Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce

FPOP w komórce w połączeniu ze spektrometrią mas to nowa, potężna technika stosowana do badania interakcji białek i zmian strukturalnych białek w żywych komórkach. Dzięki FPOP w komórce nie trzeba izolować interesujących Cię białek, ale można je raczej badać w ich naturalnym środowisku. Jest to szczególnie pomocne w przypadku białek błonowych.

Dzięki tej metodzie możesz badać zmiany w strukturze i interakcjach białek białkowych w różnych chorobach, w tym raku i zaburzeniach genetycznych, dzięki czemu możesz je lepiej zrozumieć i scharakteryzować. Aby rozpocząć montaż systemu przepływowego, użyj kamienia łupliwego, aby przyciąć rurki z topionej krzemionki do odpowiednich rozmiarów. Następnie umieść sześć małych cylindrycznych magnesów w jednej strzykawce o pojemności 500 mikrolitrów i napełnij strzykawkę, drugą strzykawkę o pojemności 500 mikrolitrów i dwie strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów buforem osłonowym.

Po usunięciu powietrza umieścić strzykawki na pompie strzykawkowej i dokręcić korek pompy strzykawki tak, aby w strzykawce z komórkami pozostało około 50 mikrolitrów, gdy silnik zatrzyma się. Za pomocą adaptera przynęty podłącz ręczny zawór do każdej strzykawki i zmontuj rurkę krzemionkową, jak pokazano na ilustracji, upewniając się, że przewleczono linię ogniwa i nadtlenku krzemionki wodoru przez krzyż i włożyłeś ją bezpośrednio do linii krzemionki 450 ID. Po podłączeniu wszystkich przewodów umieść system przepływu obok lasera i użyj zapalniczki, aby wypalić powłokę krzemionkową na rurce o średnicy wewnętrznej 450 mikrometrów, aby stworzyć okno do naświetlania laserowego.

Umieść mieszadło magnetyczne nad strzykawką zawierającą sześć magnesów i ustaw pompę strzykawkową na 492.4 mikrolitrów na minutę, aby uzyskać końcowe natężenie przepływu 1083.3 mikrolitrów na minutę. Przepuść bufor przez system trzy razy, aby przepłukać system, sprawdzając każde połączenie pod kątem wycieków. Użyj wypukłej soczewki, aby ustawić ostrość lasera excimerowego na rurkach krzemionkowych.

Aby przetestować okno napromieniania, umieść mały kawałek papieru za rurką krzemionkową i włącz laser. Następnie zmierz obszar spalony w wyniku napromieniowania i użyj okna napromieniowania i natężenia przepływu, aby obliczyć wymaganą częstotliwość lasera, aby uzyskać ułamek wykluczający równy zero. Aby zebrać komórki do zabiegu, należy przepłukać komórki z 70 do 90% zlewającej się kultury kolby T175 odpowiednim roztworem soli do hodowli komórkowych.

Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach buforu w celu zliczenia i zebrać komórki przez odwirowanie. Bardzo ważne jest policzenie komórek, aby upewnić się, że są one wystarczające do dalszej analizy, ale nie za dużo, aby spowodować ich agregację i zatkanie systemu przepływu. Następnie ponownie zawiesić komórki w stężeniu buforu dwa razy od 10 do szóstego na mililitr i podzielić komórki na jedną objętość 500 mikrolitrów na próbkę.

W przypadku FPOP w komórce napełnij dwie pięciomililitrowe strzykawki świeżym buforem osłonki, strzykawkę o pojemności 500 mikrolitrów zawierającą magnesy jedną podwielokrotnością komórek, a końcową strzykawkę o pojemności 500 mikrolitrów świeżo przygotowanym 200-milimolowym nadtlenkiem wodoru. Włącz mieszadło magnetyczne i wstrzyknij 220 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do jednej porcji Quench. Po delikatnym wymieszaniu umieść Quench za systemem przepływowym, aby zebrać napromieniowane próbki i włączyć laser.

