Name: Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj nieinwazyjną ocenę struktury i funkcji siatkówki u myszy i szczurów za pomocą optycznej tomografii koherentnej oraz odpowiedzi optokinetycznej. Te metody umożliwiają długoterminowe badania retinopatii z mniejszą liczbą zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Fundacji Dr. Roberta Pflegera i Fundacji Ilselore Luckow, a także Biogen i Novartis dla PA. Rysunek 1B został odtworzony z "Manipulatory pozycyjne całego ciała do obrazowania oka znieczulonych myszy i szczurów: przewodnik zrób to sam". Dietrich, M., Cruz-Herranz, A., Yiu, H., Aktas, O., Brandt, A. U., Hartung, HP., Green, A., Albrecht, P. BMJ Otwarta Okulistyka. 1 (1), e000008, 2017" za zgodą BMJ Publishing Group Ltd.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez władze regionalne (Państwowa Agencja ds. Przyrody, Środowiska i Ochrony Konsumentów; numer referencyjny 84-02.04.2014.A059) i zgodne z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz z europejską dyrektywą 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
1. Konfokalna skaningowa laserowa oftalmoskopia - optyczna koherentna tomografia
UWAGA: Protokół pomiaru cSLO-OCT można dostosować do wszystkich szczepów myszy laboratoryjnych i szczurów.
<ol>
	<li>Przygotowanie do konfiguracji i wstępnego obrazowania 
	UWAGA: Konfiguracja systemu urządzenia OCT używanego w tym protokole została już opisana w innym miejscu31.</li>
	<li>Preparat dla gryzoni do znieczulenia wziewnego
	<ol>
		<li>Umieść gryzonia w komorze indukcyjnej i ustaw parownik na stężenie izofluranu 2% przy 2 l/minO2.</li>
		<li>Sprawdź, czy gryzoń jest znieczulony, szczypiąc ogon, wyjmij go z komory i zawiń w ręcznik papierowy, aby się ogrzał.</li>
		<li>Umieść gryzonia w niestandardowym uchwycie33 i zaczep siekacze szczęki o zintegrowany pręt zgryzowy ustnika, podłączony do parownika (2,5% izofluranu w dawce 2 l/min O2).</li>
		<li>Nałóż jedną kroplę Phenylephrine 2,5%-Tropicamide 0,5% na każde oko, aby rozszerzyć źrenice.</li>
		<li>Po 1 minucie zetrzyj nadmiar płynu z kropli do oczu i nasmaruj oczy żelem okulistycznym na bazie metylocelulozy (np. kroplami do oczu hypromeloza 0,3%), aby uniknąć wysuszenia i zmętnienia rogówki.</li>
		<li>Umieść niestandardowe soczewki kontaktowe (+4 dioptrie) na oku myszy ręcznie lub za pomocą kleszczy. Przykryj oko szczura szklaną płytką (np. okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 mm) bez właściwości optycznych, aby zapewnić płaską powierzchnię. 
		UWAGA: Monitoruj częstość oddechów podczas znieczulenia. W razie potrzeby należy zwiększyć lub zmniejszyć stężenie izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar i analiza 
	UWAGA: Upewnij się, że wykonujesz i raportujesz pomiary OCT zgodnie z zaleceniami APOTEL34 i przeprowadzaj kontrolę jakości zgodnie z kryteriami konsensusu OSCAR-IB35. Ponieważ zalecenia te zostały opracowane dla obrazów OCT u ludzi, niektóre kryteria nie mają zastosowania lub mają zastosowanie tylko częściowo.
	<ol>
		<li>Aby zobrazować lewe oko, ustaw uchwyt tak, jak pokazano na Rysunek 1A, aby upewnić się, że bańka lewego oka gryzonia jest skierowana w stronę kamery.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Start w prawym rogu wyświetlacza panelu sterowania, aby uruchomić tryb akwizycji.</li>
		<li>Ustaw dźwignię filtra w pozycji R i wybierz BR+OCT dla obrazowania dna oka z niebieskim odbiciem i akwizycji B-scan na panelu sterowania.</li>
		<li>Ustaw odległość ostrości na ok. 38 dioptrii za pomocą pokrętła ostrości z tyłu aparatu i przybliżaj siatkówkę, aż skan OCT będzie widoczny na ekranie. 
