Name: Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do podziału somy neuronów i aksonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj technikę miękkiej litografii do wytwarzania mikroprzepływowych urządzeń z PDMS dla kultur neuronów. Ta metoda umożliwia kompartmentalizację som i aksonów w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część 1: Przygotowanie mikroprzepływowego urządzenia neuronowego
<ol>
<li>A&nbsp;Do odlewania formy mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykorzystuje się 3-calowy wafel krzemowy z wzorem wykonanym z SU-8 metodą fotolitografii. Wafel krzemowy z wzorem z SU-8 określamy mianem form matryc lub „matryc”.</li>
<li>PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, co oznacza, że do 10 gramów PDMS dodaje się 1 gram utwardzacza.</li>
<li>Następnie PDMS należy dokładnie wymieszać i wylać na wafel krzemowy. Wafle krzemowe znajdują się w polistyrenowej płytce Petriego o średnicy 10 cm. Do pokrycia matrycy warstwą o grubości około 4 mm potrzeba od 12 g do 15 g PDMS.</li>
<li>Matrycę z PDMS umieszcza się następnie w deskrykatorze próżniowym z otwartą pokrywą szalki Petriego, a następnie przykłada próżnię. Czynność tę wykonuje się w celu usunięcia z PDMS pęcherzyków powietrza, które powstały podczas mieszania z utwardzaczem.&nbsp; Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut.</li>
<li>Matryca z PDMS zostaje wyjęta z eksykatora. W celu usunięcia pozostałych pęcherzyków powietrza używa się pistoletu pneumatycznego z filtrem 0,45 μm.</li>
<li>Następnie matrycę umieszcza się na płycie grzejnej o temperaturze 80°C na 1 godzinę w celu utwardzenia.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli eksykator próżniowy jest niedostępny, mieszaninę główną można pozostawić w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Pęcherzyki powietrza z czasem znikną samoistnie. Jeśli płyta grzewcza jest niedostępna, PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.
Uwaga: Ważne jest również upewnienie się, że matryca znajduje się w poziomie podczas procesu utwardzania.
Część 2: Wycinanie mikrofluidycznego urządzenia neuronowego
<ol>
<li>Po utwardzeniu PDMS na matrycy, przenosi się go do komory z czystym powietrzem.</li>
<li>Za pomocą skalpela wycina się okrąg wokół obrysu urządzeń. Podczas wprowadzania ostrza w PDMS ważne jest, aby stykało się ono z wafla krzemowym, ale NIE wywierać zbyt dużego nacisku na wafelek, aby nie doprowadzić do pęknięcia matrycy.</li>
<li>Po wycięciu okręgu wokół urządzeń (na każdym 3" krzemowym wafelku matrycy znajdują się 4 urządzenia), PDMS ostrożnie oddziela się od matrycy. Można to rozpocząć od delikatnego obracania skalpela po wprowadzeniu go w miejsce wcześniejszego nacięcia.</li>
<li>Następnie w urządzeniu wycina się otwory na zbiorniki, używając wycinaka do biopsji tkanek o średnicy 8 mm.</li>
<li>Urządzenia są następnie dzielone na cztery części, a nadmiar PDMS jest przycinany tak, aby urządzenie idealnie pasowało do szkła okrywnego Corning (Nr 1) 24 mm x 40 mm. Do usunięcia resztek zanieczyszczeń używa się strumienia azotu. Uporczywe zanieczyszczenia można usunąć za pomocą winylowej taśmy 3M Scotch Brand 471.</li>
</ol>
Część 3: Bondowanie plazmowe urządzeń do szklanych kryształów.
<ol>
<li>Oczyszczacz plazmowy firmy Harrick jest używany do łączenia urządzeń neuronowych z szkiełkami przedmiotowymi. W skrócie, urządzenia umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym, a następnie za pomocą pompy próżniowej usuwa się powietrze z komory.</li>
<li>Po osiągnięciu ciśnienia próżni na poziomie 300 milliTorr, uruchamia się cewkę elektryczną, ustawiając ją na wysoką moc.</li>
<li>Cewka elektryczna wytwarza plazmę, czyli „częściowo zjonizowany gaz składający się z elektronów, jonów oraz neutralnych atomów lub cząsteczek” - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a>, z pozostałych w komorze cząsteczek powietrza. Plazma tworzy gatunki reaktywne na powierzchniach szkła i urządzenia, które po zetknięciu utworzą trwałe wiązanie. Plazma czyni również powierzchnie hydrofilowymi, co ułatwia wprowadzanie cieczy. Dodatkowo oczyszczacz plazmowy sterylizuje urządzenia. Powierzchnia urządzenia PDMS zawierającego układ mikroprzepływowy jest umieszczana stroną górną do góry w oczyszczaczu plazmowym wraz ze szkiełkami szklanymi. Wykutrowane plazmowo powierzchnie szkła i urządzenia mikroprzepływowego są łączone w kontakcie ze sobą&nbsp;w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie umieszczane w sterylnych szalkach o średnicy 60 mm. Przetraktowane powierzchnie tworzą szczelne, nieodwracalne wiązanie. </li>
<li>W ciągu 10 minut od połączenia urządzeń ze szkłem za pomocą plazmy, do urządzenia dodaje się poli-L-lizynę (PLL). Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia spadnie, co utrudni wnikanie PLL do wnętrza urządzenia. Uwaga: Ważne jest sprawdzenie urządzenia pod kątem pęcherzyków powietrza po dodaniu PLL. Pęcherzyki powietrza w głównym kanale są niewskazane, ponieważ mogłyby utlenić komórki. Prosta metoda usuwania istniejących pęcherzyków powietrza polega na użyciu pipety P200 wypełnionej 150 ul cieczy (w tym przypadku PLL), umieszczeniu końcówki bezpośrednio przy wlocie do głównego kanału i gwałtownym naciśnięciu tłoka pipety P200. Może to wymagać kilkukrotnego powtórzenia, ale ostatecznie siła z pipety wypchnie pęcherzyki na zewnątrz. </li>
<li>Urządzenia zawierające PLL inkubuje się przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C przy 5% CO2.</li>
<li>Następnego dnia urządzenia płucze się szybko dwukrotnie autoklawowaną dH2O. Podczas tego procesu ciecz nie jest całkowicie usuwana z głównych kanałów, a jedynie z rezerwuarów. Usunięcie cieczy z głównych kanałów spowoduje wprowadzenie pęcherzyków powietrza. Po dwóch szybkich płukaniach urządzenia wypełnia się autoklawowaną dH2O i ponownie umieszcza w inkubatorze na minimum 3 godziny lub przez noc.</li>
<li>Następnego dnia urządzenia ponownie płucze się szybko 2 razy autoklawowaną dH2O. Następnie do urządzeń dodaje się podstawową pożywkę dla neuronów, zawierającą niezbędne suplementy B27 i glutamax do hodowli pierwotnych neuronów szczura. Urządzenia umieszcza się z powrotem w inkubatorze do późniejszego użycia. Urządzenia są teraz gotowe do wysiewu neuronów.</li>
</ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

