Name: Wideookulografia u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj wideookulografię u myszy do badania ruchów gałek ocznych i uczenia się motorycznego. Ta metoda pozwala analizować fizjologię zachowań motorycznych oraz choroby układu okulomotorycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy za wsparcie finansowe następującym organizacjom: Netherlands Organisation for Health Research and Development (M.D.J, C.D.Z), The Netherlands Organisation for Scientific Research (C.D.Z), NeuroBasic (C.D.Z), Prinses Beatrix Fonds (C.D.Z), The SENSOPAC (C.D.Z), C7 (C.D.Z) oraz programowi CEREBNET (C.D.Z) Wspólnoty Europejskiej.

1. Przygotowanie
Poniższe eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Holenderskiego Komitetu Etycznego ds. Doświadczeń na Zwierzętach.
<ol>
	<li>Przygotowanie myszy do wideookulografii. Aby zmierzyć ruchy gałek ocznych myszy, konieczna jest immobilizacja głowy zwierzęcia. W związku z tym na czaszce myszy wykonuje się konstrukcję podstawki (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Przeprowadź anestezję myszy w komorze gazowej, stosując mieszaninę izofluranu (isofluran 1-1,5%; Rhodia Organique Fine LtD, Francja) i tlenu. Nadmiar gazu jest odprowadzany. Utrzymuj znieczulenie za pomocą maski nosowej. Głębokość anestezji potwierdź poprzez ucisk palca u stopy.</li>
		<li>Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przy użyciu analnego termosensora i maty grzewczej (FHC, Bowdoinham, ME).</li>
		<li>Zabezpiecz oczy, nakładając maść do oczu (duratears, Alcon, Belgia). Ogol futro na grzbietowej części czaszki i oczyść pole operacyjne, wykonując cykle mycia roztworem betadyny lub chlorheksydyny.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić grzbietową powierzchnię czaszki. Oczyść i osusz powierzchnię.</li>
		<li>Nałóż kroplę kwasu fosforowego (żel trawiący z kwasem fosforowym 37,5%; Kerr, CA) na grzbietową powierzchnię czaszki, od punktu bregma do lambda. Usuń trawienie po 15 sekundach, a następnie oczyść powierzchnię czaszki solą fizjologiczną i ponownie osusz.</li>
		<li>Na tak przygotowaną powierzchnię czaszki nałóż kroplę OptiBond prime (Kerr, CA) i susz powietrzem przez 30 sekund.</li>
		<li>Na OptiBond prime nałóż kroplę adhezyjną OptiBond (Kerr, CA) i utwardz światłem przez 1 minutę (urządzenie do utwardzania światłem widzialnym Maxima 480; Henry Schein, USA).</li>
		<li>Warstwę adhezyjną pokryj cienką warstwą kompozytu Charisma (Heraeus Kulzer, Niemcy). W kompozycie osadź dwie połączone nakrętki (średnica: 3 mm). Następnie utwardź kompozyt światłem. W razie potrzeby nałóż dodatkowe warstwy kompozytu i utwardź je światłem.</li>
		<li>Podaj buprenorfinę (0,015 mg/kg, s.c.) w celu zapewnienia analgesji pooperacyjnej. Zwierzę powinno odzyskać sprawność w ciągu około 5 min. Pozostaw mysz do rekonwalescencji w klatce domowej w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 dni po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Układ do wideookulografii myszy (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Umieść mysz w stabilizatorze i przymocuj jej głowę do stabilizatora za pomocą dwóch śrub (Rysunek 1). Podczas tej procedury mysz nie wymaga znieczulenia. Czas stabilizacji nie powinien przekraczać 1 h/dobę.</li>
		<li>Zamontuj stabilizator głowy i ciała myszy na platformie X-Y, która z kolei jest zamocowana na stole obrotowym (średnica: 60 cm). Dzięki platformie X-Y głowę myszy można ustawić nad środkiem stołu obrotowego. Myszy można przemieszczać w osiach pochylenia, odchylenia i przechylenia. Głowę myszy ustawia się pod odpowiednim kątem pochylenia, odchylenia i przechylenia, centrując oko na podstawie obrazu wideo generowanego przez system ISCAN. Alternatywnie konstrukcję podstawki można umieścić na głowie myszy w ramie stereotaktycznej11.</li>
		<li>Stół obrotowy jest połączony z serwomotorem prądu przemiennego (Harmonic drive AG, Holandia), a jego pozycja jest monitorowana przez potencjometr (Bourns inc., CA) zamocowany do osi stołu.</li>
		<li>Cylindryczny ekran otaczający (średnica: 63 cm; wysokość: 35 cm) z losowym wzorem kropek (każdy element 2°) pokrywa stół obrotowy; bęben ten jest również wyposażony w serwomotor prądu przemiennego (Harmonic drive AG, Holandia). Pozycja ekranu cylindrycznego jest monitorowana przez potencjometr (Bourns inc., CA) zamocowany do jego osi, a ekran może być oświetlany lampą halogenową (20 W). Zarówno ekran otaczający, jak i stół obrotowy są napędzane niezależnie.</li>
