Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (Staphylococcus aureus MRSA) u szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie eksperymentalnego modelu infekcyjnego zapalenia wsierdzia u szczurów. Osiąga się to poprzez uprzednie wyhodowanie szczepu aureus oraz przygotowanie cewników chirurgicznych do infekcji. Następnie przygotowywany jest obszar zabiegowy, a zwierzę zostaje poddane znieczuleniu.

Po znieczuleniu zwierzęcia, przez prawą tętnicę szyjną w kierunku serca wprowadza się cewnik. Ostatnim krokiem jest zakażenie zwierząt szczepem aureus poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Na koniec wycina się tkanki docelowe i przygotowuje je do hodowli ilościowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak szybki model zapalenia wsierdzia, jest możliwość zastosowania modelu czerwonego zapalenia wsierdzia z systemem obrazowania in vivo Ivus. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy chorób jamy ustnej, takie jak wirulencja oraz skuteczność środków przeciwdrobnoustrojowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mogą napotkać trudności, ponieważ procedura chirurgiczna jest wymagająca.

Najpierw zaszczep pętlą pełną kultury M SSA z mrożonego stoku na podłoże z krwią owczą w kasecie. Po upewnieniu się, że nie wystąpiła kontaminacja, inkubuj kulturę na płytce z agarem sojowym przez noc w temperaturze 37 °C. Wybierz jedną kolonię z płytki i użyj jej do zaszczepienia 5 mL bulionu sojowo-kazeinowego w 15 mL probówce z zakrętką typu snap cap.

Inkubować szczepionkę przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze wytrząsowym. Ustawić prędkość na 200 RPM. W pierwszej kolejności przygotować cewniki. Przeciąć rurki polietylenowe na odcinki o długości 10 cm i sterylizować cewniki w roztworze dezynfekcyjnym cex przez 30 minut.

Następnie stopić jeden koniec wysterylizowanej rurki, dociskając jej końcówkę rozgrzaną sterylną pęsetą, aby stworzyć cewnik, który zostanie wprowadzony z prawej tętnicy szyjnej do lewej komory i spowoduje uszkodzenie wsierdzia podczas bicia serca. Następnie znieczulić szczura, umieszczając go w komorze zawierającej mieszaninę izofluranu i tlenu w stosunku jeden do jednego, aż środek znieczulający zacznie działać. Potwierdzić znieczulenie, sprawdzając, czy mięśnie są rozluźnione, a odruchy stopy nie występują.

Stan znieczulenia podczas operacji należy utrzymać za pomocą maski nosowej podłączonej do mieszaniny gazów. Pole operacyjne należy oczyścić Betadyną oraz 70% etanolem, stosując przez cały czas trwania zabiegu technikę sterylną. Szczura należy ułożyć w pozycji grzbietowej, a następnie, stosując rozwarstwianie tępym narzędziem, wykonać pionowe nacięcie skóry szyi powyżej mostka.

Oddziel powięź, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną. Prawa tętnica szyjna znajduje się nieco na prawo od linii środkowej powyżej obojczyków. Ostrożnie wyciągnij tętnicę z jamą szyjną i umieść dwa 10 centymetrowe odcinki szwu jedwabnego pod tętnicą, aby podwiązać ją na odsłoniętym końcu głowowym.

Następnie załóż zacisk na tętnicę, aby zapobiec krwawieniu. Za pomocą pęsety i wprowadzeniaka do cewnika wykonaj mały otwór w górnej części tętnicy. Wprowadź nieuszczelniony koniec cewnika przez otwór w tętnicy.

Zdejmij klips i przesuń cewnik w dół w kierunku serca. Jeśli cewnik został wprowadzony prawidłowo, powinien on wsunąć się na cztery do pięciu centymetrów do tętnicy i pulsować zgodnie z rytmem bicia serca szczura, aż do momentu napotkania oporu. Po umieszczeniu cewnika zawiąż luźny szew wokół końcowego odcinka tętnicy, aby unieruchomić cewnik w miejscu.

Za pomocą jedwabnej nici chirurgicznej odciąć nadmiar szwu oraz końce cewnika, a następnie podwinąć końce pod skórę szyi. Zamknąć skórę za pomocą klipsów skórnych. Umieścić szczura w czystej klatce i trzymać w ciepłym miejscu do czasu wybudzenia z narkozy.

Zapewnij pokarm i wodę oraz często sprawdzaj stan szczura, zarówno w trakcie, jak i po rekonwalescencji. Infekcję można przeprowadzić od jednego do siedmiu dni po operacji, jednak czas ten powinien być spójny w obrębie poszczególnych eksperymentów. Oczyść ogon szczura 70% ethanol i wstrzyknij 0,5 milliliters kultury MRSA w wyznaczonym miejscu.

Wstrzyknąć do żyły ogonowej. Używając igły 27G o długości pół cala, uciskać miejsce iniekcji do czasu ustąpienia krwawienia, a następnie umieścić szczura z powrotem w klatce. Po uśmierceniu zwierzęcia przemyć klatkę piersiową 70%etanolem, a następnie wykonać nacięcie w kształcie litery V na klatce piersiowej poniżej mostka.

Przeciąć chrząstki żeber po obu stronach mostka. Aby odsłonić serce, należy delikatnie pociągnąć je do góry, przeciąć tkanki w pobliżu aorty i przeprowadzić preparację ku górze, aby uwolnić serce. Umieścić serce na sterylnym szalce Petriego wyłożonej gazą o wymiarach four by four inch, a następnie wykonać nacięcie przez wewnętrzną ścianę lewej komory i otworzyć lewą jamę serca.

Sprawdź w celu potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia cewnika, a następnie go usuń. Obejrzyj i usuń za pomocą nożyczek i pęsety wegetacje z zastawki. Usuń również nerki i śledzionę, a po zważeniu i homogenizacji tkanek oraz wegetacji przygotuj rozcieńczenia szeregowe w PBS do hodowli ilościowej.

Przedstawiono tutaj prawidłowo umieszczony cewnik, na który wskazuje strzałka po lewej stronie. Przebiega on przez zastawkę aortalną do lewej komory serca; liczne wegetacje są widoczne wokół zastawek aortalnych, co wskazują środkowa i prawa strzałka. Niniejsza tabela przedstawia przykład zjadliwości szczepu ssus w szczurzym modelu zapalenia wsierdzia.

Wszystkie zwierzęta zaszczepione dawką od 10⁵ do 10⁶ CFU rozwinęły zapalenie wsierdzia z wysoką gęstością ssus w wegetacjach serca, a także w nerkach i śledzionie. Po opanowaniu tej procedury chirurgicznej może ona zostać przeprowadzona w ciągu 10 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby podczas operacji utrzymywać zwierzę w stanie ocenionym, a następnie monitorować je po zakończeniu zabiegu. Można zastosować metody takie jak IVUS, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład w zakresie monitorowania w czasie rzeczywistym skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych oraz ekspresji genów in vivo po ich rozwinięciu. Technika ta może stanowić narzędzie dla badaczy z dziedziny zakażeń i infekcji do badania czynników wirulencji patogennej w zakażeniach wewnątrznaczyniowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak stworzyć eksperymentalny model zapalenia wsierdzia u szczurów. Należy pamiętać, że praca z MRA może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.