W tym filmie zademonstrowaliśmy sposób wykonania i przygotowania mikrofluidycznego urządzenia z PDMS, którego używamy do hodowli neuronów. Urządzenie to pozwala na uzyskanie czystej frakcji aksonalnej oddzielonej mikrowrowCountami od komory zawierającej mieszaninę ciał komórkowych, dendrytów i aksonów. Urządzenia te umożliwiają badaczowi analizę wpływu różnych zabiegów, a także stanowią platformę do wywoływania fizycznych uszkodzeń aksonów i obserwacji efektów, jakie te zabiegi wywierają na neurony. Urządzenie zapewnia również poziom uporządkowania hodowli neuronów, który ułatwia badania transportu. Ponadto mikrowrowCounty oddzielające komorę hodowli komórkowej od komory aksonalnej zapewniają izolację fluidyczną między obiema komorami, co umożliwia traktowanie jednej strony urządzenia bez bezpośredniego oddziaływania preparatu na drugą stronę. Właściwość ta pozwala badaczowi na analizę takich efektów jak transdukcja sygnału i transport wynikające z zastosowanego zabiegu.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Odczynnik</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 z utwardzaczem. Prosimy skontaktować się z firmą Dow Corning w celu znalezienia najbliższego dostawcy</td></tr><tr><td>Oczyszczacz plazmowy</td><td>Narzędzie</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Neural Basal Media</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Neural Basal Media jest dostarczane przez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 jest zastrzeżoną suplementacją dostępną poprzez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Glutamax jest dostępny poprzez firmę Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakładkowe Corning No. 1</td><td>szkiełko nakładkowe</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Dostępne poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy Fish 12-531D</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Sterylne polistyrenowe szalki Petriego o średnicy 60 mm służą do przechowywania urządzenia przytwierdzonego do szkła.</td></tr><tr><td>Probówka BD Falcon 50 ml</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Dostępna poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-49A</td></tr><tr><td>Probówka BD Falcon 15 ml</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Dostępna poprzez Fisher Scientific, numer katalogowy 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