Po siedmiu sekundach włącz system przepływu. Gdy próbka zakończy przepływ, wyłącz laser i delikatnie wymieszaj Quench z pobraną próbką. Następnie napełnić wszystkie cztery strzykawki świeżym buforem i przepłukać bufor przez system przepływowy.

Po zakończeniu płukania systemu powtórz procedurę z nową porcją komórek i roztworów bez napromieniania, ponieważ kontrola bez lasera w celu uwzględnienia utleniania tła w komórkach. Podczas pracy następnej próbki odwiruj pierwszą próbkę i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach odpowiedniego buforu do lizy komórek. Następnie przenieś próbkę do probówki mikrowirówkowej w celu błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie.

Gdy wszystkie próbki zakończą pracę, zdemontuj system przepływu i wyrzuć zużyte rurki krzemionkowe. Następnie wyczyść wszystkie inne połączenia za pomocą sonikacji przez godzinę w 50% wodnym i 50% roztworze metanolu. Po wyizolowaniu i strawieniu białek z lizatu komórkowego zgodnie ze standardowymi protokołami, przeanalizuj strawiony lizat komórkowy zgodnie ze standardowymi tandemowymi protokołami LCMS, aby zlokalizować modyfikację FPOP w całym protium.

Następnie załaduj dane do odpowiedniego oprogramowania do analizy białek i przeanalizuj je z odpowiednią bazą danych białek i odpowiednim enzymem trawiennym. Po zakończeniu wyszukiwania plików oblicz stopień utlenienia FPOP na interesującym nas białku. Obrazowanie fluorescencyjne ortogonalnych obrazów ułożonych w stos YZ pokazuje wyraźne oddzielenie bufora osłonki od roztworu komórkowego, gdy przepływa on przez okno naświetlania laserowego.

Można wygenerować trójwymiarowe średnie mapy cieplne bufora osłony lub roztworu ogniwa, aby zilustrować minimalne wymieszanie tych dwóch roztworów. Zastosowanie systemu przepływu pojedynczych komórek zwiększa liczbę białek modyfikowanych oksydacyjnie 13-krotnie. Aby potwierdzić modyfikację interesujących białek w nienaruszonych komórkach, obrazowanie fluorescencyjne można przeprowadzić po leczeniu nadtlenkiem wodoru i napromieniowaniu.

Korzystając z tandemowej spektrometrii mas, modyfikacje te można dalej lokalizować w określonych aminokwasach na białku. Przesunięcie zaobserwowane w tym ekstrahowanym chromatogramie jonowym przekłada się na zmianę hydrofobowości spowodowaną przez utlenioną metioninę w zmodyfikowanym peptydzie. Porównanie aktyny znakowanej w komórce przez ślad in vitro ujawnia podobny poziom utlenienia, co wskazuje, że aktyna ma podobną dostępność rozpuszczalnika zarówno w badaniach w komórkach, jak i in vitro.

Co więcej, porównanie zakresu szybkiego utleniania fotochemicznego białka będącego przedmiotem zainteresowania modyfikacji z dostępnością rozpuszczalnika, znakowane reszty obliczone z dwóch struktur krystalicznych aktyny wykazują, że szybkie fotochemiczne utlenianie białka będącego przedmiotem zainteresowania w komórce skutecznie bada dostępność rozpuszczalnika białka monomerycznego. Istnieje kilka dodatkowych kroków, które można podjąć, aby zwiększyć wykrywalność mniej obfitych modyfikacji FPOP, w tym chromatografia 2D, frakcjonowanie subkomórkowe i techniki multipleksowania proteomicznego. Dzięki zastosowaniu FPOP w komórce możemy teraz przeprowadzić biologię proteomyostrukturalną, aby lepiej połączyć struktury białkowe z funkcją komórkową.

Ze względu na długość fali 248 nanometrów wymaganą dla FPOP, należy zawsze nosić okulary ochronne przed promieniowaniem UV i odpowiednią odzież, aby uniknąć niezamierzonego narażenia na promieniowanie odbite lub rozproszone.