Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do podziału somy neuronów i aksonów

Witamy w laboratorium Dr.Newly John. John Lab specjalizuje się w inżynierii platform mikroprzepływowych do zastosowań biologicznych. W tym filmie zademonstrujemy produkcję i wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego przeznaczonego do podziału na przedziały i hodowli neuronów pierwotnych.

Urządzenie neuronowe zostało po raz pierwszy opublikowane w Nature Methods w sierpniu 2005 roku. Od momentu wprowadzenia na rynek, urządzenie neuronowe jest szeroko stosowane przez współpracowników na całym świecie. Urządzenie neuronowe składa się z kawałka PDMS, który został odlany na płytce krzemowej zawierającej wzór SUA urządzenia, który wcześniej został stworzony za pomocą fotolitografii.

Urządzenie ma trzy główne cechy, cztery zbiorniki o średnicy ośmiu milimetrów, dwa główne kanały o szerokości 1,5 milimetra, długości siedmiu milimetrów i wysokości stu mikronów oraz mikrorowki o szerokości 10 mikrometrów i wysokości trzech mikrometrów, które łączą dwa główne kanały. Mikrorowki mogą mieć różną długość od 150 mikronów do 900 mikronów, chociaż standardowa długość do wyboru to 450 mikronów. Obserwując urządzenie tak, aby główne kanały i mikrorowki były pionowe, widzimy, że zbiorniki po lewej stronie rowków są połączone kanałami głównymi, podobnie jak zbiorniki po prawej stronie.

Ta funkcja umożliwia przepływ cieczy przez główny kanał, co jest ważną cechą, umożliwiającą ładowanie komórek i zmianę mediów. Urządzenie neuronowe ma trzy główne zalety w porównaniu z tradycyjnymi platformami do hodowli tkankowych. Po pierwsze, pozwala na comcompartmentalizację ciał komórkowych lub somy i aksonów Dzięki urządzeniu neuronowemu możliwe jest uzyskanie czystych frakcji aksonalnych.

Rozmiar i długość mikrorowków umożliwiają przejście aksonów przez drugi główny kanał, jednocześnie zapobiegając krzyżowaniu się korpusów piły. Po drugie, ze względu na konstrukcję urządzenia i wykorzystanie ciśnienia hydrostatycznego, możliwe jest poddanie oddzielnych zabiegów zarówno po stronie ogniwa, jak i po stronie aksonów, po prostu utrzymując objętość i zbiorniki wyżej po jednej stronie urządzenia w porównaniu z drugą. I po trzecie, czysta frakcja aksonalna urządzenia może być cięta przez odsysanie próżniowe, co pozwala badaczowi badać i obserwować regenerację aksonów.

Badaczka Hina Lee zademonstruje teraz, jak przygotować urządzenie do neuronów mikroprzepływowych. Płytka krzemowa o trzech Ang z wzorem wykonanym z SU eight za pomocą fotolitografii jest używana do odlewania formy mikroprzepływowej z polidimetylu Sloane PDMS. Odnosimy się do wafla krzemowego z wzorem SUA jako form wzorcowych lub po prostu mistrzów.

PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku wagowym 10 do jednego. Czyli na przykład 15 gramów PDMS na 1,5 grama utwardzacza. PDMS jest następnie dobrze mieszany i wylewany na płytkę krzemową.

Wafel krzemowy znajduje się w 10-centymetrowej polistyrenowej szalce Petriego. Potrzeba około 12 gramów do 15 gramów PDMS, aby pokryć MA o grubości około czterech milimetrów. Wzorzec z PDMS jest następnie umieszczany w osuszaczu próżniowym z pokrywką zdjętą z szalki Petriego i stosuje się próżnię.

Ma to na celu usunięcie pęcherzyków powietrza z PDMS, które zostały wprowadzone podczas mieszania utwardzacza. Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut. Wzorzec z PDMS wyjmuje się z osuszacza po 15 minutach w osuszaczu próżniowym.

Na masterze PDMS pozostało jeszcze kilka bąbelków. Pistolet pneumatyczny z filtrem 0,45 mikrona służy do usuwania wszelkich pozostałych pęcherzyków. Mistrz jest następnie umieszczany na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni na godzinę w celu utwardzenia.

Jeśli osuszacz próżniowy nie jest dostępny, mistrza można pozostawić w temperaturze pokojowej na kilka godzin. Pęcherzyki powietrza w końcu same się rozproszą . Jeśli nie jest dostępna płyta grzejna, PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.

Ważne jest, aby upewnić się, że mistrz jest wypoziomowany podczas procesu utwardzania. Po utwardzeniu PDMS na mistrzu, jest on przenoszony do czystego kaptura za pomocą ostrza chirurgicznego. Wykonywany jest okrąg wycięty na obwodzie urządzeń.

Ważne jest, aby po włożeniu ostrza do PDMS zetknąć się z płytką krzemową, ale nie wywierać zbyt dużego nacisku na płytkę, w przeciwnym razie mistrz pęknie z okręgiem wyciętym dookoła urządzeń. Na każdy trzycalowy mistrz krzemowy przypadają cztery urządzenia. PDMS jest ostrożnie zdejmowany z urządzenia głównego.

