Monitorowanie zmian równowagi w strukturze RNA przez "peroksydacyjne" i "oksydacyjne" śladowanie rodników hydroksylowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, w jaki sposób cząsteczki RNA fałdują się za pomocą śladu rodnika hydroksylowego. Osiąga się to poprzez znakowanie końcowe, oczyszczanie żelu i wstępne fałdowanie RNA, co zapewnia potwierdzenie integralności RNA przed fałdowaniem za pośrednictwem magnezu w kolejnym kroku odczynniki Fentona są mieszane w celu wytworzenia rodników hydroksylowych, które mogą następnie rozszczepić szkielet RNA zgodnie z jego dostępnością rozpuszczalnika. Następnie produkty rozszczepienia RNA są rozdzielane przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym denaturacji i wizualizowane za pomocą automatycznej radiografii.

Całki pasmowe są określane ilościowo za pomocą półautomatycznego oprogramowania do analizy śladów. Ostatecznym celem jest wygenerowanie izoterm fałdowania odzwierciedlających tworzenie się trzeciorzędowej struktury RNA. Osiąga się to poprzez skalowanie znormalizowanych całek pasmowych do nasycenia ułamkowego.

Izotermy można następnie dopasować do równania wzgórza. Główną zaletą śladu hydroksylowego jest to, że uzyskuje się trzeciorzędowe informacje o strukturze RNA za pomocą niedrogich chemikaliów, ze względu na wyższą aktywność w małych rozmiarach rodników hydroksylowych, które są doskonałymi sondami do rozróżniania nukleotydów dostępnych dla rozpuszczalnika i zakopanych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej RNA.

Na przykład, w jaki sposób rybosomy wykorzystują jony metali, aby osiągnąć swoje aktywne potwierdzenie? Ślad rodnikowy hydroksy może być wykorzystany do zrozumienia podstaw specyficzności i rozpoznawania RNA. Oprócz ujawnienia informacji o trzeciorzędowej strukturze RNA, metoda ta może być wykorzystana do określenia precyzyjnych miejsc wiązania białek w RNA lub w cząsteczkach DNA.

Głównymi wyzwaniami tej metody jest zapobieganie degradacji próbki przez rybonukleazę oraz optymalizacja stężenia żelaza w celu uzyskania odpowiedniej ilości rozszczepienia RNA. Również szczegółowa analiza interwałów pasm może być dość trudna. Główną zaletą tego filmu jest pomoc widzom w zrozumieniu etapów planowania i pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu z śladem rodnika hydroksylowego Przed rozpoczęciem tego protokołu przygotuj wszystkie ślady w odczynnikach zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Towarzysząc temu filmowi, RNA może być wytwarzane DFO cztery powiązane i oznaczone zgodnie z opisem. Oczyść znakowany radioaktywnie RNA za pomocą elektroferezy żelowej denaturującej. Odzyskaj oczyszczony RNA przez dwie kolejne ekstrakcje żelem przy użyciu 0,3-molowego octanu sodu.

Następnie wytrącić RNA, mieszając 0,5 mililitra roztworu wodnego z jednym mililitrem etanolu. Inkubować mieszaninę przez jedną minutę na suchym lodzie Po odwirowaniu próbki odrzucić supinat. Umyj osad RNA 70% etanolem.

Usunąć supinat po dodatkowym odwirowaniu i wysuszyć osad w próżni. Następnie rozpuść oczyszczone próbki RNA znakowane P 32. W 330 mikrolitrach jednorazowego buforu reakcyjnego odpipetować 30 mikrolitrów roztworu RNA do nowej probówki reakcyjnej.

Wytrącić RNA etanolem, a następnie wysuszyć osad w próżni po wysuszeniu, ten osad można wykorzystać do wytworzenia drabiny referencyjnej zgodnie z opisem w pisemnej procedurze do naturalnego pozostałego buforowanego roztworu RNA przez ogrzewanie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Doprowadzić próbki do temperatury pokojowej na 15 minut, a następnie szybko odkręć, aby doprowadzić kondensat z powrotem do roztworu. Aby rozpocząć eksperyment z odciskiem stopy, ustaw 27 probówek reakcyjnych, aby uzyskać wystarczającą ilość próbek, aby wypełnić 30-dołkowy żel do elektroforezy.

