Name: Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA przez peroksydacyjne i oksydacyjne śladowanie rodników hydroksylowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Poznaj metodę śladowania rodnikami hydroksylowymi do analizy struktury trzeciorzędowej RNA. Technika ta wykorzystuje reagenty Fentona do generowania rodników, które przecinają szkielet RNA w zależności od dostępności rozpuszczalnikowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty z National Institute of Health RO1-GM085130 oraz National Science Foundation MCB0929394. Dziękujemy dr Marion Schmidt za gościnność i umożliwienie nam nagrywania w jej laboratorium.

1. Przygotowanie odczynników do footprintingu
<ol>
	<li>Przygotować 10-krotny bufor reakcyjny zawierający 10 mM kacodylanu sodu, 1 mM EDTA i 1 M KCl. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować bufor za pomocą urządzenia filtrującego z filtrem octanowym 0,2 μM (Nalgene). Uwaga: nie pipetować RNA bezpośrednio do buforu 10x.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną do miareczkowania dla każdej reakcji zgodnie z Tabelą 1. Objętość mieszaniny miareczkującej (bufor 1x i Mg(II) o pożądanym stężeniu) powinna wynosić 90 μl przed dodaniem 10 μl RNA w buforze 1x.</li>
	<li>Przygotować bufor do trawienia RNazą T1 zawierający 6,63 M mocznika, 20 mM cytrynianu sodu, 1 mM EDTA, 0,25 μg/μl tRNA, 0,025% ksylen cyanolu oraz 0,025% błękitu bromofenolowego. Bufor ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
	<li>Reakcja Fentona wymaga świeżo przygotowanych roztworów wodnych 250 mM Fe(NH4)2(SO4)2, 250 mM EDTA i 500 mM L-askorbinianu sodu. Stężenia podane w rozdziale 1.5 są optymalne dla eksperymentów równowagowych w buforach takich jak kacodylan sodu, który nie wychwytuje rodników, oraz dla różnych stężeń jonów dwuwartościowych.</li>
	<li>Odczynniki do reakcji footprintingu peroksydacyjnego (1.5.1) i oksydacyjnego (1.5.2).
	<ol>
		<li>Peroksydacyjna reakcja Fentona wymaga świeżo przygotowanych roztworów wodnych 10 mM Fe-EDTA, 50 mM L-askorbinianu sodu oraz 1,5% H2O2. Roztwór Fe-EDTA przygotowuje się poprzez zmieszanie Fe(NH4)2(SO4)2 z EDTA w taki sposób, aby zachować 1,1-krotny nadmiar EDTA nad żelazem.</li>
		<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji cięcia oksydacyjnego (3.4.2), przygotować mieszaninę reakcyjną Fentona, łącząc 2 μl Fe(NH4)2(SO4)2 (250 mM), 2,2 μl EDTA (250 mM), 62,5 μl L-askorbinianu sodu (50 mM), 2,5 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego oraz 135,5 μl H2O, aby uzyskać w końcowej mieszaninie reakcji footprintingu (3.4.2) stężenia odpowiednio 0,10 mM, 0,1 mM i 6,61 mM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie RNA do eksperymentu footprintingu
<ol>
	<li>RNA można uzyskać poprzez standardową transkrypcję in vitro matryc DNA6 lub, w przypadku sekwencji krótszych niż 50 nukleotydów, zakupić (np. w Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). W celu zachowania integralności próbek RNA podczas eksperymentów z footprintingiem należy stosować zalecane procedury czystości laboratoryjnej.7</li>
	<li>Przed znakowaniem końca 5' RNA za pomocą 32P konieczna jest defosforylacja8 RNA otrzymanego w transkrypcji in vitro. 10 pmol RNA znakuje się na końcach poprzez kinazowanie.9 Po skutecznej inaktywacji fosfatazy roztwór powinien stać się mętny.</li>
	<li>Radioaktywnie znakowane RNA należy oczyścić za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu. RNA odzyskuje się poprzez dwie następujące po sobie ekstrakcje z żelu przy użyciu 0.3 M octanu sodu (pH 5.5). RNA wytrącamy, mieszając 0.5 ml roztworu wodnego z 1 ml etanolu, a następnie inkubując przez 1 minutę na suchym lodzie. Próbkę wirować w temperaturze 4 °C, przy 1250 rpm przez 0.5 hr. Odrzucić nadsącz i przemyć osad RNA 70% etanolem. Po dodatkowym wirowaniu usunąć nadsącz i wysuszyć osad w próżni.</li>
	<li>Próbki RNA znakowanego 32P rozpuścić w 30 ul 1x Buforu. Do probówki reakcyjnej pipetować 30 μl roztworu RNA, wytrącić etanolem i wysuszyć RNA w próżni; probówkę tę zachować do przygotowania drabinki referencyjnej (krok 3.5). Roztwór RNA w buforze denaturować poprzez ogrzewanie w 95 °C przez 2 min. Próbki chłodzić do temperatury pokojowej przez 15 min, a następnie krótko wirować, aby przenieść kondensat z pokrywek probówek z powrotem do roztworu.</li>
</ol>
3. Eksperyment footprintingu
<ol>
	<li>Grzebień do elektroforezy określa maksymalną liczbę punktów danych na jednym żelu analitycznym. Używamy grzebienia 30-dołkowego. Drabina referencyjna zajmuje 2 dołki, a kontrola niepocięta – jeden. Przygotuj 27 probówek reakcyjnych. Końcowe stężenia Mg(II) powinny być rozmieszczone równomiernie w skali logarytmicznej, obejmując rzędy wielkości wokół punktu środkowego miareczkowania.</li>
	<li>Oddzielnie inkubuj RNA i roztwory Mg(II) w temperaturze 50°C przez 5 min. Wymieszaj 10 μl roztworu RNA z 90 μl odpowiedniej ilości Mg(II) w buforze 1x, aby uzyskać końcową objętość 10 μl. Inkubuj roztwory przez 30 min w temperaturze 50°C.</li>
	<li>Pozostaw roztwory do wyrównania temperatury do 25°C na 1 h, aby umożliwić proces zwijania.</li>