		UWAGA: Przy pierwszym pomiarze ramię referencyjne musi być przystosowane do pomiaru gryzoni. Naciśnij kombinację Ctrl+Alt+Shift+O i dostosuj wartość ramienia referencyjnego w otwartym oknie, aż na ekranie pojawi się skanowanie OCT.</li>
		<li>Aby zapewnić ścieżkę wiązki przez środek źrenicy o prostopadłym kącie do siatkówki we wszystkich płaszczyznach, ustaw tarczę nerwu wzrokowego w środku oświetlonego pola (BR) i dostosuj poziome i pionowe skany linii B do poziomu poziomego, obracając/obracając uchwyt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B) lub przesuwając kamerę.</li>
		<li>Wybierz tryb skanowania woluminu i ustaw go na 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości przy 50 automatycznym śledzeniu w czasie rzeczywistym (ART, rasteryzowany z 50 uśrednionych A-Scans) na ekranie oprogramowania.</li>
		<li>Wyśrodkuj środek siatki skanowania woluminu na dysku optycznym i rozpocznij akwizycję, naciskając czarne pokrętło czułości, a następnie AQUIRE na panelu sterowania.</li>
		<li>Ustaw dźwignię filtra w pozycji A, wybierz opcję Blue Auto Florescence (BAF) na panelu sterowania i wyreguluj jasność obrazu za pomocą pokrętła czułości. Naciśnij pokrętło czułości, a następnie AQUIRE, aby zobrazować komórki fluorescencyjne (np. EGFP) lub osady autofluorescencyjne.</li>
		<li>Nałóż żel okulistyczny na oko gryzonia, aby zapobiec odwodnieniu i umieść zwierzę w osobnej klatce ze źródłem ciepła.</li>
		<li>Nadzoruj gryzonia, dopóki nie zostanie w pełni wyleczony ze znieczulenia, w oddzielnej klatce i trzymany indywidualnie. Gdy zwierzę jest w stanie chodzić, odłóż je do klatki domowej.</li>
		<li>Do analizy skanów woluminów użyj automatycznej segmentacji oprogramowania urządzenia OCT, klikając skanowanie prawym przyciskiem myszy i wybierając Segmentacja, a następnie Wszystkie warstwy. Upewnij się, że jakość obrazów OCT jest wystarczająca i określ wartości graniczne jakości dla każdego zestawu eksperymentów, np. >20 decybeli.</li>
		<li>Wykonaj ręczną korektę warstw, klikając dwukrotnie żądany skan, wybierz Profil grubości i kliknij Edytuj segmentacje warstw. Wybierz jedną warstwę, np. naciśnij ILM dla wewnętrznej membrany ograniczającej i, jeśli to konieczne, skoryguj zieloną linię, przesuwając czerwone kropki metodą "przeciągnij i upuść" do właściwej pozycji. 
		UWAGA: Upewnij się, że badacz wykonujący ręczną korektę jest zaślepiony dla grup eksperymentalnych.</li>
		<li>Wybierz zakładkę Mapa grubości i wybierz siatkę badania 1, 2, 3 mm wczesnego leczenia retinopatii cukrzycowej (ETDRS). Wyśrodkuj wewnętrzny okrąg na tarczy nerwu wzrokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, po lewej).</li>
		<li>Oblicz grubość warstw siatkówki na podstawie wartości grubości dostarczonych przez oprogramowanie dla różnych sektorów siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Aby obliczyć średnie wartości grubości ze skanów objętościowych, należy użyć całej siatki ETDRS 1, 2, 3 mm, która obejmuje kąt około 25°, z wyłączeniem wewnętrznego okręgu o średnicy 1 mm, który zawiera tarczę nerwu wzrokowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2, po prawej).</li>
		<li>Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Jeśli uwzględniono oba oczy zwierzęcia, rozważ model statystyczny uwzględniający korelacje między oczami w obrębie obiektu (np. uogólnione równania estymujące lub mieszane modele liniowe), ponieważ oczy jednego badanego są statystycznie zależne36.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odpowiedź optokinetyczna
UWAGA: Poniżej znajduje się szczegółowy podręcznik do pomiarów OKR myszy i szczurów, który można dostosować do indywidualnych potrzeb.
<ol>
	<li>Przygotowanie do konfiguracji i pomiaru wstępnego
	<ol>
		<li>Włącz komputer. Po uruchomieniu systemu włącz ekrany komory testowej, jak opisano bardziej szczegółowo w innym miejscu37.</li>
		<li>Wybierz odpowiednią platformę do pomiaru myszy lub szczurów. 
