Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów
10 stycznia 2019
Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.
Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurologii i okulistyki oraz pomóc w ocenie dużej różnorodności retinopatii i objawów siatkówkowych w różnych modelach gryzoni. Główną zaletą tych technik jest to, że można przeprowadzać nieinwazyjne badania podłużne, co zmniejsza zmienność i liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentów. Metody te umożliwiają ilościowe badanie struktury i funkcji in vivo, które można wykorzystać do badania stanów patologicznych lub do oceny potencjalnej użyteczności nowych środków terapeutycznych.
Jednak szczególnie zastosowanie technologii optycznej koherentnej tomografii w modelach gryzoni jest nadal trudne, głównie ze względu na mały rozmiar oka. Procedury zademonstruje Michael Dietrich, doktorant z naszego laboratorium. Po znieczuleniu gryzonia nałóż jedną kroplę tropikamidu fenylefryny na każde oko w celu rozszerzenia źrenic.
Po minucie zetrzyj nadmiar mokrej kropli do oczu. I smaruj oczy żelem okulistycznym na bazie metylocelulozy, aby uniknąć wysuszenia oka i zmętnienia rogówki. Następnie użyj kleszczyków, aby umieścić niestandardową soczewkę kontaktową na oku.
Naciśnij przycisk Start w prawym rogu wyświetlacza panelu sterowania, aby uruchomić tryb akwizycji. Następnie, aby zobrazować lewe oko, ustaw uchwyt tak, aby żarówka lewego oka gryzonia była skierowana w stronę aparatu. Ustaw poziom filtra na R i wybierz BR i OCT dla obrazowania dna oka niebieskich odbić i akwizycji B-scan w oprogramowaniu.
Następnie ustaw odległość ustawiania ostrości na około 38 dioptrii za pomocą pokrętła ostrości z tyłu aparatu. I powiększ siatkówkę, aż skan OCT będzie widoczny na ekranie. Następnie, aby zapewnić ścieżkę wiązki przez środek źrenicy, z ortogonalnym kątem siatkówki we wszystkich płaszczyznach, należy ustawić tarczę nerwu wzrokowego w środku oświetlanego pola.
I dostosuj poziome i pionowe skany B linii do poziomu poziomego, obracając uchwyt. Na ekranie oprogramowania wybierz tryb skanowania woluminu i ustaw go na 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości przy 50 automatycznym śledzeniu w czasie rzeczywistym. Wyśrodkuj środek siatki skanowania woluminu na dysku optycznym i rozpocznij akwizycję, naciskając pokrętło czarnej czułości, a następnie Acquire na panelu sterowania.
Po zakończeniu akwizycji ustaw poziom filtra na A.Wybierz opcję Niebieska autofluorescencja na panelu sterowania. I dostosuj jasność obrazu za pomocą pokrętła czułości. Naciśnij pokrętło czułości, a następnie Aprykcja, aby zobrazować komórki fluorescencyjne lub osady autofluorescencyjne.
Do analizy skanów woluminów użyj automatycznej segmentacji oprogramowania urządzenia OCT, klikając skanowanie prawym przyciskiem myszy. I wybierz Segmentacja, a następnie Wszystkie warstwy. Wykonaj ręczną korektę warstw, klikając dwukrotnie żądany skan.
Wybierz Profil grubości. I kliknij Edytuj segmentacje warstw. Zaznaczaj jedną warstwę na raz.
W razie potrzeby popraw zieloną linię, przesuwając czerwone kropki, przeciągając i upuszczając we właściwe miejsce. Następnie wybierz zakładkę Mapa grubości. Wybierz siatkę ETDRS o średnicy 1, 2, 3 milimetrów.
Wyśrodkuj wewnętrzny okrąg na tarczy nerwu wzrokowego. Na koniec oblicz grubość warstw siatkówki na podstawie wartości grubości dostarczonych przez oprogramowanie dla różnych sektorów siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Aby obliczyć główne wartości grubości ze skanów objętościowych, użyj całej 1, 2, 3 milimetrowej siatki ETDRS, która obejmuje kąt około 25 stopni, z wyłączeniem wewnętrznego okręgu o długości jednego milimetra, który zawiera tarczę nerwu wzrokowego.