		<li>Ruch stołu obrotowego i ekranu otaczającego jest kontrolowany przez komputer podłączony do interfejsu wejścia/wyjścia (CED limited, Cambridge, Wielka Brytania). Sygnały pozycji stołu i ekranu otaczającego są filtrowane (częstotliwość odcięcia: 20 Hz), digitalizowane przez interfejs wejścia/wyjścia i zapisywane w komputerze.</li>
		<li>Oko myszy jest oświetlane przez trzy emitery podczerwieni (600 mW, kąt rozproszenia: 7°, peak długości fali: 880 nm, RS components, Holandia). Dwa emitery podczerwieni są zamocowane do stołu obrotowego, a trzeci do kamery. Ten trzeci emitter wytwarza referencyjne odbicie rogówkowe (CR), które jest wykorzystywane podczas procedury kalibracji oraz podczas rejestracji ruchów oka.</li>
		<li>Kamera CCD z podczerwienią, wyposażona w obiektyw zoom (Zoom 6000, Navitar inc., NY), jest zamocowana do stołu obrotowego i skupiona na głowie myszy w centrum stołu. Kamerę można odblokować i odchylić wokół osi stołu obrotowego o dokładnie 20° podczas procedury kalibracji.</li>
		<li>Sygnał wideo jest przetwarzany przez system śledzenia oczu (ETL-200, ISCAN, Burlington, MA). System ISCAN wykorzystuje algorytm do śledzenia środków źrenicy i referencyjnego CR. System może śledzić źrenicę i referencyjne CR w kierunku poziomym i pionowym z częstotliwością próbkowania 120 Hz.</li>
		<li>Sygnały pozycji referencyjnego CR, pozycji źrenicy oraz wielkości źrenicy są digitalizowane przez interfejs wejścia/wyjścia i zapisywane w tym samym pliku co sygnały pozycji stołu i ekranu otaczającego. Wideo-system śledzenia źrenicy wprowadza opóźnienie sygnałów ruchu oka wynoszące około 27 ms.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kalibracja i pomiar ruchów gałek ocznych przy użyciu wideopupillometrii
System śledzenia wzroku rejestruje ruch źrenicy jako ruch translacyjny. Ruch translacyjny śledzonej źrenicy zawiera komponent translacyjny wynikający z różnicy osiowej między centrum rotacji oka a centrum anatomicznym oka (tj. centrum krzywizny rogówki) oraz komponent rotacyjny wynikający z obrotu kątowego gałki ocznej. Poprzez odjęcie referencyjnego CR od ruchu/pozycji źrenicy, z sygnału usuwany jest niepożądany komponent translacyjny, w wyniku czego otrzymujemy ruch translacyjny wynikający wyłącznie z rotacji gałki ocznej. Choć są one często bardzo małe, odejmowanie to eliminuje również przesunięcia między głową a kamerą. Pozostały izolowany ruch translacyjny jest przeliczany na obrót kątowy gałki ocznej za pomocą następującej metody kalibracji8,12. Kalibrację tę przeprowadzono przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu z ruchami oczu.
<ol>
	<li>Dostosuj położenie głowy myszy względem kamery w taki sposób, aby obraz wideo źrenicy znajdował się na środku monitora, a reprezentacja referencyjnego odblasku rogówki (CR) znajdowała się na pionowej osi środkowej oka, najlepiej bezpośrednio nad źrenicą. Zminimalizuj ruchy referencyjnego CR wynikające z kątowych obrotów kamery, co można osiągnąć poprzez umieszczenie centrum krzywizny rogówki na osi kamery/stołu.</li>
	<li>Obracaj kamerę kilkakrotnie o +/- 10° (tj. 20 stopni szczyt-szczyt) wokół osi pionowej obrotowego stołu. Wykorzystaj pozycje śledzonej źrenicy (P) oraz referencyjnego CR zarejestrowane w skrajnych pozycjach obrotu kamery, aby obliczyć promień rotacji źrenicy (Rp; Rp = Δ/sin(20°); gdzie Δ=(CR-P), patrz Rysunek 3A).</li>
	<li>Z uwagi na fakt, że wartość Rp zależy od wielkości źrenicy, konieczne jest wprowadzenie korekty wielkości źrenicy12 (Rysunek 3B). Powtórz krok 2.2 wielokrotnie w różnych warunkach oświetlenia (tj. manipulując wielkością źrenicy; Rysunek 3C), aby określić zależność między wielkością źrenicy a Rp i sporządzić krzywą korekcji Rp (Rysunek 3D). Wartość Rp zależy również od pionowej pozycji oka. W przypadku, gdy eksperyment spowoduje pionowe ruchy oka, wysoce zalecana jest korekta kalibracji dla pionowych pozycji oka13.</li>
	<li>Wyznacz pozycję kątową oka (E), mierząc pozycję referencyjnego CR, pozycję P oraz wielkość źrenicy. Pozycję referencyjnego CR odejmuje się od pozycji źrenicy, generując pozycję źrenicy wolną od translacji. Na podstawie pomiaru wielkości źrenicy można odczytać wartość Rp z krzywej korekcji Rp, a następnie obliczyć E, korzystając z następnego wzoru: E= arcsin {(Δ1)/Rp} (Rysunek 4A; gdzie Δ1=(P2-P1), a P1 i P2 są korygowane poprzez odjęcie referencyjnego CR).</li>