Po włączeniu drabinek i rozszczepionej kontroli należy oznaczyć końcowe stężenia magnezu i żelaza tak, aby były równomiernie rozłożone na skali logarytmicznej w ciągu kilku rzędów wielkości wokół miareczkowania, przygotowanie jonów magnezu w jednorazowym buforze reakcyjnym opisano w tekście oddzielnie. Inkubować RNA i roztwory jonów magnezu w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów roztworu RNA z 90 mikrolitrami odpowiedniej ilości roztworu magnezowo-żelazowego.

Aby osiągnąć końcową objętość 100 mikrolitrów, inkubuj każdą mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie pozwól roztworom zrównoważyć się w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę, podczas gdy następuje fałdowanie RNA. W międzyczasie, bezpośrednio przed zainicjowaniem śladu rodnika hydroksylowego w reakcji, należy przygotować fantomową mieszaninę reakcyjną zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Przygotować reakcję peroksydacji, pipetując po dwie mikrolitrowe kropelki żelaza, EDTA, askorbinianu sodu i nadtlenku wodoru u u góry wewnątrz probówki reakcyjnej zawierającej roztwór RNA, tak aby kropelki się nie stykały. Rozpocznij reakcję odciskania stopy od energicznego wymieszania. Po 15 sekundach zatrzymaj reakcję, dodając 300 mikrolitrów czystego zimnego etanolu.

Obróć rurki trzy do pięciu razy. Na koniec wytrącić, umyć i wysuszyć osad, jak wykonano wcześniej jako alternatywę dla reakcji utleniania, utleniającą reakcję hydroksylową przeprowadza się przez dodanie do próbek pięciu mikrolitrów świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej Fentona. Inkubować reakcję utleniania przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów czystego zimnego etanolu, aby wygasić reakcję i wymieszaj, obracając rurki. Po raz kolejny wytrącić się. Umyj i wysusz osad po zakończeniu reakcji utleniania lub utleniania.

Rozpuść wysuszone granulki RNA w ośmiu mikrolitrach barwnika ładującego żel dwa. Upewnij się, że RNA znakowane P 32 jest ponownie zawieszone za pomocą licznika Geer, przygotuj denaturujący 8% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu zgodnie ze standardowymi protokołami. Za pomocą grzebienia z 30 dołkami załaduj próbki, w tym dwa odniesienia i rozszczepioną kontrolę.

Oddziel fragmenty RNA o mocy od 60 do 75 watów przez dwie i pół godziny. Wysuszony żel należy wystawić na noc na ekran fosfonowy do przechowywania. Zeskanuj ekran phospho za pomocą systemu obrazowania do automatycznej radiografii bezfilmowej.

Następnie prześlij plik obrazu żelu do komputera w celu analizy. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz oprogramowanie Safa i open source do dopasowania i kwantyfikacji pojedynczego pasma. Załaduj sekwencję RNA jako plik TXT z kropką, a następnie obraz żelu jako plik z kropką żelu.

Zdefiniuj pasy ruchu i dostosuj intensywność pasma. Następnie wybierz pas kotwiczny i wykonaj przypisanie pasm do wyrównywania żelu do nukleotydów występuje w odniesieniu do RNA T jedna drabina trawienna. Określ ilościowo intensywność pasma i użyj funkcji kolorowego wykresu z ukośnikiem normalizacyjnym, aby znormalizować i przypisać potencjalnie niezmienne pozostałości.