	<li>Reakcja footprintingu rodnikami hydroksylowymi w wariancie peroksydacyjnym (3.4.1) lub oksydacyjnym (3.4.2).
	<ol>
		<li>Rozpocznij reakcję peroksydacyjną, umieszczając krople 2 μl Fe-EDTA (10 mM), 2 μl L-askorbinianu sodu (50 mM) i 2 μl H2O2 (1,5%) oddzielnie od siebie w górnej części wnętrza probówki reakcyjnej zawierającej roztwór RNA, a następnie zainicjuj reakcję footprintingu poprzez energiczne mieszanie. Przerwij reakcję po 15 sekundach, dodając 30 μl zimnego etanolu bezwodnego. Obróć probówki 3-5 razy. Wytrąć, przemyj i wysusz osad zgodnie z instrukcją w kroku 2.4.</li>
		<li>Rozpocznij reakcję footprintingu rodnikami hydroksylowymi wariancie oksydacyjnym, dodając 5 μl świeżo przygotowanej mieszaniny do reakcji Fentona (1.6). Inkubuj przez 30 min w temperaturze 25°C. Dodaj 30 μl zimnego etanolu bezwodnego, aby wygasić reakcję, i wymieszaj, obracając probówki 3-5 razy. Wytrąć, przemyj i wysusz osad zgodnie z instrukcją w kroku 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj referencyjną próbkę trawioną RNazą T1 zgodnie ze standardowymi procedurami10, wykorzystując roztwór przygotowany w kroku 1.3.</li>
	<li>Rozpuść osady RNA w 8 μl barwnika do ładowania żelu II (AMBION) i potwierdź resuspensję RNA za pomocą licznika Geigera.</li>
	<li>Przygotuj denaturujący, 8% żel sekwencyjny z poliakryloamidu zgodnie ze standardowymi protokołami.1 Nałóż próbki, w tym dwa referencje i kontrolę. Rozdziel fragmenty RNA przy mocy 60 W - 75 W przez 2,5 h. Naświetl wysuszony żel na ekranie fosforowym przez całą noc. Zeskanuj ekran fosforowy za pomocą systemu obrazowania do bezfilmowej autoradiografii, np. Storm 865 (GE Healthcare) lub Typhoon (GE Healthcare). Prześlij plik z obrazem żelu na komputer.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Reaktywność każdego nukleotydu na rodniki hydroksylowe określa się poprzez ilościowe oznaczenie natężenia każdego prążka na żelu analitycznym. Należy pobrać, zainstalować i uruchomić SAFA – łatwe w użyciu oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym służące do dopasowywania i ilościowego oznaczania pojedynczych prążków.12, 13 Postępuj zgodnie z instrukcjami w instrukcji obsługi. W skrócie: załaduj sekwencję RNA jako plik .txt, a następnie obraz żelu jako plik .gel. Dostosuj intensywność pręg, zdefiniuj ścieżki, wybierz ścieżkę kotwiczącą i przeprowadź wyrównanie żelu. Przypisanie pręg do nukleotydów odbywa się w odniesieniu do drabiny trawienia RNazą T1. Ilościowo określ całki pręg i użyj funkcji normalizacji/wykresu kolorystycznego (colorplot), aby znormalizować i przypisać potencjalnie niezmienne reszty. Zapisz wynik jako plik .txt.</li>
	<li>Program SAFA generuje arkusz kalkulacyjny zawierający kolumny odpowiadające ścieżkom na żelu oraz wiersze reprezentujące zintegrowaną gęstość prążków poszczególnych pasm odpowiadających fragmentowi RNA. W pierwszej kolejności należy zidentyfikować miejsca ochrony, w których występuje zauważalna zmiana dostępności dla rozpuszczalnika, porównując profil ochrony uzyskany z próbki bez Mg(II) z profilem dla końcowego stężenia Mg(II) (w naszym przykładzie 50 mM). Im niższa wartość, tym bardziej nukleotyd jest chroniony przed atakiem rodników hydroksylowych i na odwrót.</li>
	<li>Stwórz izotermy zwijania na podstawie znormalizowanych całek z pasm poszczególnych nukleotydów lub ich grup w funkcji stężenia Mg(II). Izotermy są indywidualnie skalowane do frakcyjnego wysycenia według wzoru fi = L + (U - L)•<img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Równowaga statyczna; ΣFy=0; schemat równowagi sił; nauczanie fizyki; analiza sił wektorowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Y"> gdzie f oznacza zintegrowaną gęstość analizowanego pasma (pasm), L i U reprezentują dolną i górną granicę przejścia, a <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Równowaga statyczna; ΣFy=0; schemat równowagi sił; edukacja w zakresie fizyki; analiza wektorów sił." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Y"> jest stopniem nasycenia.14 Dane dopasowano do równania Hilla (1) przy użyciu programu do nieliniowej analizy najmniejszych kwadratów (stosujemy program Origin (OriginLab) lub GraphPad (GraphPad Software, Inc.)), 
	<img alt="Równanie izotermy wiązania; Ȳ=K_d^n[M]^n/(1+K_d^n[M]^n); formuła termodynamiczna." src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Kd jest stałą dysocjacji równowagowej, [M] odpowiada stężeniu zmiennej pośredniczącej w reakcji zwijania (w tym przykładzie Mg(II)), a nH jest współczynnikiem Hilla. Procedura ta skaluje przejście do frakcyjnego wysycenia, wyznacza jego punkt środkowy oraz stanowi fenomenologiczny test sprawdzający, czy przejście ma charakter sigmoidalny. Izotermy uzyskane z żeli sekwencyjnych (Rysunek 3A), które zostały przeanalizowane za pomocą programu SAFA (Rysunek 3B) i dopasowane zgodnie z powyższym opisem, przedstawiono na Rysunku 3C. Izotermy frakcyjnego wysycenia pokazane na Rysunku 3 zostały wygenerowane poprzez przeskalowanie w arkuszu kalkulacyjnym wartości uzyskanych z programu SAFA względem najlepiej dopasowanych górnych i dolnych limitów (U i L) stosując równanie ułamek = wartość /(U - L) - L /(U - L).