	<li>Można teraz zastosować szeroki zakres obrotów stołu obrotowego i/lub otaczającego ekranu w celu stymulacji systemu okulomotorycznego. Aby przeprowadzić wideookulografię w ciemności, oko myszy musi zostać poddane wstępnej obróbce lekiem miotycznym, aby ograniczyć rozszerzenie źrenicy i umożliwić jej śledzenie w tych warunkach. W naszych eksperymentach stosujemy pilokarpinę (4%, Laboratories Chauvin, Francja), aby ograniczyć rozszerzenie źrenicy w ciemności.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Pozycje oczu, pozycje stołu oraz pozycje ekranu otaczającego są przeliczane na pozycje kątowe (patrz Rysunek 4B oraz wzór w sekcji 2.4). Sygnały z oczu są korygowane o opóźnienie wynoszące 27 ms, wywołane przetwarzaniem obrazu w systemie śledzenia źrenic.</li>
	<li>Pozycje kątowe oka, stołu i ekranu otaczającego są różniczkowane i filtrowane za pomocą filtru dolnoprzepustowego Butterwortha z częstotliwością odcięcia 20 Hz.</li>
	<li>Sakkady są usuwane z sygnału prędkości oka przy zastosowaniu progu detekcji wynoszącego 40°/s. Dane są usuwane w przedziale od 20 ms przed do 80 ms po przekroczeniu progu detekcji.</li>
	<li>Sygnały prędkości stołu, ekranu otaczającego i oka są uśredniane dla każdego pojedynczego cyklu w próbie (Rysunek 4C).</li>
	<li>Uśrednione sygnały są dopasowywane do odpowiedniej funkcji. Zazwyczaj stosuje się sinusoidalną stymulację prędkości, a uśrednione cykle są dopasowywane do funkcji sinus lub cosinus (Rysunek 4C). Następnie wzmocnienie (gain) można obliczyć jako stosunek prędkości oka do prędkości bodźca, natomiast fazę jako różnicę (w stopniach) między prędkością oka a prędkością bodźca.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wideookulografii można używać do badania różnych form funkcji okulomotorycznych (np. odruchu optokinetycznego: OKR; odruchu przedsionkowo-ocznego: VOR; wizualnie wzmocnionego odruchu przedsionkowo-ocznego: VVOR), a także uczenia się motorycznego (adaptacja VOR; adaptacja OKR). OKR kompensuje zakłócenia o niskiej częstotliwości, wykorzystując sprzężenie zwrotne z obrazu. OKR można wywołać poprzez obracanie dobrze oświetlonego ekranu otaczającego (Movie 1). Obracanie ekranu otaczającego w zakresie częstotliwości 0,2 -1,0 Hz z amplitudą 1,6° pokazuje, że system optokinetyczny jest bardziej efektywnym mechanizmem kompensacyjnym w zakresie niskich częstotliwości niż w zakresie wysokich częstotliwości (Figure 5A). VOR kompensuje szybkie ruchy głowy o wysokiej częstotliwości, wykorzystując sygnały z organów przedsionkowych. VOR można wywołać poprzez obracanie zwierzęcia (np. na stole obrotowym) w ciemności (Movie 2). Obracanie stołu obrotowego w zakresie częstotliwości 0,2 -1,0 Hz z amplitudą 1,6° demonstruje, że system przedsionkowo-oczny jest bardziej efektywny w generowaniu kompensacyjnych ruchów gałek ocznych w zakresie wysokich częstotliwości niż w zakresie niskich częstotliwości (Figure 5A). Gdy system optokinetyczny i przedsionkowo-oczny działają wspólnie, obrazy mogą być stabilizowane na siatkówce w szerokim zakresie ruchów głowy. Obracanie stołu obrotowego w zakresie częstotliwości 0,2 -1,0 Hz z amplitudą 1,6°, przy jednoczesnym dobrym oświetleniu ekranu otaczającego (Movie 3), pokazuje, jak oko generuje kompensacyjne ruchy o „wysokim wzmocnieniu” (high gain) w całym zakresie częstotliwości (Figure 5A). Wszystkie te wartości wzmocnienia i fazy są typowe dla myszy, choć zgłaszano różnice ze względu na płeć14 i szczep15,16,17.
Niezależna kontrola nad obrotowym stołem i otaczającym ekranem umożliwia nam doprowadzenie do rozbieżności między informacjami wizualnymi a przedsionkowymi u myszy. Po długotrwałej i jednostajnej ekspozycji na niespójne informacje wizualne i przedsionkowe, VOR myszy ulegnie zmianie w celu zrekompensowania zmodyfikowanych bodźców wzrokowych (adaptacja VOR; Film 4). Obracanie stołu w przeciwfazie (tj. 180°) względem otaczającego ekranu (1 Hz, 1,6°) zwiększa wzmocnienie VOR (Rysunek 5B). Maksymalna zmiana wzmocnienia VOR, przy zastosowaniu paradygmatu uczenia się w jednej próbie, jest często osiągana po 30 minutach.