W tym filmie prezentujemy technikę miękkiej litografii z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego do hodowli neuronów. Wcześniej, na waflu krzemowym, za pomocą SU-8 i fotolitografii naniesiono wzór urządzenia mikrofluidycznego do neuronów, aby stworzyć formę główną, którą nazywamy po prostu „masterem”. Następnie wylewamy polimer krzemowy PDMS na master, który jest następnie utwardzany poprzez podgrzanie PDMS do 80°C przez 1 godzinę. PDMS tworzy negatywową formę urządzenia. Następnie PDMS jest ostrożnie wycinany i oddzielany od mastera. W miejscach, gdzie znajdować się będą zbiorniki, wykonuje się otwory, a nadmiar PDMS jest odcinany od urządzenia. Do usunięcia wszelkich zanieczyszczeń z urządzenia używa się azotu. Na tym etapie urządzenia są już gotowe do użycia i mogą zostać trwale połączone z szkiełkiem podstawowym Corning No. 1 za pomocą sterylizatora/czyścika plazmowego lub mogą zostać odwracalnie połączone ze szkiełkiem poprzez zwykłe umieszczenie urządzenia na jego powierzchni. Odwracalne łączenie urządzenia ze szkłem jest omówione w osobnym filmie i wymaga uprzedniej sterylizacji urządzenia 70% etanolem lub w autoklawie. Traktowanie plazmą sterylizuje urządzenia, więc dalsza obróbka nie jest konieczna. Ważne jest jednak, aby podczas traktowania urządzeń plazmą dodać do nich ciecz w ciągu 10 minut od zabiegu, gdy powierzchnie są jeszcze hydrofilowe. Odczekanie dłużej niż 10 minut przed dodaniem cieczy utrudnia jej wprowadzenie do urządzenia. Urządzenia do neuronów są zazwyczaj łączone ze szkiełkiem podstawowym za pomocą plazmy, a następnie do urządzenia natychmiast dodaje się 0,5 mg/ml poli-L-lizyny (PLL) w buforze boratowym o pH 8.5. Po inkubacji z PLL przez minimum 3 godziny, urządzenia są płukane wodą dH2O co najmniej 3 razy, z odstępem co najmniej 15 minut między każdym płukaniem. Następnie wodę usuwa się i dodaje do urządzenia świeże medium. W tym momencie urządzenie jest gotowe do użycia. Należy pamiętać, aby od tego momentu nigdy nie usuwać całego medium z urządzenia. W kanale głównym zawsze powinno pozostać medium.

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

W niniejszym filmie prezentujemy technikę miękkiej litografii z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikrofluidycznego do ...

