komorę, aby odgazować powietrze, które do niej zmieszaliśmy. Zazwyczaj proces odgazowania trwa od 30 minut do jednej godziny.

Po odgazowaniu wyjmujemy urządzenia z komory próżniowej i umieszczamy je w piekarniku o temperaturze od 65 do 80 stopni C. Minimalny czas utwardzania w tych temperaturach wynosi od trzech do sześciu godzin. W naszym laboratorium zazwyczaj zostawiamy urządzenia w piekarniku na noc.

Zazwyczaj używamy noża ze stali chirurgicznej numer 11. Wykonujemy proste cięcia w dół około pół centymetra od krawędzi wzorca krzemowego i przecinamy wokół krawędzi wzorca, tworząc duży dysk. Odrywamy formę PDMS od mistrza i umieszczamy cechą do góry na czystej szalce Petriego.

Wyjmujemy uwolnioną formę z szalki Petriego i umieszczamy ją na powierzchni tnącej za pomocą noża lub noża zamontowanego na szynie liniowej. Dzielimy urządzenia znajdujące się na formie. Każde urządzenie sekcyjne jest następnie umieszczane z powrotem na szalce Petriego w celu dalszej obróbki.

Zazwyczaj, aby połączyć nasze urządzenia z płynami, wybijamy otwory w urządzeniu PDMS. Urządzenie, którego używamy do dziurkowania otworów to standardowa strzykawka z trzema młynkami. Na końcu strzykawki z trzema młynkami znajduje się igła ze stali nierdzewnej z końcówką.

Wewnątrz igły ze stali nierdzewnej znajduje się drut, który pasuje do wewnętrznej średnicy igły. Ten drut jest przymocowany do tłoka strzykawki Pociągając tłok do tyłu i cofając tę igłę, można przebić otwór lub wbić zatyczkę do PDMS. Obróć urządzenie PDMS i wysuń je, naciskając tłok.

Sekret urządzeń wykrawających polega na tym, aby tłok był jak najbardziej pionowy i w ogóle nie obracał urządzenia wykrawającego. Kiedy przebijasz się przez PDMS, podnosisz całe urządzenie, całe urządzenie PDMS za pomocą pęsety, odwracasz je i wyjmujesz wtyczkę, naciskając tłok. Chwytasz wtyczkę pęsetą i wyrzucasz ją.

Następnie ponownie cofasz tłok, odwracasz urządzenie z powrotem w dół i wyciągasz urządzenie tnące. Powtarzasz to, aż wszystkie zostaną wybite. Tak więc w procesie klejenia łączymy nasze urządzenia PDMS ze szkiełkami szkiełkowymi.

W przypadku naszych urządzeń zamierzamy nieodwracalnie łączyć lub kowalencyjnie łączyć PDMS ze szklanymi szkiełkami. Sposób, w jaki można to osiągnąć, polega na umieszczeniu ich w plazmie Ashera, umieszczeniu ich w plazmie Asher i wystawieniu ich na działanie reaktywnej plazmy tlenowej. Tak więc kroki, aby to zrobić, polegają na wzięciu urządzenia PDMS i umieszczeniu go na tacy plazmowego Ashera.

Dzięki funkcjom urządzenia skierowanym do góry można używać dowolnego standardowego szklanego szkiełka mikroskopowego. Używamy lekko powiększonego szkiełka mikroskopowego o długości półtora cala, aby pasowało do naszego urządzenia. Możesz ich używać od razu po wyjęciu z opakowania.

Wolimy leczyć je roztworem piranii. Usuwa to wszelkie zanieczyszczenia organiczne, które mogą znajdować się na powierzchni szkiełka. Po umieszczeniu urządzenia i szkiełka na górze tacki dla plazmy Asher, wsuwasz tacę do plazmy Asher i wystawiasz ją na działanie reaktywnej plazmy tlenowej.

Po zakończeniu programu plazmowego Ashera otwieramy komorę i wyjmujemy płytkę z naszymi urządzeniami na blat stołu. Za pomocą pęsety ostrożnie podnosimy urządzenie PDMS, uważając, aby nie dotknąć palcami powierzchni łączących. Odwracamy stronę łączącą na szkło, na szkiełko podstawowe, a następnie upewniamy się, że tak, że nie ma pęcherzyków powietrza między PDMS a szkiełkiem.

Umieszczamy urządzenie PDMS teraz połączone ze szkłem na płycie grzejnej w temperaturze od 65 do 75 stopni C na 10 minut, aby uzyskać lepsze wiązanie chemiczne. Tak więc w tej części, w tej sekcji, zamierzamy chemicznie zmodyfikować powierzchnie PDMS w szkle po klejeniu w czystym pomieszczeniu, pozostaje nam powierzchnia A PMS, która ma reaktywne grupy OL na powierzchni. Potrzebujemy, aby ta reaktywna powierzchnia była hydrofilowa i ostatecznie dyfundowała do większości PMS.