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne wyniki eksperymentów footprintingu RNA P4-P6 z użyciem •OH. Obraz żelu (po lewej) wskazuje, że a) cięcie tła jest minimalne (prawa ścieżka), b) możliwe jest przypisanie pojedynczych nukleotydów dzięki wyraźnym prążkom w ścieżce T1 (RNaza T1 tnie przy każdej guaninie G), oraz c) fragmentacja RNA indukowana rodnikami hydroksylowymi znajduje się znacznie powyżej poziomu tła. Przejście z niskiego na wysokie stężenie Mg(II) wiąże się ze spadkiem zintegrowanej gęstości prążków poszczególnych i grup prążków, co wskazuje na formowanie się trzeciorzędowej struktury RNA. Pojedyncze nukleotydy lub grupy sąsiadujących nukleotydów, których stopień cięcia zmienia się jednocześnie, określa się mianem „ochrony”. Protekcje przed •OH charakterystyczne dla fałdowania RNA P4-P6 indukowanego przez Mg(II) ściśle odpowiadają regionom cząsteczki niedostępnym dla rozpuszczalnika, zaobserwowanym w jej strukturze krystalicznej.15
Złożone cząsteczki RNA mogą wykazywać bardzo zróżnicowany zakres ochrony kontaktów trzeciorzędowych (t.j. stopień spadku gęstości prążków w stronę tła), co nie zostało powiązane z jasnymi zjawiskami strukturalnymi lub dynamicznymi. W związku z tym niektóre cząsteczki RNA będą wykazywać wyraźnie zdefiniowane przejścia strukturalne, jak pokazano na Ryc. 3, a inne nie. Intensywności prążków są kwantyfikowane i normalizowane za pomocą analizy SAFA12 (Rycyna 3B). Wynikiem jest wykres „termiczny” wizualizujący wzglotny stopień ochrony przed •OH. Przejście kolorystyczne opisuje zmianę dostępności po dodaniu Mg(II). Kolor od białego do czerwonego lub niebieskiego wskazuje odpowiednio na nukleotydy bardziej dostępne lub bardziej chronione. Każdemu stopniowi zacienienia przypisana jest wartość liczbowa, którą można przedstawić jako krzywą ochrony (Rycina 3C) i przeanalizować za pomocą modelu wiązania, np. równania Hilla (1). Stała dysocjacji równowagowej przypisana do ochrony 153-15 jest w przybliżeniu dwukrotnie wyższa od odpowiadającej jej wartości dla ochrony 163-164.
<img alt="Schemat reakcji chemicznej rozszczepiania DNA przez Fe(II)-EDTA pod wpływem Mg²⁺; proces rodnikowy z udziałem rodników hydroksylowych." src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Produkcja rodników hydroksylowych i zwijanie RNA P4-P6. A) Fe(II) katalizuje generowanie rodników hydroksylowych z nadtlenku wodoru. Askorbinian redukuje Fe(III) z powrotem do żelaza dwuwartościowego. B) Wobec braku Mg(II) nie tworzy się struktura trzeciorzędowa P4-P6, co pozwala rodnikom hydroksylowym na penetrację i rozcięcie wszystkich dostępnych pozycji szkieletu. Dodanie Mg(II) inicjuje zwijanie P4-P6, w wyniku czego rodniki hydroksylowe rozcinają jedynie fragmenty szkieletu dostępne dla rozpuszczalnika.
<img alt="znakowanie i oczyszczanie RNA; schemat z denaturującą elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE), mapowaniem śladu grupy hydroksylowej, analizą fragmentów." src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat eksperymentu z mapowania śladów rodników hydroksylowych. A) Defosforylacja i 32P znakowanie końca 5' RNA. B) Oczyszczanie 32RNA znakowane fosforem (P) na denaturującym żelu poliakrylamidowym. C) Wycięcie prążka RNA, następująca po nim ekstrakcja RNA i wytrącanie etanolowe. D) Prefolding i folding RNA. E) Dodanie świeżo przygotowanej mieszaniny do reakcji Fentona w celu wygenerowania rodników hydroksylowych. F) Rozdział fragmentów RNA za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. G) Ilościowe oznaczenie fragmentów RNA za pomocą oprogramowania SAFA.
<img alt="Elektroforeza w żelu, analiza wiązania Mg²⁺, krzywe nasycenia, badanie oddziaływań białko-ligand." src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Analiza fragmentów RNA po reakcji footprintingu peroksydacyjnego Fentona. (A) RNA poddano działaniu rodników hydroksylowych, a produkty cięcia rozdzielono za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Na zdjęciu przedstawiono produkty cięcia peroksydacyjnego przy rosnącym stężeniu Mg(II). Oznaczono ścieżki referencyjne i kontrolne. Plik obrazu ten stanowi dane wejściowe dla programu SAFA, który ilościowo określa objętość każdego pasma. (B) Wykres „termiczny” wygenerowany przez program SAFA. (C) Arkusz wartości z programu SAFA, wiążący zintegrowaną gęstość pasma z numerem nukleotydu, jest analizowany za pomocą modelu wiązania, takiego jak równanie Hilla (1). Obszary ochrony wybrano na podstawie wzrostu całki gęstości pasma w funkcji stężenia Mg(II). Wartość Kd jest stężeniem Mg(II), przy którym połowa cząsteczek RNA jest sfałdowana w monitorowanym obszarze. Współczynnik Hilla, nHjest miarą nachylenia krzywej, która dostarcza informacji o kooperatywności wiązania i pozwala na określenie dolnej granicy liczby jonów magnezu zaangażowanych w zwijanie tej konkretnej domeny.
<img alt="Przygotowanie reakcji RNA, tabela końcowych stężeń Mg(II), zmienne warunki, dane eksperymentu laboratoryjnego." src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Objętości reprezentatywne dla generowania próbek RNA zawierających różne stężenia Mg(II).