		UWAGA: Rozmiar platformy dobierany jest na podstawie wielkości ciała gryzonia. Zwierzę powinno być w stanie prawidłowo siedzieć na platformie bez możliwości chodzenia.</li>
		<li>Otwórz okno ustawień wstępnych, klikając dwukrotnie oprogramowanie, wybierz Nowa grupa i wybierz nazwę grupy, liczbę przedmiotów, gatunki i szczepy. Z menu rozwijanego wybierz bodziec zmienny: częstotliwość przestrzenną/czasową, czułość kontrastu, szybkość lub orientację, a następnie naciśnij Utwórz nową grupę.</li>
		<li>Ustaw ostrość na platformie, manipulując pierścieniem ostrości kamery na górze komory i skalibruj system, wyrównując (przeciągnij i upuść) czerwone kółko wokół czarnego okręgu na platformie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar i analiza
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę na platformie, pozwól mu przystosować się do otoczenia przez ~5 min. Podnieś zwierzę z powrotem na platformę, jeśli upadnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Wybierz Numer tematu i Warunek w prawym górnym rogu ekranu oprogramowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Jeden bodziec jest zmienny, pozostałe bodźce są utrzymywane na stałym poziomie. Potwierdza to symbol otwartej kłódki lub zamkniętej kłódki obok bodźca.</li>
		<li>Rozpocznij pomiar, wybierając ◄ dla Tak lub ■ dla Nie, jeśli zwierzę śledzi lub nie śledzi, odpowiednio. 
		UWAGA: Śledzenie zgodnie z ruchem wskazówek zegara odpowiada lewemu oku, a śledzenie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara prawemu oku. Oprogramowanie losowo zmienia kierunek poruszającej się siatki.</li>
		<li>Wybierz rozmiar kroku bodźca ręcznie, klikając strzałki w górę i w dół obok bodźca zmiennego lub pozwól mu dostosować się automatycznie przez oprogramowanie, jeśli próg bodźca jest zbieżny.</li>
		<li>Aby uzyskać optymalne wyniki, animuj zwierzę, np. za pomocą wysokich gwiżdżących dźwięków i wygaszania, klikając lub biały symbol pola na ekranie oprogramowania. Wykonuj te czynności wielokrotnie w przypadku przedłużających się pomiarów.</li>
		<li>W celu analizy danych wybierz zakładkę Podsumowanie i kliknij Plik | Eksportuj tabelę/wykres, aby wyeksportować żądany zestaw danych.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą żądanego oprogramowania (patrz również krok 1.3.15).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Niezwiązane z prezentowaną pracą autorzy deklarują następujące informacje finansowe: 
Michael Dietrich otrzymał honoraria mówców od Novartisu. Andrés Cruz-Herranz jest adiunktem w National Multiple Sclerosis Society. Ari J. Green zasiadał w naukowej radzie doradczej MedImmune, Novartis, OCTIMS, Inception 5 Biosciences i Bionure; jest zastępcą redaktora naczelnego czasopisma JAMA Neurology; był członkiem rady redakcyjnej czasopisma "Neurology"; posiada patent na cząsteczki i szlaki remielinizacji; konsultowany w sprawie Inception 5 Sciences; otrzymał wsparcie badawcze od Novartis Pharma OCTIMs, Inception Sciences, NINDS, NIA, National MS Society, Sherak Foundation i Hilton Foundation; posiada akcje lub opcje na akcje w Incepcji 5; oraz występował jako biegły sądowy w sprawie Mylan przeciwko Teva Pharma. Hans-Peter Hartung otrzymał honoraria za zasiadanie w komitetach sterujących od Biogen Idec, GeNeuro, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune, Bayer HealthCare, Forward Pharma i Roche, honoraria za zasiadanie w radach doradczych od Biogen Idec, Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals i Roche oraz honoraria za wykłady od Biogen Idec. Sanofi Genzyme, Merck, Novartis Pharmaceuticals, Octapharma, Opexa Therapeutics, Teva Pharmaceuticals, MedImmune i Roche. Philipp Albrecht otrzymał wynagrodzenie za zasiadanie w naukowych radach doradczych firm Ipsen, Novartis, Biogen; otrzymał honoraria prelegentów i wsparcie w podróżach od firm Novartis, Teva, Biogen, Merz Pharmaceuticals, Ipsen, Allergan, Bayer Healthcare, Esai, UCB i Glaxo Smith Kline; otrzymał wsparcie badawcze od firm Novartis, Biogen, Teva, Merz Pharmaceuticals, Ipsen i Roche. Pozostali autorzy nie informują o żadnych ujawnieniach.