<img alt="Mysz w eksperymencie neuronaukowym z urządzeniem zamocowanym na głowie, ilustrującym pomiar aktywności mózgu." src="/files/ftp_upload/3971/3971fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny rysunek unieruchamiacza głowy i ciała myszy. Ciało myszy jest unieruchomione za pomocą plastikowej rurki cylindrycznej o średnicy 35 mm. Głowa myszy jest immobilizowana poprzez połączenie cokołu myszy z żelaznym prętem za pomocą dwóch śrub. Żelazny pręt jest ustawiony pod kątem 30 stopni, aby zapewnić prawidłowe nachylenie głowy myszy podczas poruszania się. *, widok z góry na cokół zawierający dwie nakrętki.
<img alt="Schemat układu wideookulografii u myszy; przetwarzanie obrazu, śledzenie źrenicy, sterowanie serwomotorem." src="/files/ftp_upload/3971/3971fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczny rysunek układu wideookulografii u myszy.
<img alt="Schemat śledzenia źrenicy z równaniami, wykresem pozycji źrenicy oraz analizą danych dotyczącą zmian średnicy źrenicy." src="/files/ftp_upload/3971/3971fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Kalibracja systemu wideozapisu do śledzenia źrenicy. A) Kamera jest obracana kilkukrotnie o +/- 10° (tj. 20 stopni od szczytu do szczytu) wokół osi pionowej obrotowego stołu. Śledzona źrenica (P) oraz referencyjne odbicie rogówkowe (CR), zarejestrowane w skrajnych pozycjach obrotu kamery, służą do obliczenia promienia rotacji źrenicy (Rp). B) Promień średnicy źrenicy zależy od wielkości źrenicy. C) Przykład pokazujący wpływ wielkości źrenicy na jej pozycję podczas procedury kalibracji (obie wartości zmierzone w pikselach (px)). D) Zależność między Rp a średnicą źrenicy zmierzoną u jednej myszy. Trzynaście różnych średnic źrenicy uzyskano poprzez zmianę intensywności światła otoczenia.
<img alt="Koncepcja równowagi statycznej z formułą sinusa, schemat ruchu obrotowego oraz wykresy pozycja-prędkość." src="/files/ftp_upload/3971/3971fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pomiar i analiza ruchów gałek ocznych za pomocą wideo-trackingu źrenic. A) Kątowa pozycja źrenicy jest obliczana na podstawie promienia źrenicy (Rp) oraz pozycji źrenicy (P; skorygowanej o pozycję CR). B) Przykład kompensacyjnego ruchu oka wywołanego stymulacją systemu przedsionkowego i wzrokowego (wzmocniony wzrokowo VOR). Stół obrotowy był obracany sinusoidalnie z częstotliwością 0.6 Hz i amplitudą 1.6°, podczas gdy otaczający ekran był dobrze oświetlony. C) Analizy rejestracji przedstawionej w B). Wykres przedstawia uśredczoną krzywą prędkości stołu obrotowego (niebieska) i źrenicy (czerwona). Uśrednione krzywe te zostały dopasowane do funkcji sinusoidalnej (czarna).
<img alt="Wykresy wydajności układu okulomotorycznego, wzmocnienie i faza w funkcji częstotliwości i czasu, wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3971/3971fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wydajność i uczenie się układu okulomotorycznego zmierzone u jednej myszy C57Bl6. A) Ruchy gałek ocznych są generowane przez obroty otaczającego ekranu (odruch optokinetyczny: OKR, górne panele), przez obracanie myszy w ciemności (odruch przedsionkowo-oczny: VOR, środkowe panele) oraz przez obracanie myszy przy świetle (wizualnie wzmocniony odruch przedsionkowo-oczny: VVOR, dolny panel) z częstotliwościami od 0,2 do 1,0 Hz przy amplitudzie 1,6°. Wzmocnienie odruchu obliczono jako stosunek prędkości ruchu oka do prędkości bodźca (lewe panele), a fazę odruchu obliczono z różnicy faz między prędkością ruchu oka a prędkością bodźca ( prawe panele). B) Uczenie motoryczne osiągnięto poprzez adaptacyjne zwiększanie VOR przy użyciu paradygmatu treningu w przeciwfazie. Mysz poddano wizualno-przedsionkowemu paradygmatowi treningowemu, w którym obrót myszy odbywał się w przeciwfazie (180°) do obrotu otaczającego ekranu (oba obracały się z częstotliwością 1,0 Hz, 1,6°) przez czterdzieści minut. Co 10 minut testowano VOR (1,0 Hz, 1,6°). U tej myszy trening w przeciwfazie zwiększył wzmocnienie VOR.
Film 1. Animacja przedstawiająca paradygmat indukujący OKR u myszy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 2. Animacja przedstawiająca paradygmat indukujący odruch przedsionkowo-oczny (VOR) u myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 3. Animacja przedstawiająca paradygmat indukujący VVOR u myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 4. Animacja przedstawiająca paradygmat treningu wizuowestykularnego w przeciwfazie, który indukuje adaptację VOR (wzrost) u myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie4.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić film</a>.