Zapisz dane wyjściowe jako plik txt. SFA wyprowadza arkusz kalkulacyjny zawierający kolumny reprezentujące pasy na żelu i wiersze reprezentujące poszczególne całki pasmowe odpowiadające fragmentowi RNA. Po pierwsze, miejsca ochrony, w których zaobserwowano zauważalną zmianę w dostępności rozpuszczalnika, należy zidentyfikować poprzez porównanie profilu ochrony uzyskanego z próbki jonów magnezu bez jonów magnezu z profilem końcowego stężenia jonów magnezu.

Im niższa wartość, tym lepiej nukleotyd jest chroniony przed atakiem rodników hydroksylowych i odwrotnie. Następnie utwórz krzywe przejścia pasma, intensywności poszczególnych lub grup nukleotydów w funkcji stężenia żelaza magnezowego za pomocą formatu arkusza kalkulacyjnego, indywidualnie skaluj te przejścia do funkcji nasycenia ułamkowego, jak opisano w części tekstowej tego protokołu. Na koniec dopasuj dane do równania wzgórza.

Analiza ta skaluje przejście do nasycenia ułamkowego, określa punkt środkowy przejścia i zapewnia fenomenologiczny test tego, czy przejście jest pokazane sigmoidalne. Oto reprezentatywne wyniki eksperymentów z śladem rodnika hydroksylowego P, cztery, P, sześć RRNA. Izotermy wyprowadzono z sekwencjonowania żeli analizowanych przez Safa, a następnie dopasowano zgodnie z opisem w sekcji analizy.

Obraz żelu wskazuje, że rozszczepienie tła jest minimalne i że przypisanie pojedynczego nukleotydu jest możliwe dzięki dobrze zdefiniowanym pasmom w pasie T one. Fragmentacja RNA wywołana rodnikiem hydroksylowym znajduje się znacznie powyżej tła. Przejście od niskich do wysokich jonów magnezu jest selektywnie związane ze zmniejszającą się intensywnością pojedynczych i grup prążków, co wskazuje na powstawanie RNA.

Ochrona struktury trzeciorzędowej odnosi się do pojedynczego lub grup sąsiadujących ze sobą nukleotydów, których rozszczepienie zmienia się wraz z intensywnościami pasma, jest określane ilościowo i normalizowane za pomocą analizy szafranowej. Wynikiem jest wykres termiczny wizualizujący stopień ochrony przed rodnikami hydroksylowymi. Przejście kolorów opisuje zmianę dostępności po dodaniu żelaza magnezowego, biały do czerwonego pokazuje bardziej dostępne nukleotydy, podczas gdy biały do niebieskiego pokazuje bardziej chronione nukleotydy.

Każdy stopień zacienienia jest powiązany z wartością liczbową, którą można wykreślić jako krzywą ochrony i przeanalizować za pomocą modelu wiążącego, takiego jak równanie wzgórza. W tym przykładzie stała dysocjacji równowagi powiązanego z ochroną 1 5 3 do 1 5 5 jest w przybliżeniu dwukrotnie większa od odpowiadającej jej wartości ochrony od 1 6 3 do 1 6 4. Ten eksperyment z hydroksylowym śladem rodnikowym można przeprowadzić w półtora dnia, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o założeniu rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, aby uniknąć zanieczyszczenia RNA. Również końcowe stężenie żelaza zależy od systemu doświadczalnego. Dlatego zalecamy przeprowadzenie eksperymentu z reakcją na dawkę przed wykonaniem odcisku stopy zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak rozdzielczy w czasie ślad hydroksylowo-rodnikowy, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, w jakim krytycznym punkcie czasowym cząsteczki RNA osiągają nieprawidłowo sfałdowane lub aktywne potwierdzenie po jego rozwoju? Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do badania interakcji, jak i tymczasowych molekularnych oddziaływań trzeciorzędowych kwasów nukleinowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić tworzenie się trzeciorzędowej struktury cząsteczek RNA. Nie zapominaj, że caate i fosfor w drugim etapie to niebezpieczne środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i okularów ochronnych, a także stosowanie osłon z pleksiglasu podczas wykonywania tej procedury.