Zacznij od wybrania platformy do pomiaru gryzoni. Otwórz okno Ustawienia wstępne, klikając dwukrotnie oprogramowanie. Wybierz pozycję Nowa grupa i wybierz nazwę grupy, liczbę obiektów, gatunki i szczepy.
Z menu rozwijanego wybierz bodziec zmienny, częstotliwość czasoprzestrzenną, czułość kontrastu, prędkość lub orientację i naciśnij Utwórz nową grupę. Ustaw ostrość na platformie, manipulując pierścieniem ostrości aparatu na górze komory. I skalibruj system, wyrównując czerwone kółko wokół czarnego koła na platformie.
Następnie umieść gryzonia na platformie i pozwól mu przystosować się do środowiska przez około pięć minut. Następnie rozpocznij pomiar, wybierając strzałkę w lewo dla tak lub kwadrat dla nie, jeśli zwierzę odpowiednio śledzi lub nie śledzi. Ręcznie wybierz rozmiar kroku bodźca, klikając strzałki w górę i w dół obok bodźca zmiennego.
Na koniec wybierz kartę Podsumowanie i kliknij Plik, Eksportuj tabelę lub Wykres, aby wyeksportować żądany zestaw danych. Wyniki wskazują, że zmniejsza się degeneracja wewnętrznych warstw siatkówki. Kliniczny wynik EAE jest osłabiany podczas kursu EAE, gdy podawano substancję 1.
Co więcej, OKR ujawnia poprawę ostrości wzroku u zwierząt leczonych substancją 1 w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG EAE, mierzoną za pomocą testów progów częstotliwości przestrzennej przez okres 120 dni. Podczas wykonywania pomiarów OCT krytycznym krokiem jest ortogonalna orientacja wiązki laserowej we wszystkich płaszczyznach w stosunku do siatkówki, aby zapewnić jakość i powtarzalność wartości grubości. W przypadku techniki OKR rozróżnienie między śledzeniem a normalnymi ruchami behawioralnymi zwierzęcia wymaga pewnego przeszkolenia badacza.
Ważne jest, aby być zaślepionym dla grupy eksperymentalnej. Po tych badaniach strukturalnych i funkcjonalnych uszkodzeń występujących w kontekście eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, procedura może być również pomocna w innych modelach obejmujących układ wzrokowy, w tym między innymi w modelach retinopatii lub uszkodzenia nerwu wzrokowego. Techniki te torują drogę do badań in vivo w dziedzinie neurologii i okulistyki i można je łatwo przenieść do badań klinicznych.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia kompleksowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych w modelach gryzoni za pomocą tomografii koherencyjnej (OCT) i odpowiedzi optokinetycznej (OKR). Te nieinwazyjne techniki zapewniają wgląd przydatny zarówno w badaniach okulistycznych, jak i neurologicznych, umożliwiając przeprowadzanie badań podłużnych z mniejszą zmiennością i mniejszą liczbą zwierząt badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Okulistyka
- Modele gryzoni
Tło
- Badanie koncentruje się na ocenie retinopatii i objawów siatkówki u gryzoni.
- Podkreśla wyzwania związane z stosowaniem OCT ze względu na małą wielkość oczu gryzoni.
- OCT i OKR umożliwiają ilościowe in vivo badania struktury i funkcji siatkówki.
- Te metody dostarczają cennych danych do oceny potencjalnych leków i rozumienia stanów patologicznych.
Cel badania
- Opracować i zademonstrować protokół stosowania OCT i OKR w badaniach na gryzoniach.
- Zbadać uszkodzenia strukturalne i funkcjonalne w kontekście eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE).
- Ocenić skuteczność nowych substancji leczniczych w modelach przedklinicznych.
Zastosowane metody
- Gryzonie były znieczulone dla komfortu podczas procedur OCT i OKR.