Witamy w laboratorium dr. Newly’ego Johna. Laboratorium Johna specjalizuje się w projektowaniu mikrofluidycznych platform do zastosowań biologicznych. W tym filmie zaprezentujemy proces wytwarzania i wykorzystania urządzenia mikrofluidycznego zaprojektowanego do kompartymentacji i hodowli pierwotnych neuronów.Urządzenie do badania neuronów zostało po raz pierwszy opisane w czasopiśmie Nature Methods w sierpniu 2005 roku. Od momentu wprowadzenia urządzenie to jest szeroko wykorzystywane przez współpracowników na całym świecie. Urządzenie składa się z fragmentu PDMS odlanego na płytce krzemowej zawierającej wzór SUA urządzenia, który został wcześniej wytworzony metodą fotolitografii.Urządzenie posiada trzy główne cechy: cztery zbiorniki o średnicy 8 mm, dwa główne kanały o szerokości 1,5 mm, długości 7 mm i wysokości 100 µm oraz mikrowżebienia o szerokości 10 µm i wysokości 3 µm, które łączą oba główne kanały. Długość mikrowżebień może wynosić od 150 µm do 900 µm, choć standardowo wybiera się długość 450 µm. Patrząc na urządzenie tak, aby główne kanały i mikrowżebienia znajdowały się w pionie, można zauważyć, że zbiorniki po lewej stronie wżebień są połączone za pomocą głównych kanałów, podobnie jak zbiorniki po prawej stronie.Ta cecha umożliwia przepływ cieczy przez główny kanał, co jest istotne, ponieważ pozwala na wprowadzanie komórek i wymianę pożywki. Urządzenie do hodowli neuronów posiada trzy główne zalety w porównaniu z tradycyjnymi platformami do hodowli tkanek. Po pierwsze, umożliwia ono oddzielenie ciał komórkowych (somy) od aksonów. Dzięki zastosowaniu tego urządzenia możliwe jest uzyskanie czystych frakcji aksonalnych.Rozmiar i długość mikrowgłębień umożliwiają przechodzenie aksonów przez drugi główny kanał, zapobiegając jednocześnie przechodzeniu ciał neuronów. Po drugie, dzięki konstrukcji urządzenia i wykorzystaniu ciśnienia hydrostatycznego, możliwe jest poddanie strony komórkowej lub strony aksonowej urządzenia odrębnym zabiegom poprzez utrzymanie wyższego poziomu cieczy w zbiornikach po jednej stronie urządzenia względem drugiej. Po trzecie, czystą frakcję aksonalną urządzenia można odciąć za pomocą ssania próżniowego, co pozwala badaczowi na analizę i obserwację regeneracji aksonów.Badaczka Hina Lee zaprezentuje teraz sposób przygotowania mikrofluidycznego urządzenia do hodowli neuronów. Do odlewania formy mikrofluidycznej z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykorzystuje się podłoże krzemowe o grubości 3 Ang z wzorem wykonanym z SU-8 metodą fotolitografii. Podłoże krzemowe z wzorem SU-8 nazywamy formami matrycowymi lub po prostu matrycami.PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1. Przykładowo, stosuje się 15 g PDMS na 1,5 g utwardzacza. Następnie PDMS dokładnie miesza się i wlewa na wafle krzemowe.Wafer krzemowy umieszczony jest w polistyrenowej szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów. Do pokrycia MAs warstwą o grubości około czterech milimetrów potrzeba od około 12 gramów do 15 gramów PDMS. Następnie matrycę z PDMS umieszcza się w deskrypatorze próżniowym z otwartą pokrywą szalki Petriego i przykład się próżnię.Czynność tę wykonuje się, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza z PDMS, które pojawiły się podczas mieszania środka utwardzającego. Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut. Po 15 minutach przebywania w deskrypatorze próżniowym matrycę z PDMS wyjmuje się z urządzenia.Na matrycy PDMS wciąż znajduje się kilka pęcherzyków powietrza. Do usunięcia pozostałych pęcherzyków używa się pistoletu powietrznego z filtrem 0,45 mikrona. Następnie matrycę umieszcza się na płycie grzewczej o temperaturze 80 stopni przez jedną godzinę w celu utwardzenia.Jeśli suszarka próżniowa nie jest dostępna, mieszankę można pozostawić w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Pęcherzyki powietrza z czasem znikną same. W przypadku braku płyty grzewczej PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.Ważne jest, aby upewnić się, że matryca znajduje się w poziomie podczas procesu utwardzania. Po utwardzeniu PDMS na matrycy, zostaje on przeniesiony do komory z laminarnym przepływem powietrza za pomocą skalpela. Wzdłuż obwodu urządzeń wykonuje się cięcie okrężne.Ważne jest, aby podczas wkładania ostrza w PDMS w celu nawiązania kontaktu z waflą krzemową nie wywierać zbyt dużego nacisku na waflę, w przeciwnym razie matryca pęknie, a urządzenia zostaną przecięte w całości w okrąg. Na każdej trzymacierowej wafli krzemowej znajdują się cztery urządzenia. Następnie ostrożnie oddziela się PDMS od matrycy.Można to rozpocząć od delikatnego obracania skalpela podczas wprowadzania go w miejsce poprzedniego nacięcia. Urządzenia z PDMS na formie są