<ol><li>Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optokinetic+and+vestibulo-ocular+reflexes+in+dark-reared+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optokinetic and vestibulo-ocular reflexes in dark-reared rabbits.</a> Exp. Brain Res. 27, 287(1977).</li>
<li>Collewijn, H. E. ye- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+head+movements+in+freely+moving+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">and head movements in freely moving rabbits.</a> J. Physiol. 266, 471(1977).</li>
<li>Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollewijn%2C+H+%22The+oculomotor+system+of+the+rabbit+and+its+plasticity%22">The oculomotor system of the rabbit and its plasticity</a>. , 1st edition, Springer-Verlag. Berlin. (1981).</li>
<li>Fuller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+eye+and+head+movements+in+the+alert+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Linkage of eye and head movements in the alert rabbit.</a> Brain Res. 194, 219(1980).</li>
<li>Buttner-Ennever, J. A., Horn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+substrates+of+oculomotor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Anatomical substrates of oculomotor control.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 7, 872(1997).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+control+systems+analysis+in+the+neurophysiology+of+eye+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The use of control systems analysis in the neurophysiology of eye movements.</a> Annu. Rev. Neurosci. 4, 463(1981).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purpose+of+eye+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">The purpose of eye movements.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 17, 835(1978).</li>
<li>Stahl, J. S., van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+video+and+magnetic+search+coil+recordings+of+mouse+eye+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements.</a> J. Neurosci. Methods. 99, 101(2000).</li>
<li>De Zeeuw, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+protein+kinase+C+inhibitor+in+Purkinje+cells+blocks+cerebellar+LTD+and+adaptation+of+the+vestibulo-ocular+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expression of a protein kinase C inhibitor in Purkinje cells blocks cerebellar LTD and adaptation of the vestibulo-ocular reflex.</a> Neuron. 20, 495(1998).</li>
<li>Picciotto, M. R., Wickman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+knockout+and+transgenic+mice+to+study+neurophysiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Using knockout and transgenic mice to study neurophysiology and behavior.</a> Physiol. Rev. 78, 1131(1998).</li>
<li>Oommen, B. S., Stahl, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+orientation+during+static+tilts+and+its+relationship+to+spontaneous+head+pitch+in+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Eye orientation during static tilts and its relationship to spontaneous head pitch in the laboratory mouse.</a> Brain. Res. 1193, 57(2008).</li>
<li>Stahl, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Channelopathy+Mutants+and+Their+Role+in+Ocular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22Research.+Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Channelopathy Mutants and Their Role in Ocular Motor.</a> Research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 956, 64(2002).</li>
<li>Stahl, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+movements+of+the+murine+P%2FQ+calcium+channel+mutant+tottering%2C+and+the+impact+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Eye movements of the murine P/Q calcium channel mutant tottering, and the impact of aging.</a> J. Neurophysiol. 95, 1588(2006).</li>
<li>Andreescu, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+improves+cerebellar+memory+formation+by+activating+estrogen+receptor+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Estradiol improves cerebellar memory formation by activating estrogen receptor beta.</a> Journal of Neuroscience. 27, 10832(2007).</li>
<li>Katoh, A., Kitazawa, H., Itohara, S., Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+characteristics+and+adaptability+of+mouse+vestibulo-ocular+and+optokinetic+response+eye+movements+and+the+role+of+the+flocculo-olivary+system+revealed+by+chemical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic characteristics and adaptability of mouse vestibulo-ocular and optokinetic response eye movements and the role of the flocculo-olivary system revealed by chemical lesions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7705(1998).</li>
<li>Stahl, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+eye+movements+to+assess+brain+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Using eye movements to assess brain function in mice.</a> Vision Res. 44, 3401(2004).</li>
<li>Koekkoek, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+adaptation+and+phase+dynamics+of+compensatory+eye+movements+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Funct%22%5BJournal%5D)">Gain adaptation and phase dynamics of compensatory eye movements in mice.</a> Genes Funct. 1, 175(1997).</li>
<li>Faulstich, B. M., Onori, K. A., du Lac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plasticity+and+development+of+mouse+optokinetic+and+vestibulo-ocular+reflexes+suggests+differential+gain+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of plasticity and development of mouse optokinetic and vestibulo-ocular reflexes suggests differential gain control mechanisms.</a> Vision Res. 44, 3419(2004).</li>
<li>Koekkoek, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+adaptation+and+phase+dynamics+of+compensatory+eye+movements+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Funct%22%5BJournal%5D)">Gain adaptation and phase dynamics of compensatory eye movements in mice.</a> Genes Funct. 1, 175(1997).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Aby uzyskać wysokiej jakości wideozapisy ruchów gałek ocznych u myszy, konieczne jest spełnienie kilku wymagań. Procedurę kalibracji należy przeprowadzić w wyżej wspomniany, zestandaryzowany sposób. Na przykład kalibracja poza centrum, gdy źrenica nie znajduje się na pionowej linii środkowej względem referencyjnego CR podczas procedury kalibracji, doprowadzi do niedoszacowania RP, a w konsekwencji do przeszacowania ruchu gałki ocznej. Ponadto zalecamy zintegrowanie metody korekcji wielkości źrenicy z procedurą kalibracji12, ponieważ próby wykazujące bardzo stabilną wielkość źrenicy są niezwykle rzadkie. Nawet niewielki stresor podczas próby może już znacząco zmienić średnicę źrenicy.
Podczas projektowania eksperymentu dotyczącego ruchów gałek ocznych należy wziąć pod uwagę lub kontrolować następujące czynniki, ponieważ wiadomo, że wpływają one na reakcję ruchową oka: wiek13,18, płeć14 oraz szczep15,16,19. Ponadto zwierzę eksperymentalne powinno posiadać pigmentowane tęczówki, ponieważ detekcja i śledzenie źrenicy są niemożliwe, gdy kontrast między źrenicą a tęczówką jest zbyt niski, jak ma to miejsce u myszy BALB/c. Zwierzęta wyjątkowo zdenerwowane lub lękliwe muszą zostać przeszkolone przed eksperymentem, aby przyzwyczaić się do układu doświadczalnego i warunków unieruchomienia. Taka procedura obchodzenia się ze zwierzętami skutkuje rzadszym całkowitym lub częściowym zamykaniem oczu i zapobiega wydzielaniu płynów z oczu podczas eksperymentu, co w konsekwencji pozwala na lepsze śledzenie źrenicy.
Wreszcie, pozyskiwanie i analiza danych wymagają od dwóch do trzech godzin na zwierzę. W związku z tym rejestracja ruchów gałek ocznych prawdopodobnie pozostanie procedurą specyficzną, stosowaną u wybranych myszy, i nie nadaje się do roli testu przesiewowego o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>Izofluran</td><td>Rhodia Organique Fine LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td>FHC</td><td>40-90-8</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel z kwasem fosforowym</td><td>Kerr</td><td>31297</td><td></td></tr><tr><td>Optibond prime</td><td>Kerr</td><td>35369</td><td></td></tr><tr><td>Adhezyw Optibond</td><td>Kerr</td><td>35369</td><td></td></tr><tr><td>Kompozyt Charisma</td><td>Heraeus Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa polimeryzacyjna Maxima 480</td><td>Henry Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silnik z serwosterowaniem AC</td><td>Harmonic drive AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekran cylindryczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa halogenowa (20 W)</td><td>RS components</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potencjometry (precyzyjne)</td><td>Bourns inc.</td><td>6574</td><td></td></tr><tr><td>Power 1401 (interfejs I/O)</td><td>CED limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputery</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emitery podczerwieni</td><td>RS components</td><td>195-451</td><td></td></tr><tr><td>ETL-200</td><td>ISCAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw z zoomem (zoom 6000)</td><td>Navitar inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azotan pilokarpyny (minims)</td><td>Laboratoire Chauvin</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wideookulografia u myszy