Można to rozpocząć, delikatnie przekręcając ostrze chirurgiczne podczas jego wkładania do poprzedniego cięcia. Jest naprawdę cienki z urządzeniami PDMS na formie. Zbiorniki zadrukowane do góry są wbijane do urządzenia za pomocą ośmiomilimetrowego stempla do biopsji tkankowej.

Zanieczyszczenia pozostawione w dziurkaczu są wypychane za pomocą pręta. Urządzenia są następnie ćwiartowane, a nadmiar PDMS przycinany, aby urządzenie starannie pasowało do pokrowca Corning. Szkło numer jeden o wymiarach 24 milimetry na 40 milimetrów azot powietrze służy do zdmuchiwania nadmiaru zanieczyszczeń.

Uporczywe zanieczyszczenia można również usunąć za pomocą taśmy winylowej 3M Scotch Brand 4 7 1. Czyste urządzenia są teraz gotowe do klejenia plazmowego. Środek do czyszczenia plazmy Herrick służy do krótkiego łączenia urządzeń neuronowych z pokrywą.

Urządzenia i szkiełka nakrywkowe umieszcza się na tacy, a taca jest następnie umieszczana w myjce plazmowej i pompie próżniowej służącej do odprowadzania powietrza z komory. Ważne jest, aby pamiętać, że urządzenia PDMS są umieszczone stroną zadrukowaną do góry. To znaczy z konstrukcją skierowaną do góry, tak aby były wystawione na działanie gazu plazmowego.

Gdy podciśnienie osiągnie 300, moc militorra jest włączana na cewkę elektryczną i ustawiana na wysoką. Wszystko jest pęknięte na drzwiach, aby wpuścić trochę powietrza do komory, co pomoże wytworzyć plazmę. Urządzenia i szkło nakrywkowe są poddawane obróbce plazmowej przez dwie minuty.

Zwróć uwagę na fioletowy kolor w komorze. To jest właściwa plazma. Cewka elektryczna tworzy plazmę, która jest częściowo zjonizowanym gazem składającym się z elektronów, jonów i obojętnych atos lub cząsteczek.

Plazma tworzy reaktywne formy na powierzchni szkła i urządzenia, które po umieszczeniu razem utworzą trwałe połączenie. Plazma zmienia również powierzchnię na hydrofilową, co ułatwia dodawanie cieczy. Myjka plazmowa sterylizuje również urządzenia.

Po dwuminutowej obróbce plazmowej zasilanie w próżni jest wyłączane i powietrze jest wprowadzane do komory. Szkło i urządzenie mikroprzepływowe poddawane obróbce plazmowej są montowane w kontakcie ze sobą w czystej ławce. Urządzenia są następnie umieszczane w sterylnych 60-milimetrowych naczyniach.

Plazmowe powierzchnie szkła i urządzenia tworzą ścisłe, nieodwracalne połączenie. W ciągu 10 minut od spajania plazmowego urządzenie jest do szklanego poliolu lizyna jest dodawana do urządzenia. Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia zmniejszy się.

Utrudnianie PLL wejścia do urządzenia. Ważne jest, aby sprawdzić, czy w urządzeniu nie ma pęcherzyków powietrza po dodaniu PLL. Łatwą metodą usunięcia obecnych pęcherzyków powietrza jest użycie pipety P 200 wypełnionej 100 mikrolitrami płynu.

W takim przypadku PLL umieść końcówkę bezpośrednio przy otworze kanału głównego, a następnie mocno wciśnij P 200. Może być konieczne powtórzenie tego kilka razy, ale w końcu siła z pipety wypchnie pęcherzyki. Urządzenia zawierające PLL pozostawia się do inkubacji przez noc i standardowy inkubator do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni z 5% CO2.

Po 24 godzinach inkubacji z PLL urządzenia są dwukrotnie szybko płukane wodą dejonizowaną w autoklawie. Podczas tego procesu ciecz nigdy nie jest całkowicie usuwana z głównych kanałów, tylko ze zbiorników. Usunięcie cieczy z głównych kanałów wprowadzi bąbelki.

Po dwóch szybkich płukaniach urządzenia są ponownie napełniane autoklawem i ponownie umieszczane w inkubatorze na co najmniej trzy godziny lub na noc. Następnego dnia, po inkubacji z wodą przez noc lub przez co najmniej trzy godziny, urządzenia są ponownie umieszczane w komorze bezpieczeństwa biologicznego i dwukrotnie płukane wodą dejonizowaną. Następnie do urządzeń dodaje się neuronalne podłoża podstawowe zawierające niezbędne suplementy, witaminę B 27 i glutaminian do hodowli pierwotnych neuronów szczurów.

Urządzenia są następnie umieszczane z powrotem w inkubatorze do wykorzystania w przyszłości. Urządzenia są teraz gotowe do osadzania neuronów. W tym filmie zademonstrowaliśmy technikę miękkiej litografii, której używamy do produkcji naszych urządzeń neuronowych.

Urządzenia te mogą być używane do hodowli neuronów i innych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania. Podstawową zaletą tych urządzeń jest możliwość oddzielenia i podziału hodowli ciał komórek neuronalnych po jednej stronie urządzenia od czystej frakcji aksonalnej po drugiej stronie urządzenia. W następnym filmie pokażemy, jak przygotowujemy neurony korowe płodu E 18 i jak ładujemy komórki do urządzenia.

To tyle z John Lab. Dzięki za oglądanie.