Tak więc chemia powierzchni jest najlepiej realizowana natychmiast po obróbce plazmowej, użyjemy 5% roztworu me capto. To jest three me capto, propyl, trimeth oxy. Jest to 5% roztwór objętościowy i zasadniczo to, co robimy, polega na wstrzykiwaniu go do wlotu i upewnianiu się, że całkowicie napełniłeś urządzenie bez pęcherzyków powietrza.

Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, wypychasz je pęsetą. Po wstrzyknięciu slanu pozostawiasz go na 15 do 30 minut. W temperaturze pokojowej, zazwyczaj, wstrzykujemy drugą objętość slanu 10 minut do reakcji.

Więc po tym, jak cylina będzie reagować przez około pół godziny, weźmiemy a, przepłukamy wszystkie urządzenia trzema do czterech objętości czystego etanolu. Nadmiar, który wyrzucamy, po prostu wytrzemy chusteczką chemiczną Po wypłukaniu urządzeń podnosimy urządzenia i umieszczamy je na płycie grzejnej, która jest ustawiona na sto stopni C, i w zasadzie pozwolimy, aby etanol, który się tam znajduje, wyparował. Pomaga to uklęknąć na powierzchni zakiszania.

Po wysuszeniu urządzenie można je przechowywać w wysuszonym miejscu przez miesiące lub można je wziąć i natychmiast przejść do następnego kroku. Po utwardzeniu urządzenia zostały utwardzone za pomocą powłoki sinusoidalnej zarówno na powierzchni szkła, jak i PDMS. Sinus jest sinusem kapto z grupą tiolową, która będzie reagować z naszym hetero dwufunkcyjnym środkiem sieciującym, którym jest GMBS.

Jest rozcieńczony w czystym etanolu. Jest reaktywny z wodą, dlatego należy uważać, aby nie wystawić go na działanie warunków wodnych. Wstrzykujemy go do urządzeń i usuwamy wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pęsety, tak jak robię to tutaj, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie są splecione z tą cząsteczką.

Przykrywamy go i pozwalamy mu reagować przez pół godziny. Po reakcji GMBS przez pół godziny przepłukamy urządzenia wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie ślady etanolu, które znajdują się w urządzeniu. A potem przejdziemy przez neu travainę, która jest białkiem wiążącym biotynę.

Neutravain jest następnie wstępnie rozcieńczany do stężenia 10 mikrogramów na promil. Jeśli, jeśli jakiekolwiek powietrze zostanie przypadkowo wstrzyknięte do urządzenia, urządzenie będzie musiało zostać ponownie przepłukane etanolem, aby skutecznie usunąć całe mokre powietrze, urządzenie lepiej wynurza się na powierzchnię i pozwala usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostały przypadkowo wprowadzone do urządzenia. A po przepłukaniu urządzeń zjonizowaną wodą, zazwyczaj napełniamy je dwoma do czterech objętości urządzenia rozcieńczonego neutralnego roztworu T. travain.

Travain Nutta będzie reagował z GMBS, który jest unieruchomiony na powierzchni za pomocą wszelkich podstawowych środków na trawanie Nutta. Proces ten może zachodzić w temperaturze pokojowej przez godzinę. Zazwyczaj umieszczam urządzenia w chłodni w temperaturze czterech stopni C na noc.

Zanim jednak dodamy przeciwciało, chcemy wypłukać każdy Aden, który nie jest związany w roztworze. Robimy to, przepływając przez 1% roztwór BSA rozcieńczony w PBS. Ponieważ te chipy będą używane do dalszej analizy genomicznej, wszystkie rozwiązania, których używamy, są wolne od RNA.

Zazwyczaj to, co robimy, polega na tym, że przepłukujemy urządzenie czterema do pięciu woluminów roztworu 1%BSA. A następnie dodajemy nasze przeciwciało. Przeciwciałem w tym eksperymencie jest CD 66 B i przeciwciała specyficzne dla granulocytów we krwi pełnej.

Używamy stężenia od 10 do 25 mikrogramów na promil i wstrzykujemy przeciwciało. Wstrzykniemy 200 mikrolitrów przeciwciał do każdego urządzenia. Wykonamy dwa zastrzyki po sto mikrolitrów, po jednym do każdego portu urządzenia.

Zazwyczaj wstrzykujemy sto mikrolitrów do jednego portu, a następnie czekamy 30 minut i wstrzykujemy dodatkowe sto mikrolitrów do przeciwległego portu.