Protokół ten zawiera instrukcję dotyczącą pomiarów grubości i badania funkcji wzrokowych u gryzoni. Odczyty wizualne są coraz częściej wykorzystywane w badaniach translacyjnych 18,26,38,39,40 i można je łatwo przenieść do badań klinicznych. Istotną zaletą OCT w porównaniu z badaniami histologicznymi w doświadczeniach na zwierzętach jest to, że możliwe są analizy podłużne, które pozwalają na badanie dynamicznych procesów patologicznych, co znacznie zmniejsza zmienność i liczbę zwierząt potrzebnych do badania. Ponadto obrazowanie in vivo za pomocą OCT nie jest narażone na artefakty utrwalające, tnące lub barwiące, które mogą wpływać na grubość warstwy w badaniach histologicznych.
Jednak ortogonalna orientacja wiązki laserowej we wszystkich płaszczyznach w stosunku do siatkówki jest krytycznym krokiem zapewniającym jakość i powtarzalność wartości grubości. Wymaga to pewnego przeszkolenia badacza i jest obowiązkowe przed nabyciem skanów OCT. Dodatkowo, ponieważ komercyjne urządzenia są budowane do zastosowań u ludzi, jakość obrazów OCT gryzoni jest nadal gorsza w porównaniu z B-skanami pacjentów. Z doświadczenia autorów wynika, że rozróżnienie różnych wewnętrznych warstw siatkówki (warstwy włókien nerwowych siatkówki, warstwy komórek zwojowych i wewnętrznej warstwy splotowatej) podczas ręcznej korekcji może być trudne. Dlatego zalecamy analizę tych warstw jako odczytu złożonego (IRL).
Układ eksperymentalny przewiduje opcję znieczulenia lotnego, np. wziewnego izofluranu, który z naszego doświadczenia wynika, że jest bezpieczniejszy i łatwiejszy do kontrolowania niż znieczulenie iniekcyjne, np. ketamina-ksylazyna41,42 i zmniejsza ryzyko przedwczesnego wybudzenia gryzoni w przypadku dłuższego czasu pozyskiwania (np. podczas wykonywania obrazowania komórek znakowanych fluorescencyjnie). We wstępnym badaniu skany objętości zostały zidentyfikowane jako protokoły o najwyższej ważności i wiarygodności. Wiarygodność międzyoceniającego i ponownego testu była doskonała, gdy skany objętościowe z wyłączeniem centralnej części zawierającej tarczę nerwu wzrokowego oceniano przy wartościach ICC (współczynnik korelacji wewnątrzklasowej) powyżej 0,85 dla wszystkich ocen.
Pomiar odpowiedzi optokinetycznej opiera się na mimowolnym odruchu optokinekine, który występuje w odpowiedzi na stale poruszające się pole. U gryzoni, w przeciwieństwie do innych gatunków, ruch obejmuje nie tylko oczy, ale całą głowę, co można łatwo wykryć za pomocą kamery.
Rozróżnienie między "śledzeniem" a normalnymi ruchami behawioralnymi zwierząt wymaga pewnego przeszkolenia badacza i ważne jest, aby być zaślepionym dla grupy eksperymentalnej. Ponadto zwierzęta potrzebują fazy adaptacji, aby dostosować się do warunków eksperymentalnych, a podczas długotrwałych protokołów pomiarowych zwierzęta muszą być wielokrotnie animowane, aby zapewnić, że "brak śledzenia" jest spowodowany osiągnięciem progu OKR, a nie zmniejszeniem uwagi. Istnieje również znaczna zmienność szczepu dotycząca funkcji wzrokowych myszy laboratoryjnych i szczurów43,44. Ostrość wzroku gryzoni powinna być zatem oceniana przed ich badaniem, a niektóre szczepy, takie jak myszy SJL, mogą nawet nie nadawać się do pomiarów OKR, ponieważ są homozygotyczne pod względem allelu Pde6brd1 (zwyrodnienie siatkówki 1).
Podsumowując, badanie morfologii siatkówki i funkcji wzrokowych w modelach zwierzęcych pozwala na nieinwazyjne, podłużne badania uszkodzeń strukturalnych i funkcjonalnych występujących w kontekście EAE oraz może być pomocne w innych modelach obejmujących układ wzrokowy, w tym m.in. w modelach retinopatii czy uszkodzeń nerwu wzrokowego.

Badanie szlaku wzrokowego, jako części ośrodkowego układu nerwowego, okazało się skutecznym punktem wyjścia do rozwiązania nie tylko problemów okulistycznych1,2,3,4,5, ale także neurologic6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 pytań. W ostatnich latach OCT i OKR zostały zidentyfikowane jako użyteczne, analityczne, nieinwazyjne narzędzia do oceny szerokiej gamy retinopatii i objawów siatkówkowych w różnych modelach gryzoni17,18,19,20,21,22,23,24,25. OCT pozwala na szybką i wysokorozdzielczą wizualizację in vivo morfologii i struktury siatkówki u myszy i szczurów, z wynikami dobrze zgodnymi z histologicznymi przekrojami siatkówki zwierząt 26. OKR to szybka i solidna metoda ilościowej oceny funkcji wzrokowych.