<ol><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+%22footprinting%22%3A+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%28II%29-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides%3A+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li>
<li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li>
<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+footprinting%3A+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).</li>
<li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme%3A+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li>
<li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li>
<li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAFA%3A+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+%2AOH+radical+footprinting+data+using+SAFA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li>
<li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li>
<li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain%3A+principles+of+RNA+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li>
<li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nucleic+acids+footprinting%3A+thermodynamic+and+kinetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li>
<li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+RNA+compaction%3A+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li>
<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+DNase+footprint+titration%3A+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Mapowanie odcisków rodników hydroksylowych jest cennym narzędziem do oceny powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika w kwasach nukleinowych. Jakościowe i ilościowe wyznaczanie struktury trzeciorzędowej14 można śledzić w zależności od parametrów takich jak rodzaj i stężenie jonów, pH, temperatura, białka wiążące lub kofaktory fałdowania. Przekonujące połączenie prostego i niedrogiego protokołu z uzyskanymi informacjami o dostępności rozpuszczalnika i fałdowaniu na poziomie pojedynczych nukleotydów sprawia, że m...

<table><tbody><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Nr kat.</td><td></td></tr><tr><td>Kacodylan sodu (Uwaga! Toksyczny) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Woda traktowana DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNaza T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie zmian równowagi w strukturze rna za pomocą „peroksydacyjnego” i „oksydacyjnego” mapowania śladów rodników hydroksylowych