bardzo cienkie. Rezerwuary skierowane powierzchnią do góry wykonuje się w urządzeniu, używając ośmiomilimetrowego dziurkacza do biopsji tkanek.Pozostałości materiału w wycinaku są wypychane za pomocą pręta. Następnie urządzenia są dzielone na ćwiartki, a nadmiar PDMS jest przycinany tak, aby urządzenie idealnie pasowało do szkiełka nakrywkowego Corning. Używa się strumienia azotu, aby wydmuchać wszelkie pozostałości ze szkiełka nr 1 o wymiarach 24 mm na 40 mm.Uporczywe zanieczyszczenia można również usunąć za pomocą taśmy winylowej 3M Scotch Brand 4 7 1. Oczyszczone urządzenia są teraz gotowe do wiązania plazmowego. W celu krótkotrwałego przytwierdzenia urządzeń neuronowych do szkiełek podstawowych wykorzystuje się cleaner plazmowy Herrick.Urządzenia oraz szkiełka nakrywki umieszcza się na tacy, którą następnie wstawia się do oczyszczacza plazmowego, a za pomocą pompy próżniowej wypompowuje powietrze z komory. Należy zwrócić uwagę, aby urządzenia PDMS umieścić stroną górną do góry, tak aby powierzchnia z naniesionym wzorem była wystawiona na działanie gazu plazmowego.Po osiągnięciu ciśnienia próżni na poziomie 300 millitorr, włączone zostaje zasilanie cewki elektrycznej i ustawione na wysoką moc. Drzwi zostają lekko uchylone, aby doprowadzić niewielką ilość powietrza do komory, co pomoże w wygenerowaniu plazmy. Urządzenia oraz szkiełka nakrywkowe są poddawane traktowaniu plazmą przez dwie minuty.Zwróć uwagę na fioletowy kolor w komorze. Jest to właściwa plazma. Cewka elektryczna generuje plazmę, która jest częściowo zjonizowanym gazem składającym się z elektronów, jonów oraz neutralnych atomów lub cząsteczek.Plazma tworzy reaktywne formy chemiczne na powierzchni szkła oraz urządzenia, co po ich połączeniu prowadzi do powstania trwałego wiązania. Plazma sprawia również, że powierzchnia staje się hydrofilowa, co ułatwia dodawanie cieczy. Oczyszczacz plazmowy sterylizuje ponadto urządzenia.Po dwuminutowej obróbce plazmowej wyłącza się zasilanie w próżni i doprowadza powietrze do komory. Obrobione plazmowo powierzchnie szkła i urządzenia mikroprzepływowego są montowane w kontakcie ze sobą w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie urządzenia umieszcza się w sterylnych szalkach o średnicy 60 mm.Powierzchnie szkła i urządzenia poddane działaniu plazmy tworzą trwałe, nieodwracalne wiązanie. W ciągu 10 minut od wiązania plazmowego urządzenie zostaje przyłączone do szkła, a następnie do urządzenia dodaje się poliolizynę. Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia ulegnie zmniejszeniu.Utrudnia to wprowadzenie PLL do urządzenia. Po dodaniu PLL należy sprawdzić, czy w urządzeniu nie pojawiły się pęcherzyki powietrza. Prostym sposobem na usunięcie obecnych pęcherzyków powietrza jest użycie pipety P 200 wypełnionej 100 µL cieczy.W tym przypadku należy umieścić końcówkę pipety bezpośrednio przy otworze głównego kanału, a następnie energicznie wcisnąć tłok pipety P 200. Może to wymagać kilkukrotnego powtórzenia, jednak z czasem siła nacisku pipety wypchnie pęcherzyki powietrza. Urządzenia zawierające PLL inkubuje się przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.Po 24 godzinach inkubacji z PLL urządzenia płucze się dwukrotnie i szybko wodą dejonizowaną z autoklawu. Podczas tego procesu ciecz nie jest całkowicie usuwana z kanałów głównych, a jedynie z rezerwuarów. Usunięcie cieczy z kanałów głównych spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza.Po dwóch szybkich płukaniach urządzenia ponownie wypełnia się autoklawowaną wodą zdejonizowaną i umieszcza z powrotem w inkubatorze na minimum trzy godziny lub na całą noc. Następnego dnia, po inkubowaniu urządzeń w wodzie przez noc lub minimum trzy godziny, przenosi się je ponownie do komory biosafety i płucze dwukrotnie wodą zdejonizowaną. Następnie do urządzeń dodaje się pożywkę bazową dla neuronów (neural basal media) zawierającą niezbędne suplementy: B 27 oraz glutaminian do hodowli pierwotnych neuronów szczura.Następnie urządzenia są umieszczane z powrotem w inkubatorze do późniejszego użycia. Urządzenia są teraz gotowe do wysiewu neuronów. W tym filmie zaprezentowaliśmy technikę miękkiej litografii, której używamy do produkcji naszych urządzeń neuronowych.Urządzenia te mogą być wykorzystywane do hodowli neuronów oraz innych interesujących typów komórek. Główną zaletą tych urządzeń jest możliwość oddzielenia i przedzielenia hodowli ciał komórek neuronów po jednej stronie urządzenia od czystej frakcji aksonalnej po drugiej stronie. W następnym filmie pokażemy, w jaki sposób przygotowujemy neurony korowe z zarodków szczura w 18. dniu rozwoju (E 18) oraz jak wprowadzamy komórki do urządzenia.To wszystko z laboratorium Johna. Dziękujemy za oglądanie.