Video-oculography in Mice

Ruchy gałek ocznych są bardzo istotne dla śledzenia obiektu lub stabilizacji obrazu na siatkówce podczas ruchu. Zwierzęta nieposiadające dołka centralnego, takie jak mysz, mają ograniczoną zdolność do utrwalenia wzroku na celu. W przeciwieństwie do tych ukierunkowanych na cel ruchów oczu, kompensacyjne ruchy oczu są łatwo wywoływane u zwierząt bez dołka centralnego1,2,3,4. Kompensacyjne ruchy oczu są generowane poprzez przetwarzanie informacji przedsionkowych i optokinetycznych w sygnał sterujący, który napędza mięśnie oka. Przetwarzanie informacji przedsionkowych i optokinetycznych można badać osobno oraz wspólnie, co pozwala na określenie deficytu w układzie okulomotorycznym. Układ okulomotoryczny można testować poprzez wywołanie odruchu optokinetycznego (OKR), odruchu przedsionkowo-ocznego (VOR) lub wzmocnionego wizualnie odruchu przedsionkowo-ocznego (VVOR). OKR jest ruchem odruchowym, który kompensuje ruchy obrazu w „pełnym polu” na siatkówce, natomiast VOR jest odruchowym ruchem oka, który kompensuje ruchy głowy. VVOR jest odruchowym ruchem oka, który wykorzystuje zarówno informacje przedsionkowe, jak i optokinetyczne, aby dokonać odpowiedniej kompensacji. Móżdżek monitoruje i jest w stanie korygować te kompensacyjne ruchy oczu. Dlatego okulografia jest bardzo potężnym narzędziem do badania zależności między mózgiem a zachowaniem w warunkach prawidłowych, jak i patologicznych (np. o pochodzeniu przedsionkowym, ocznym i/lub móżdżkowym).
Badanie układu okulomotorycznego jako paradygmatu behawioralnego jest interesujące z kilku powodów. Po pierwsze, układ okulomotoryczny jest dobrze poznanym układem neuronalnym5. Po drugie, układ okulomotoryczny jest stosunkowo prosty6; zakres możliwych ruchów gałki ocznej jest ograniczony przez jej architekturę w postaci kuli w panewce („pojedynczy staw”) oraz trzy pary mięśni pozagałkowych7. Po trzecie, odpowiedź behawioralną i bodźce sensoryczne można łatwo zmierzyć, co czyni ten układ bardzo dostępnym do analizy ilościowej8. Wielu testom behawioralnym brakuje tak wysokiej mocy ilościowej. I wreszcie, badać można zarówno sprawność, jak i plastyczność układu okulomotorycznego, co umożliwia prowadzenie badań nad procesami uczenia się i pamięci9.
Myszy modyfikowane genetycznie są obecnie szeroko dostępne i stanowią istotne źródło do badania funkcji mózgu na różnych poziomach10. Ponadto mogą być wykorzystywane jako modele naśladujące ludzkie choroby. Zastosowanie okulografii u myszy prawidłowych, traktowanych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie jest potężnym narzędziem badawczym pozwalającym zgłębić fizjologię zachowań motorycznych w warunkach prawidłowych i patologicznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy sposób pomiaru wideo-okulografii u myszy8.

Wideookulografia jest bardzo ilościową metodą badania sprawności motorycznej oczu, a także uczenia się motorycznego. W niniejszym materiale opisujemy sposób przeprowadzania wideookulografii u myszy. Zastosowanie tej techniki u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie stanowi potężne narzędzie badawcze do zgłębiania fizjologii leżącej u podstaw zachowań motorycznych.