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Cząsteczki RNA odgrywają kluczową rolę w biologii. Oprócz przekazywania informacji genetycznej, RNA może zwijać się w unikalne struktury trzeciorzędowe, pełniąc specyficzne funkcje biologiczne jako regulator, ligand lub katalizator. Informacje o tworzeniu kontaktów trzeciorzędowych są niezbędne do zrozumienia funkcji cząsteczek RNA. Rodniki hydroksylowe (•OH) stanowią unikalne sondy struktury kwasów nukleinowych ze względu na swoją wysoką reaktywność i niewielki rozmiar.1 Stosowane jako sonda w technice footprintingu, rodniki hydroksylowe mapują powierzchnię dostępną dla rozpuszczalnika w szkielecie fosfodiestrowym DNA1 i RNA2 z rozdzielczością sięgającą pojedynczego nukleotydu. Footprinting rodnikami hydroksylowymi może być wykorzystany do identyfikacji nukleotydów w obrębie międzycząsteczkowej powierzchni kontaktu, np. w kompleksach DNA-białko1 i RNA-białko. Przejścia równowagowe3 i kinetyczne4 można określić, prowadząc footprinting rodnikami hydroksylowymi odpowiednio w funkcji zmiennej roztworu lub czasu. Kluczową cechą footprintingu jest to, że ograniczona ekspozycja na sondę (np. „kinetyka pojedynczego uderzenia”) skutkuje jednorodnym próbkowaniem każdego nukleotydu polimeru.5
W niniejszym artykule wideo wykorzystujemy domenę P4-P6 rybozymu Tetrahymena, aby zilustrować przygotowanie próbek RNA oraz wyznaczenie izoterm zwijania pośredniczonego przez Mg(II). Opisujemy zastosowanie znanego protokołu footprintingu rodnikami hydroksylowymi, który wymaga użycia H2O2 (nazywamy go protokołem „peroksydacyjnym”), oraz cenną, lecz mniej znaną alternatywę z wykorzystaniem naturalnie rozpuszczonego O2 (którą nazywamy protokołem „oksydacyjnym”). Przedstawiono również przegląd procedur redukcji, transformacji i analizy danych.