Wiele urządzeń OCT umożliwia jednoczesne obrazowanie laserowej oftalmoskopii skaningowej (cSLO) o różnych długościach fal, co dostarcza informacji diagnostycznych na temat patologii siatkówki, tj. wizualizacji złogów lipofuscyny lub zmian nabłonka barwnikowego siatkówki27. Ponadto możliwe jest obrazowanie in vivo komórek znakowanych fluorescencyjnie u zwierząt transgenicznych28,29,30,31,32. Jednak zastosowanie technologii OCT w modelach gryzoni jest nadal trudne, głównie ze względu na mały rozmiar oczu. Kilka dostępnych na rynku urządzeń wymaga adaptacji, a często do obrazowania zwierząt różnych gatunków wymagany jest inny rozmiar uchwytu. Dodatkowo zwierzęta wymagają znieczulenia do pomiaru.
OKR urządzenia mogą być używane do oceny funkcji wzrokowych u gryzoni. Zwierzęta są umieszczane na platformie w środku rzeczywistego lub wirtualnego cylindra wyświetlającego ruchomą kratę, którą zwierzęta śledzą za pomocą odruchowych ruchów głowy i szyi. Ta odpowiedź optokinekińska jest zmniejszona lub wyeliminowana w przypadku zmniejszenia lub utraty funkcji wzrokowej.
Celem tego protokołu jest przedstawienie podręcznika do pomiaru grubości siatkówki za pomocą dostępnego na rynku urządzenia OCT z niestandardowym uchwytem zapewniającym znieczulenie wziewne. Protokół ilustruje sposób analizowania skanów woluminów za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta. W przypadku testów wizualnych celem jest dostarczenie instrukcji, jak korzystać z dostępnego na rynku systemu do oceny OKR.

<table><tbody><tr><td>System Heidelberg Spectralis HRA+OCT&nbsp;</td><td>Heidelberg Engineering, Niemcy</td><td>Nie</td> dotyczy <td>systemu platformy obrazowania okulistycznego</td></tr><tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td><td>wersja 1.9.10.0</td></tr><tr><td>niebieska soczewka bezdotykowa 25D</td><td>Heidelberg Engineering, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td><td>soczewka do pomiaru gryzoni</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics Inc., Kanada</td><td>Nie dotyczy</td><td>system do analizy funkcji wzrokowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie OptoMorty HD</td><td>CerebralMechanics Inc., Kanada</td> Nie <td>dotyczy</td><td>Wersja 2.1.0</td></tr><tr><td>Wziewny środek znieczulający Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care, Betlejem, PA, USA&nbsp;</td><td>803250</td><td>wziewny środek znieczulający</td></tr><tr><td>Fenylefryna 2,5%-Tropicamid 0,5%&nbsp;</td><td>Szpital Uniwersytecki D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td>Nie dotyczy</td><td>rozszerzenia źrenic&nbsp;</td></tr><tr><td>Visc-Ophtal</td><td>Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Niemcy</td><td>58407</td><td>okulistyczny żel do oczu</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej nie dotyczy, wersja 5.00</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics</td><td>IBM Corporation, Armonk, Nowy Jork, USA</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej nie dotyczy, wersja 20</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optyczna tomografia koherentna (OCT) to szybka, nieinwazyjna, interferometryczna technika pozwalająca na obrazowanie siatkówki w wysokiej rozdzielczości. Jest to idealne narzędzie do badania procesów neurodegeneracji, neuroprotekcji i neuronaprawy obejmujących układ wzrokowy, ponieważ często są one dobrze skorelowane ze zmianami w siatkówce. Jako odczyt funkcjonalny, wizualnie wywołane kompensacyjne ruchy gałek ocznych i głowy są powszechnie stosowane w modelach eksperymentalnych obejmujących funkcję wzrokową. Połączenie obu technik pozwala na ilościowe badanie struktury i funkcji in vivo, które można wykorzystać do zbadania stanów patologicznych lub oceny potencjału nowych terapii. Dużą zaletą prezentowanych technik jest możliwość wykonywania analiz podłużnych pozwalających na badanie procesów dynamicznych, zmniejszających zmienność i zmniejszających liczbę zwierząt potrzebnych do doświadczeń. Opisany protokół ma na celu zapewnienie podręcznika do pozyskiwania i analizy wysokiej jakości skanów siatkówki myszy i szczurów przy użyciu taniego, dostosowanego uchwytu z opcją podawania znieczulenia wziewnego. Ponadto proponowany przewodnik ma służyć jako podręcznik instruktażowy dla badaczy wykorzystujących analizę odpowiedzi optokinetycznej (OKR) u gryzoni, którą można dostosować do ich specyficznych potrzeb i zainteresowań.