Wideookulografia u myszy

Ruchy gałek ocznych są bardzo ważne dla śledzenia obiektu lub stabilizacji obrazu na siatkówce podczas poruszania się. Zwierzęta pozbawione dołka centralnego, takie jak...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie wideookulografii u myszy. Osiąga się to najpierw poprzez wyposażenie myszy w konstrukcję podstawy (pedestał) na czaszce, co umożliwia unieruchomienie głowy w specjalnym stabilizatorze głowy i ciała. Drugim krokiem jest umieszczenie myszy w układzie do wideookulografii oraz kalibracja systemu śledzenia źrenic wideo.Następnie rejestrowane są ruchy gałek ocznych podczas aktywacji układu okulomotorycznego przy użyciu szerokiego zestawu bodźców przedsionkowych i optokinetycznych. Ostatnim krokiem jest analiza tych ruchów gałek ocznych. W efekcie wideookulografia u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie może być wykorzystywana do badania fizjologii zachowań ruchowych.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat okularnego układu ruchowego, można ją również zastosować do badania chorób o pochodzeniu móżdżkowym, przedsionkowym lub okularnym, wykorzystując mutanty mysie naśladujące patologie ludzkie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy znieczulić mysz w komorze gazowej mieszaniną izofluranu i tlenu. Następnie należy podtrzymać znieczulenie, podając gaz przez maskę.Następnie należy zastosować podkładkę grzewczą oraz analny czujnik temperatury, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. Następnie należy zaaplikować maść do oczu w celu ochrony oczu przed wyschnięciem, ogolić sierść z grzbietnej części czaszki i oczyścić obszar operacyjny. Po tym czasie należy wykonać nacięcie w linii pośrodkowej, aby odsłonić grzbietną powierzchnię czaszki, a następnie oczyścić i osuszyć tę powierzchnię.Następnie na powierzchnię Lambda nanieś kroplę kwasu fosforowego z zestawu bgma. Po 15 sekundach usuń preparat trawiący, a następnie oczyść powierzchnię czaszki solą fizjologiczną i ponownie ją osusz. Na wierzchołek wytrawionej powierzchni czaszki nanieś kroplę opti bond prime i wysusz strumieniem powietrza.Suszyć przez 30 sekund. Następnie nałożyć kroplę adhesywu opti bond na primer opti bond. Utwardzać światłem UV przez jedną minutę.Następnie przykryj warstwę adhezyjną cienką warstwą kompozytu Charisma. W kompozycie zatapia się łącznik z otworem na śrubę magnesu oraz miejsca mocowania. Następnie utwardź kompozyt światłem UV.W razie potrzeby należy ponownie nałożyć dodatkowe warstwy kompozytu i utwardzić je światłem. Pozostawić mysz do rekonwalescencji przez co najmniej trzy dni po zabiegu. Następnym krokiem jest umieszczenie myszy w stabilizatorze i przymocowanie jej głowy do stabilizatora za pomocą magnesu oraz jednej śruby; następnie zamontować stabilizator głowy i ciała myszy na platformie XY.Korzystając z platformy XY, umieść głowę myszy nad środkiem tarczy obrotowej, tak aby mysz mogła być przemieszczana wzdłuż osi pochylenia Ya i osi przechylenia. Następnie ustaw głowę pod odpowiednim kątem pochylenia ya i przechylenia, wyrównując oko na podstawie obrazu generowanego przez system skanowania oka. Obecnie tarcza obrotowa jest podłączona do silnika sterowanego serwomechanizmem AC.Położenie tarczy obrotowej jest monitorowane za pomocą potencjometru przymocowanego do jej osi. Tarcza obrotowa jest osłonięta cylindrycznym ekranem z losowym wzorem kropek, który jest również wyposażony w silnik sterowany serwomechanizmem prądu przemiennego (AC). Położenie cylindrycznego ekranu jest monitorowane przez potencjometr przymocowany do jego osi.Ekran może być oświetlony lampą halogenową. Ruch tarczy obrotowej i otaczającego ją ekranu jest sterowany przez komputer podłączony do interfejsu wejścia-wyjścia. Sygnały pozycji tarczy obrotowej i otaczającego ekranu są filtrowane przez częstotliwość odcięcia 20 hertz, digitalizowane przez interfejs wejścia-wyjścia i zapisywane na tym komputerze.Oko myszy jest oświetlane przez trzy emitery podczerwieni. Dwa z nich są przymocowane do tarczy obrotowej, a trzeci jest przytwierdzony do kamery. Ten trzeci emitter generuje referencyjne odbicie rogówkowe, które jest wykorzystywane podczas procedury kalibracji oraz podczas rejestracji ruchów oka.Kamera CCD w podczerwieni wyposażona w obiektyw zoom jest przymocowana do obrotowego stołu i skierowana na głowę myszy znajdującej się w centrum stołu. Kamerę można odblokować i przesuwać wokół osi stołu obrotowego w zakresie dokładnie 20 stopni.Podczas procedury kalibracji sygnał wideo jest przetwarzany przez system śledzenia wzroku, który może śledzić źrenicę oraz referencyjne odbicie rogówki w kierunku poziomym i pionowym z częstotliwością próbkowania 120 hertz. Następnie sygnały referencyjnej pozycji rogówki, pozycji źrenicy oraz wielkości źrenicy są digitalizowane przez interfejs wejścia-wyjścia i zapisywane w tym samym pliku co sygnały pozycji tabeli i otaczającego ekranu w celu skalibrowania ruchów gałki ocznej; należy dostosować pozycję głowy myszy względem kamery w taki sposób, aby obraz wideo źrenicy znajdował się w środku monitora, a reprezentacja referencyjnego odbicia rogówki znajdowała się na pionowej linii środkowej oka bezpośrednio nad źrenicą.Następnie przesuń kamerę kilkakrotnie o 20 stopni w szczycie. Wykonaj obrót wokół osi pionowej stołu obrotowego. Wykorzystaj pozycje śledzonej źrenicy oraz punktu odniesienia rogówki zarejestrowane w skrajnych pozycjach kamery, aby obliczyć promień rotacji źrenicy.Powtórz te kroki wielokrotnie w różnych warunkach oświetlenia, aby określić zależność między wielkością źrenicy a jej rotacją. Następnie sporządź krzywą korekcji rotacji źrenicy. Teraz oblicz pozycję kątową oka, mierząc referencyjną pozycję rogówki, pozycję źrenicy oraz wielkość źrenicy.Wartość rotacji źrenicy można wyodrębnić z krzywej korekcji rotacji źrenicy, a kątową pozycję oka można obliczyć, korzystając z następującego wzoru. Przedstawiono tutaj eksperyment dotyczący ruchu oczu w ramach VVOR. Teraz należy przekonwertować pozycje oczu, pozycje tabel oraz pozycje otaczającego ekranu na pozycje kątowe.Następnie wyznacz pochodną i przefiltruj pozycje kątowe stołu oraz oka za pomocą filtru dolnoprzepustowego Butterwortha. Przy częstotliwości odcięcia 20 Hz usuń artefakty z sygnału prędkości oka, stosując próg detekcji 40 stopni na sekundę. Następnie uśrednij sygnały prędkości stołu i oka dla każdego pojedynczego cyklu w próbie, a uśrednione sygnały dopasuj do odpowiedniej funkcji.Zazwyczaj stosuje się sinusoidalną stymulację prędkości, a średnie cykle dopasowuje się do funkcji sinus lub cosinus. Film ten pokazuje, w jaki sposób ruchy gałek ocznych są generowane poprzez rotację otaczającego ekranu w celu wywołania odruchu optokinetycznego, przy czym ekran obraca się w zakresie częstotliwości od 0.2 do 1 Hz z amplitudą 1,6 stopnia. Wykazano, że system optokinetyczny myszy jest bardziej wydajny w zakresie niskich częstotliwości niż w zakresie wysokich częstotliwości.Oto kolejny film pokazujący, w jaki sposób generowane są ruchy gałek ocznych. Poprzez rotację myszy w ciemności w celu wywołania odruchu przedsionkowo-ocznego, obracano stół obrotowy w zakresie częstotliwości od 0.2 do 1 Hz z amplitudą 1.6 stopni. Wykazano, że układ przedsionkowo-oczny myszy jest bardziej wydajny w zakresie wysokich częstotliwości niż w zakresie niskich częstotliwości.Poniższy film przedstawia sposób generowania ruchów gałek ocznych poprzez obracanie myszy w świetle w celu wywołania wizualnie wzmocnionego przedsionkowo-ocznego odruchu prostowania. Podczas obracania tarczy w zakresie częstotliwości od 0,2 do 1 Hz z amplitudą 1,6 stopnia, przy jednoczesnym dobrym oświetleniu otaczającego ekranu, wykazano, że mysz generuje efektywne kompensacyjne ruchy gałek ocznych w całym zakresie częstotliwości. Ten film pokazuje natomiast, w jaki sposób osiągnięto uczenie motoryczne poprzez adaptacyjne zwiększenie odruchu przedsionkowo-ocznego. Z zastosowaniem paradygmatu treningu w przeciwfazie, obracanie tarczy w przeciwfazie do otaczającego ekranu zwiększa wzmocnienie VOR u tej myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić badanie okularystyczne wideo u myszy.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wideo-okulograffia u myszy