fabrication-microfluidic-device-for-compartmentalization-neuron-soma

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie urządzenia mikrofluidycznego do kompartmentalizacji somy neuronu i aksonów

W tym filmie demonstrujemy przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18).

Przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) do kompartymentacji w urządzeniu mikroprzepływowym

Niniejszy film opisuje wytwarzanie i zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Urządzenie to jest kompatybilne z...

BioMEMS: nawiązywanie nowych współprac pomiędzy biologami a inżynierami

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Ten film demonstruje wykorzystanie wstępnie zmontowanego plastikowego chipa mikroprzepływowego do podzielonej na przedziały hodowli pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Neurony są umieszczane w jednym z przedziałów mikroprzepływowych, gdzie przyczepiają się i rosną, przedłużając swoje aksony przez mikrorowki chipa do sąsiedniego przedziału. Wąskie mikrorowki zapobiegają przedostawaniu się ciał komórek neuronalnych, umożliwiając w ten sposób fizyczną separację między przedziałami somatycznymi...

Podzielona na przedziały pierwotna hodowla neuronów mysich przy użyciu plastikowych chipów mikroprzepływowych

Film pokazuje różnicowanie nerwowych komórek macierzystych (NSC) za pomocą urządzenia mikroprzepływowego składającego się z przedziału somatycznego i aksonalnego oddzielonych barierą mikrorowkową. NSC są wprowadzane do kompartmentu somatycznego i mogą przylegać. NSC różnicują się w neurony wewnątrz przedziału somatycznego i rozciągają aksony przez barierę mikrorowkową do przedziału aksonalnego.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych do neuronów za pomocą przedziałowego urządzenia mikroprzepływowego

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Obecny protokół opisuje zasiewanie i barwienie mitochondriów neuronalnych w komorach mikroprzepływowych. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach pozwala na selektywne traktowanie mitochondriów w aksonach w celu analizy ich właściwości w odpowiedzi na wyzwania farmakologiczne bez wpływu na przedział ciała komórki.

Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Poznaj technikę miękkiej litografii do wytwarzania mikroprzepływowych urządzeń z PDMS dla kultur neuronów. Ta metoda umożliwia kompartmentalizację som i aksonów w badaniach neurobiologicznych.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

Przeglądaj więcej filmów