Przy użyciu 3rd wykonano obrazowanie OCT w generacji mysich modeli eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) indukowanego peptydem mielinowej glikoproteiny oligodendrocytów (MOG), uzyskując wysokorozdzielcze przekroje morfologiczne siatkówki myszy. Z wykorzystaniem tej technologii wykazano właściwości ochronne różnych substancji17Uzyskane wartości grubości wewnętrznych warstw siatkówki (IRL) są zgodne z liczbą komórek zwojowych siatkówki (RGC) otrzymaną poprzez barwienie histologiczne całych preparatów siatkówki (Rysunek 4).
Monitorowanie OKR zapewnia funkcjonalny odczyt neurodegeneracji widocznej w OCT. W tych eksperymentach funkcja wzrokowa oceniana jako częstotliwość przestrzenna za pomocą OKR oraz uszkodzenia neuroaksonalne oceniane jako zwężenie IRL za pomocą OCT były ze sobą ściśle skorelowane17. W celu zbadania ostrości wzroku można zastosować różne protokoły, zmieniając częstotliwość przestrzenną lub czasową, czułość kontrastu, orientację lub prędkość poruszającej się kratki. W modelu EAE u zwierząt leczonych substancją 1 stwierdzono poprawę częstotliwości przestrzennej do 0.05 cycles/degree (c/d) w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG-EAE (Rysunek 5).
<img alt="Mechanizm przegubu robotycznego pokazujący kąty obrotu; analiza inżynieryjna, schemat konstrukcyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Dedykowany uchwyt do pomiarów OCT. (A) Obrazowanie OCT myszy C57BL/6J z wykorzystaniem dedykowanego uchwytu33 oraz (B) oś obrotu wokół oka gryzonia. Przedstawiono obrót w płaszczyźnie poprzecznej (lewo) i w płaszczyźnie osiowej (prawo). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Dietrich, M. et al.33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza skanu OCT siatkówki, mapa grubości, schematy, okręgi wskazują obszary pomiarowe, ocena stanu zdrowia siatkówki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza po akwizycji OCT. Siatka ETDRS „1, 2, 3 mm” w protokole objętościowym 25 B-scan (po lewej). Grubość warstw siatkówki dla różnych sektorów siatkówki została wyznaczona przez oprogramowanie (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do analizy zachowania myszy; interfejs sterowania częstotliwością przestrzenną i kontrastem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Pomiar OKR u myszy i ustawienia bodźców. (A) Widok z góry przez kamerę analizującą mysz C57BL/6J na platformie w komorze. (B) Interfejs użytkownika i ustawienia oprogramowania OKR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki badania MOG EAE; wykresy przedstawiają zmiany w IRL, wyniku EAE oraz gęstości RGC po immunizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Myszy C57BL/6J z MOG EAE wykazują łagodniejszy przebieg choroby po zastosowaniu substancji 1 w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. (A) Degeneracja wewnętrznych warstw siatkówki jest zredukowana (B), a kliniczny wynik EAE jest obniżony w trakcie przebiegu EAE po podaniu substancji 1. Myszy oceniano codziennie, a pomiary OCT wykonywano co miesiąc przez okres 120 dni. Wykresy przedstawiają średnią i błąd standardowy dla co najmniej dziesięciu zwierząt w grupie. (*p &lt; 0.05, ***p &lt; 0.001, powierzchnia pod krzywą porównana za pomocą testu ANOVA z post hoc testem Dunnetta). (C) Zmiana grubości IRL jest zgodna z utratą RGC (***p &lt; 0.001, za pomocą testu ANOVA z post hoc testem Dunnetta w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza częstotliwości przestrzennej; wykres efektów immunizacji; mysz w układzie eksperymentu behawioralnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Pomiar OKR u myszy C57BL/6J z MOG-EAE. (A) OKR wykazuje poprawę ostrości wzroku u zwierząt leczonych substancją 1 w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG EAE, zmierzoną za pomocą testu progu częstotliwości przestrzennej w okresie 120 dni. Wykresy przedstawiają średnią i błąd standardowy dla co najmniej sześciu zwierząt w grupie (**p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, pole pod krzywą porównano za pomocą ANOVA z testem post hoc