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Źródło: Wang, Z., et al. Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy.  J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia technikę obrazowania siatkówki in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Znieczulone myszy są przygotowywane do obrazowania poprzez zabezpieczenie głowy, nałożenie lubrykantu do oczu i umieszczenie szkiełka nakrywkowego na oku. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) eksprymujące białka fluorescencyjne są najpierw wizualizowane za pomocą epifluorescencji w celu...

Dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Prezentowany protokół powoduje uporczywy konflikt sensoryczny w eksperymentach mających na celu badanie długoterminowej nauki. Nosząc na stałe urządzenie na głowie, myszy są stale narażone na niedopasowanie sensoryczne między bodźcami wzrokowymi i przedsionkowymi podczas swobodnego poruszania się w klatkach domowych.

Długotrwały konflikt sensoryczny u swobodnie zachowujących się myszy

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Tutaj opisujemy standardowy protokół do ilościowego określania odruchu optokinetycznego. Łączy w sobie wirtualną stymulację bębna i wideookulografię, a tym samym umożliwia precyzyjną ocenę selektywności cech zachowania i jego plastyczności adaptacyjnej.

Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy

Poznaj wideookulografię u myszy do badania ruchów gałek ocznych i uczenia się motorycznego. Ta metoda pozwala analizować fizjologię zachowań motorycznych oraz choroby układu okulomotorycznego.

Wideookulografia u myszy

Przeglądaj więcej filmów