- Wykonano obrazowanie OCT za pomocą niestandardowej soczewki kontaktowej i specyficznych ustawień oprogramowania dla skanów wysokiej rozdzielczości.
- Platforma OKR obejmowała prezentację różnych bodźców w celu oceny zdolności śledzenia wzrokowego.
- Kluczowe kroki obejmowały staranne kalibracje i procedury pozyskiwania, aby zapewnić wiarygodne wyniki obrazowania i śledzenia.
Główne wyniki
- Wyniki wskazywały na zmniejszone zwyrodnienie warstw wewnętrznej siatkówki u leczonych gryzoni.
- Obserwowano zwiększoną ostrość wzroku u leczonych zwierząt w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.
- Dane sugerują, że te techniki mogą niezawodnie mierzyć zmiany siatkówki i funkcję wzroku w czasie.
Konkluzje
- To badanie wykazuje żywotność OCT i OKR jako potężnych narzędzi do badań in vivo w neurologii i okulistyce.
- Wyniki umożliwiają dalsze badania patologii siatkówki i ocenę nowych interwencji terapeutycznych.
- Przedstawione metodologie mogą znacząco przyczynić się do projektowania badań klinicznych i rozumienia zaburzeń układu wzrokowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Combining structural and functional visual system readouts enables longitudinal, quantitative assessment of retinal integrity and visual function in rodent models, supporting mechanistic de-risking in preclinical neurology and ophthalmology programs. This dual-modality approach reduces experimental variability and animal use while providing translatable endpoints for evaluating neuroprotective or disease-modifying therapeutics. The methodology enhances predictive confidence in target validation by correlating retinal structural changes with functional visual outcomes across disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying retinal layer thickness as a structural biomarker of neurodegeneration or neuroprotection.
- Operational Value: Provides reproducible, noninvasive structural readouts that support functional target validation in visual pathway modulation.
- Predictive Value: Correlates OCT-derived retinal structural changes with OKR-measured visual acuity to strengthen target engagement and pathway modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized OCT and OKR procedures for quantitative in vivo imaging and behavioral tracking, enabling reliable compound screening.
- Reproducibility: Facilitates longitudinal tracking of retinal structure and function, reducing inter-animal variability and improving assay precision.
- Scalability: Supports high-throughput adaptation through customizable stimulus parameters and automated segmentation for consistent data output across studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates applicability in autoimmune encephalomyelitis (EAE) models, linking retinal structural preservation to functional visual improvement and clinical symptom attenuation.
- Translational Continuity: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by measuring both retinal neurodegeneration and visual function recovery over extended periods.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating substance-induced reduction in inner retinal layer degeneration and improved spatial frequency thresholds over 120 days.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering structural and functional endpoints that inform biological activity and therapeutic potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative in vivo investigation of retinal structure and function in neurodegeneration and neuroprotection models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible structural thickness maps and functional tracking metrics for reliable compound evaluation in visual system assays.
- Analytics: Generates layer-specific thickness profiles and spatial frequency thresholds that enable cross-condition comparison and dose-response analysis.
- Translational Research: Connects structural retinal preservation with functional visual acuity recovery, supporting biomarker alignment and preclinical continuity in neurologic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal visual system assessment across multiple disease indications and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through correlated structural and functional visual system readouts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via calibrated imaging protocols and blinded behavioral tracking procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, translatable biomarkers of retinal and visual function change, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating both retinal structural preservation and visual functional improvement in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, ophthalmic preparation, and OCT/OKR system operation for reliable data acquisition.
- Depends on customized holders, contact lenses, and calibrated imaging systems to accommodate small rodent eye size and ensure beam alignment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, dilation, lubrication, and imaging protocols to maintain consistency across sites or studies.
- Involves adaptation considerations for varying stimulus parameters (spatiotemporal frequency, contrast, speed) in OKR assays across species and strain models.
- Includes practical limitations such as the need for investigator training to distinguish true optokinetic tracking from normal behavioral movements and ensure blinding during assessment.