Dunnetta). (B) Zdjęcie myszy C57BL/6J w komorze testowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurologii i okulistyki oraz pomóc w ocenie dużej różnorodności retinopatii i objawów siatkówkowych w różnych modelach gryzoni. Główną zaletą tych technik jest to, że można przeprowadzać nieinwazyjne badania podłużne, co zmniejsza zmienność i liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentów. Metody te umożliwiają ilościowe badanie struktury i funkcji in vivo, które można wykorzystać do badania stanów patologicznych lub do oceny potencjalnej użyteczności nowych środków terapeutycznych.Jednak szczególnie zastosowanie technologii optycznej koherentnej tomografii w modelach gryzoni jest nadal trudne, głównie ze względu na mały rozmiar oka. Procedury zademonstruje Michael Dietrich, doktorant z naszego laboratorium. Po znieczuleniu gryzonia nałóż jedną kroplę tropikamidu fenylefryny na każde oko w celu rozszerzenia źrenic.Po minucie zetrzyj nadmiar mokrej kropli do oczu. I smaruj oczy żelem okulistycznym na bazie metylocelulozy, aby uniknąć wysuszenia oka i zmętnienia rogówki. Następnie użyj kleszczyków, aby umieścić niestandardową soczewkę kontaktową na oku.Naciśnij przycisk Start w prawym rogu wyświetlacza panelu sterowania, aby uruchomić tryb akwizycji. Następnie, aby zobrazować lewe oko, ustaw uchwyt tak, aby żarówka lewego oka gryzonia była skierowana w stronę aparatu. Ustaw poziom filtra na R i wybierz BR i OCT dla obrazowania dna oka niebieskich odbić i akwizycji B-scan w oprogramowaniu.Następnie ustaw odległość ustawiania ostrości na około 38 dioptrii za pomocą pokrętła ostrości z tyłu aparatu. I powiększ siatkówkę, aż skan OCT będzie widoczny na ekranie. Następnie, aby zapewnić ścieżkę wiązki przez środek źrenicy, z ortogonalnym kątem siatkówki we wszystkich płaszczyznach, należy ustawić tarczę nerwu wzrokowego w środku oświetlanego pola.I dostosuj poziome i pionowe skany B linii do poziomu poziomego, obracając uchwyt. Na ekranie oprogramowania wybierz tryb skanowania woluminu i ustaw go na 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości przy 50 automatycznym śledzeniu w czasie rzeczywistym. Wyśrodkuj środek siatki skanowania woluminu na dysku optycznym i rozpocznij akwizycję, naciskając pokrętło czarnej czułości, a następnie Acquire na panelu sterowania.Po zakończeniu akwizycji ustaw poziom filtra na A.Wybierz opcję Niebieska autofluorescencja na panelu sterowania. I dostosuj jasność obrazu za pomocą pokrętła czułości. Naciśnij pokrętło czułości, a następnie Aprykcja, aby zobrazować komórki fluorescencyjne lub osady autofluorescencyjne.Do analizy skanów woluminów użyj automatycznej segmentacji oprogramowania urządzenia OCT, klikając skanowanie prawym przyciskiem myszy. I wybierz Segmentacja, a następnie Wszystkie warstwy. Wykonaj ręczną korektę warstw, klikając dwukrotnie żądany skan.Wybierz Profil grubości. I kliknij Edytuj segmentacje warstw. Zaznaczaj jedną warstwę na raz.W razie potrzeby popraw zieloną linię, przesuwając czerwone kropki, przeciągając i upuszczając we właściwe miejsce. Następnie wybierz zakładkę Mapa grubości. Wybierz siatkę ETDRS o średnicy 1, 2, 3 milimetrów.Wyśrodkuj wewnętrzny okrąg na tarczy nerwu wzrokowego. Na koniec oblicz grubość warstw siatkówki na podstawie wartości grubości dostarczonych przez oprogramowanie dla różnych sektorów siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Aby obliczyć główne wartości grubości ze skanów objętościowych, użyj całej 1, 2, 3 milimetrowej siatki ETDRS, która obejmuje kąt około 25 stopni, z wyłączeniem wewnętrznego okręgu o długości jednego milimetra, który zawiera tarczę nerwu wzrokowego.Zacznij od wybrania platformy do pomiaru gryzoni. Otwórz okno Ustawienia wstępne, klikając dwukrotnie oprogramowanie. Wybierz pozycję Nowa grupa i wybierz nazwę grupy, liczbę obiektów, gatunki i szczepy.Z menu rozwijanego wybierz bodziec zmienny, częstotliwość czasoprzestrzenną, czułość kontrastu, prędkość lub orientację i naciśnij Utwórz nową grupę. Ustaw ostrość na platformie, manipulując pierścieniem ostrości