Niniejszy protokół opisuje sposób ilościowego oznaczania zależnego od Mg(II) tworzenia trzeciorzędowej struktury RNA za pomocą dwóch metod footprintingu z użyciem rodników hydroksylowych.

Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA za pomocą „peroksydacyjnego” i „oksydacyjnego” mapowania śladów rodników hydroksylowych

Cząsteczki RNA odgrywają kluczową rolę w biologii. Oprócz przekazywania informacji genetycznej, RNA może zwijać się w unikalne struktury trzeciorzędowe, które pełnią...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ustalenie, w jaki sposób zwijają się cząsteczki RNA, przy użyciu metody footprintingu rodnikami hydroksylowymi. Cel ten osiąga się poprzez znakowanie końców, oczyszczanie żelowe i wstępne zwijanie RNA, co zapewnia integralność konformacyjną RNA przed następnym etapem, czyli zwijaniem indukowanym przez magnez; następnie miesza się odczynniki Fentona w celu wygenerowania rodników hydroksylowych, które mogą następnie przeciąć szkielet RNA zgodnie z jego dostępnością dla rozpuszczalnika. Następnie produkty cięcia RNA są rozdzielane za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i wizualizowane metodą autoradiografii.Całki pasm są ilościowo określane za pomocą oprogramowania do półautomatycznej analizy footprintingu. Końcowym celem jest wygenerowanie izoterm fałdowania odzwierciedlających tworzenie struktury trzeciorzędowej RNA. Osiąga się to poprzez skalowanie znormalizowanych całek pasm do ułamkowego nasycenia.Izotermy można następnie dopasować do równania Hilla. Główną zaletą mapowania śladów grup hydroksylowych jest uzyskanie informacji o strukturze trzeciorzędowej RNA przy użyciu niedrogich odczynników; ze względu na wyż

monitoring-equilibrium-changes-rna-structure-peroxidative-oxidative

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA przez „peroksysacyjne” i „oksydacyjne” odwzorowanie wolnych rodników hydroksylowych

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek in vivo (IV-FPOP) to technika śladu białek rodników hydroksylowych, która pozwala na mapowanie struktury białek w ich naturalnym środowisku. Protokół ten opisuje montaż i konfigurację mikroprzepływowego systemu przepływu IV-FPOP.

Ślad białka rodnika hydroksylowego in vivo do badania interakcji białkowych w Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy strukturę białek i miejsca interakcji w żywych komórkach za pomocą techniki śladu białkowego, zwanej szybkim fotochemicznym utlenianiem białek w komórce (IC-FPOP).

Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Szybkie fotochemiczne utlenianie białek to nowa technika strukturalnej charakterystyki białek. Różne dodatki rozpuszczalnikowe i ligandy mają różne właściwości wymiatania rodników hydroksylowych. Aby porównać strukturę białka w różnych warunkach, wymagana jest kompensacja w czasie rzeczywistym rodników hydroksylowych powstających w reakcji w celu normalizacji warunków reakcji.

Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim utlenianiu fotochemicznym białek w celu określenia zmian topografii białek

Ten protokół przedstawia metodę wykorzystania wbudowanej dozymetrii rodnikowej i plazmowego źródła światła do przeprowadzenia błyskawicznego śladu białkowego utleniania. Metoda ta zastępuje niebezpieczny laser UV w celu uproszczenia i poprawy odtwarzalności szybkich badań utleniania fotochemicznego białek.

Bezlaserowe śladowanie białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Poznaj metodę śladowania rodnikami hydroksylowymi do analizy struktury trzeciorzędowej RNA. Technika ta wykorzystuje reagenty Fentona do generowania rodników, które przecinają szkielet RNA w zależności od dostępności rozpuszczalnikowej.

Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA za pomocą „peroksydacyjnego” i „oksydacyjnego” mapowania śladów rodników hydroksylowych

Przeglądaj więcej filmów