aparatu na górze komory. I skalibruj system, wyrównując czerwone kółko wokół czarnego koła na platformie.Następnie umieść gryzonia na platformie i pozwól mu przystosować się do środowiska przez około pięć minut. Następnie rozpocznij pomiar, wybierając strzałkę w lewo dla tak lub kwadrat dla nie, jeśli zwierzę odpowiednio śledzi lub nie śledzi. Ręcznie wybierz rozmiar kroku bodźca, klikając strzałki w górę i w dół obok bodźca zmiennego.Na koniec wybierz kartę Podsumowanie i kliknij Plik, Eksportuj tabelę lub Wykres, aby wyeksportować żądany zestaw danych. Wyniki wskazują, że zmniejsza się degeneracja wewnętrznych warstw siatkówki. Kliniczny wynik EAE jest osłabiany podczas kursu EAE, gdy podawano substancję 1.Co więcej, OKR ujawnia poprawę ostrości wzroku u zwierząt leczonych substancją 1 w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG EAE, mierzoną za pomocą testów progów częstotliwości przestrzennej przez okres 120 dni. Podczas wykonywania pomiarów OCT krytycznym krokiem jest ortogonalna orientacja wiązki laserowej we wszystkich płaszczyznach w stosunku do siatkówki, aby zapewnić jakość i powtarzalność wartości grubości. W przypadku techniki OKR rozróżnienie między śledzeniem a normalnymi ruchami behawioralnymi zwierzęcia wymaga pewnego przeszkolenia badacza.Ważne jest, aby być zaślepionym dla grupy eksperymentalnej. Po tych badaniach strukturalnych i funkcjonalnych uszkodzeń występujących w kontekście eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, procedura może być również pomocna w innych modelach obejmujących układ wzrokowy, w tym między innymi w modelach retinopatii lub uszkodzenia nerwu wzrokowego. Techniki te torują drogę do badań in vivo w dziedzinie neurologii i okulistyki i można je łatwo przenieść do badań klinicznych.

using-optical-coherence-tomography-optokinetic-response-as-structural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten manuskrypt opisuje protokół obrazowania in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii spektralnej o wysokiej rozdzielczości (SD-OCT). Koncentruje się na komórkach zwojowych siatkówki (RGC) w okolicy okołobrodawkowatej, z opisanymi kilkoma podejściami do skanowania i kwantyfikacji.

Optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy in vivo

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Aby zbadać wzrok myszy, przeprowadziliśmy nadciągający test. Myszy umieszczono na dużej kwadratowej arenie z monitorem na suficie. Zbliżający się bodziec wizualny konsekwentnie wywoływał u myszy reakcje zamrożenia lub ucieczki.

Wykorzystanie zbliżających się bodźców wzrokowych do oceny wzroku myszy

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Zwyrodnienie neuronów zarówno w oczach, jak i mózgu w wyniku cukrzycy można zaobserwować dzięki testom behawioralnym przeprowadzonym na gryzoniach. Labirynt Y, miara poznania przestrzennego, i odpowiedź optomotoryczna, miara funkcji wzrokowych, zapewniają wgląd w potencjalne diagnozy i leczenie.

Behawioralna ocena funkcji wzrokowych poprzez reakcję optomotoryczną i funkcję poznawczą za pomocą labiryntu Y u szczurów z cukrzycą

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Tutaj opisujemy technikę obrazowania in vivo wykorzystującą optyczną koherentną tomografię ułatwiającą diagnozę i ilościowy pomiar retinopatii u myszy.

Zastosowanie optycznej koherentnej tomografii do mysiego modelu retinopatii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Tutaj opisujemy standardowy protokół do ilościowego określania odruchu optokinetycznego. Łączy w sobie wirtualną stymulację bębna i wideookulografię, a tym samym umożliwia precyzyjną ocenę selektywności cech zachowania i jego plastyczności adaptacyjnej.

Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy

Poznaj nieinwazyjną ocenę struktury i funkcji siatkówki u myszy i szczurów za pomocą optycznej tomografii koherentnej oraz odpowiedzi optokinetycznej. Te metody umożliwiają długoterminowe badania retinopatii z mniejszą liczbą zwierząt.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Przeglądaj więcej filmów